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三磷酸鸟苷环化水解酶1和四氢生物蝶呤与神经性疼痛的研究进展

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中国医师进修杂志 2018年第9期41卷 844-847页

作者：李雪松苑龙孟纯阳济宁医学院临床医学院山东济宁272067 济宁医学院附属医院脊柱外科山东济宁272029

神经性疼痛是临床最常见的慢性疼痛之一,针对其治疗一直以来都是全球的难点,主要原因是其发病机制不明.三磷酸鸟苷环化水解酶1（GCH1）通过调节相关炎性因子介导神经性疼痛的发生,除此之外GCH1也是四氢生物蝶呤（BH4）合成过程中最主要... 详细信息

神经性疼痛是临床最常见的慢性疼痛之一,针对其治疗一直以来都是全球的难点,主要原因是其发病机制不明.三磷酸鸟苷环化水解酶1（GCH1）通过调节相关炎性因子介导神经性疼痛的发生,除此之外GCH1也是四氢生物蝶呤（BH4）合成过程中最主要的限速酶.BH4是各种炎性因子和神经递质合成必需的辅因子.在研究其与疼痛的关系时,发现当沉默GCH1基因后伴随疼痛缓解,BH4表达降低.结果提示GCH1和BH4与神经性疼痛有一定的关系.

关键词：三磷酸鸟苷环化水解酶1 四氢生物蝶呤神经性疼痛

过表达多巴胺脱羧酶、酪氨酸羟化酶和三磷酸鸟苷环化水解酶1重组慢病毒构建及其在帕金森病大鼠模型治疗作用的研究

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中国临床神经科学 2018年第2期26卷 133-144页

作者：赵慧慧史明超金庆文南京医科大学第一附属医院神经内科南京210029 南京医科大学附属逸夫医院神经内科南京211166

目的构建同时表达3种多巴胺(DA)合成相关酶的重组慢病毒(rLV),验证其在6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病(PD)大鼠模型中治疗作用,为PD临床基因治疗提供实验基础。方法构建过表达多巴胺脱羧酶(DDC)、酪氨酸羟化酶(TH)和三磷酸鸟苷环化水解酶... 详细信息

目的构建同时表达3种多巴胺(DA)合成相关酶的重组慢病毒(rLV),验证其在6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病(PD)大鼠模型中治疗作用,为PD临床基因治疗提供实验基础。方法构建过表达多巴胺脱羧酶(DDC)、酪氨酸羟化酶(TH)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)rLV及对照rLV。6-OHDA制备的PD模型大鼠,随机分为生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果 PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(P1);阳性病毒组呈现显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组比较,显著增高(P1)。结论成功构建过表达DDC+TH+GCH1-rLV,并且在PD模型大鼠中呈现显著的行为改善及DA水平增加,为PD的基因治疗提供实验基础。

关键词：帕金森病多巴胺脱羧酶酪氨酸羟化酶三磷酸鸟苷环化水解酶1 重组慢病毒基因治疗高效液相色谱-串联质谱联用法

带状疱疹病毒感染后神经痛与GCH1基因多态性的关联及危险因素与预测模型构建

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中华医院感染学杂志 2023年第23期33卷 3537-3541页

作者：李媛媛池丽俏王强钟文俊潘新锋复旦大学附属中山医院青浦分院皮肤科上海201700

目的分析带状疱疹病毒感染后神经痛与三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因多态性的关联及其发生的危险因素,并构建预测模型。方法将2021年1月-2022年12月复旦大学附属中山医院青浦分院收治的198例带状疱疹病毒感染患者纳入研究,其中带状疱... 详细信息

目的分析带状疱疹病毒感染后神经痛与三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因多态性的关联及其发生的危险因素,并构建预测模型。方法将2021年1月-2022年12月复旦大学附属中山医院青浦分院收治的198例带状疱疹病毒感染患者纳入研究,其中带状疱疹病毒感染后神经痛56例纳入研究组,未神经痛患者142例纳入对照组,回顾性收集研究对象临床资料。分析带状疱疹病毒感染后神经痛与GCH1基因多态性的关联,通过单因素及多因素分析带状疱疹病毒感染后神经痛的危险因素并构建预测模型,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析预测模型对带状疱疹病毒感染后神经痛的预测价值。结果研究组GCHI基因rs378641位点基因型分布TT比例更高,AT比例更低,等位基因T比例更高(P1位点基因型TT为带状疱疹病毒感染后神经痛的危险因素(P10.653+0.782×无糖皮质激素治疗+0.854×累及面积+0.524×HADS+0.759×GCHI基因rs378641基因型TT;将带状疱疹病毒感染后神经痛纳入阳性,无带状疱疹病毒感染后神经痛纳入阴性,绘制预测模型预测带状疱疹病毒感染后神经痛发生的ROC曲线,结果显示,当Logit(P)>13.56时,曲线下面积(AUC)为0.902,诊断敏感性85.71%、特异性为88.03%。结论带状疱疹病毒感染后神经痛与GCH1基因多态性密切相关,多种因素与带状疱疹病毒感染后神经痛有关,构建预测模型对带状疱疹病毒感染后神经痛具有良好的预测价值,可作为防控策略制定的依据。

关键词：带状疱疹病毒感染三磷酸鸟苷环化水解酶1 危险因素模型预测价值

汉族多巴敏感性肌张力障碍三个家系的分子遗传学研究(英文)

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中国临床康复 2004年第19期8卷 3896-3897页

作者：张社卿郑惠民谢惠君任大明林大宇解放军第二军医大学长海医院神经内科上海市200433 复旦大学遗传所上海市200433

背景:多巴敏感性肌张力障碍(dopa-responsivedystonia,DRD)的基本病因为遗传的缺陷,自1990年以来,中国有关本病的临床报道已有40余例,但相关的分子遗传研究报道较少。目的:分析国人DRD患者发病与三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH-1)基因突变... 详细信息

背景:多巴敏感性肌张力障碍(dopa-responsivedystonia,DRD)的基本病因为遗传的缺陷,自1990年以来,中国有关本病的临床报道已有40余例,但相关的分子遗传研究报道较少。目的:分析国人DRD患者发病与三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH-1)基因突变的关系。设计:典型调查。地点和对象:来自3个家庭的5例于2000-10/2001-07在解放军第二军医大学长海医院神经内科确诊的DRD患者及其亲属共12个成员。方法:经静脉采血2mL,常规提取基因组DNA,以PCR扩增GCH-1基因,反应产物用自动DNA测序仪直接测序。主要观察指标:三个家系中是否有基因突变。结果:在A家系,先证者母亲为正常个体,基因测序显示无基因突变,其中3例患病个体DNA测序发现第2个外显子142号碱基由鸟嘌呤转换为腺嘌呤(G→A),导致半胱氨酸被替换为酪氨酸;估计其突变基因来自已故父系一方。在B家庭,先证者第一个外显子71号碱基由胸腺嘧啶转换为胞嘧啶(T→C),导致亮氨酸被替换为脯氨酸;而其父母及弟均为正常个体。C家庭无GCH-1基因突变。结论:GCH-1基因突变只是部分DRD患者的发病原因。

关键词：汉族多巴敏感性肌张力障碍家系调查分子遗传学基因突变三磷酸鸟苷环化水解酶1

带状疱疹后神经痛危险因素及GCH1基因多态性

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中华医院感染学杂志 2021年第6期31卷 871-875页

作者：张丽君毕晓东徐全晓河南省南阳市第一人民医院皮肤科河南南阳473000 河南省南阳市第一人民医院肿瘤实验室河南南阳473000

目的探讨带状疱疹后神经痛(PHN)危险因素及三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因多态性。方法选择南阳市第一人民医院皮肤科2016年1月-2020年3月收治带状疱疹患者103例为研究对象,根据是否发生PHN分为PHN组(n=31)和非PHN组(n=72)。采用聚合... 详细信息

目的探讨带状疱疹后神经痛(PHN)危险因素及三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因多态性。方法选择南阳市第一人民医院皮肤科2016年1月-2020年3月收治带状疱疹患者103例为研究对象,根据是否发生PHN分为PHN组(n=31)和非PHN组(n=72)。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性对GCH1基因rs3783641位点多态性进行检测。结果单因素分析结果显示,PHN与应用激素史、初治时间、抑郁程度、焦虑程度存在关联(P<0.05),与年龄、皮损面积、性别、发病部位、治疗疗程无关;多元Logistic回归分析结果显示,无应用激素史、抑郁程度较高、焦虑程度较高是带状疱疹发生PHN的独立危险因素(P<0.05);PHN组患者与非PHN组患者GCH1基因rs3783641位点基因型分布总体差异具有统计学意义(Z=1.646,P=0.009);PHN组AT基因型频率低于非PHN组,TT基因型、T等位基因频率高于非PHN组,差异具有统计学意义(P<0.05);不同基因型AA、AT、TT视觉模拟评分(VAS)分别为(3.18±1.09)分、(4.12±1.34)分、(5.75±1.62)分,总体差异具有统计学意义(P<0.05)。结论PHN与应用激素史、初治时间、抑郁程度、焦虑程度存在关联,GCH1基因多态性与PHN发生及疼痛程度存在关联,可作为筛查指标。

关键词：带状疱疹带状疱疹后神经痛三磷酸鸟苷环化水解酶1 基因多态性视觉模拟评分

二甲双胍对波动性高糖诱导的内皮细胞功能障碍的逆转作用及其机制

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中华糖尿病杂志 2013年第4期5卷 231-234页

作者：安慧杰洪天配王产魏蕊刘烨杨进张琳北京大学第三医院内分泌科 100191

目的探讨二甲双胍对波动性高糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法以体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为研究对象，分为6组：正常葡萄糖对照组、高渗对照组、持续性高糖组、波动J生高糖组、波动性高糖＋二甲双胍组... 详细信息

目的探讨二甲双胍对波动性高糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法以体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为研究对象，分为6组：正常葡萄糖对照组、高渗对照组、持续性高糖组、波动J生高糖组、波动性高糖＋二甲双胍组以及波动性高糖＋二甲双胍＋化合物C组，各组均干预72h。以硝酸还原酶法检测细胞上清液亚硝酸盐浓度代表一氧化氮（NO）产生水平；流式细胞仪分析测定细胞内活性氧簇（ROS）水平；Westernblotting检测单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（Thr-172，p-AMPK）及三磷酸鸟苷环化水解酶1（GTPCH1）的蛋白表达水平。组间比较采用单因素方差分析和Q检验。结果（1）与正常葡萄糖对照组（100％）相比，波动性高糖组细胞内ROS水平增加[（222．4±62．0）％]，NO水平下降[（70．3±7．1）％]；添加二甲双胍后ROS水平降低[（100．2±17．4）％]，NO水平升高[（96．3±9．2）％]；添加AMPK抑制剂化合物c后ROS水平增加[（167．2±19．6）％]，NO水平降低[（83．3±8．7）％]。差异均有统计学意义（均P〈0．05）。（2）与正常葡萄糖对照组相比，波动性高糖组p-AMPK[（1．72±0．08）比（2．34±0．09）]和GTPCH1[（4．07±0．17）比（7．83±0．56）]表达水平降低；添加二甲双胍后p-AMPK（2．72±0．22）和GTPCH1（10．24±1．05）表达水平增高；添加化合物C后GTPCH1表达水平降低（2．39±0．34）。差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论二甲双胍可通过激活AMPK信号通路，上调GTPCH1表达，从而改善波动性高糖所致的内皮细胞功能障碍。

关键词：二甲双胍波动性高糖内皮细胞三磷酸鸟苷环化水解酶1

过表达DDC,TH和GCH1重组慢病毒构建及其在帕金森大鼠模型治疗作用的探究

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过表达DDC,TH和GCH1重组慢病毒构建及其在帕金森大鼠模型治疗作用...

作者：赵慧慧南京医科大学

学位级别：硕士

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上常见的神经系统退行性疾病,随着年龄增加,其发病率逐渐增高。PD主要病理改变是黑质致密部(substantia nigra pars compacta,Snc)内多巴胺(dopamine,DA)能神经元减少,从而导致Snc-纹状体通路... 详细信息

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上常见的神经系统退行性疾病,随着年龄增加,其发病率逐渐增高。PD主要病理改变是黑质致密部(substantia nigra pars compacta,Snc)内多巴胺(dopamine,DA)能神经元减少,从而导致Snc-纹状体通路中DA释放减少。PD病因和致病机制目前尚不清楚,其并非单一因素所致,而是年龄、环境、遗传等因素交互作用的结果。目前临床上无药物能够减缓阻止及逆转DA能神经元变性过程。无论是药物治疗,还是手术治疗,都不能根治PD,且会产生明显副作用。PD主要病变是Snc部DA能神经元丢失导致纹状体内DA水平下降,且PD患者脑中病变部位明确,因此PD成为神经系统病变中进行基因治疗热门病种。本文中,通过构建过表达多巴胺脱羧酶(dopamine decarboxylase,DDC)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)环化水解酶(GTP cyclihydrolase1,GCH1)的重组慢病毒(recombinant lentivirus,rLV),将DDC+TH+GCH1-rLV注射至6-羟基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制备的PD模型大鼠纹状体中,观察病毒在PD大鼠脑内的表达情况及大鼠的旋转行为学改变。采用携带产酶基因重组病毒载体,在动物模型中进行治疗,拟重建纹状体DA水平,以期待达到预期治疗效果。第一部分过表达DDC,TH和GCH1 rLV及对照rLV制备及鉴定目的构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV载体。方法PCR扩增各目的基因片段DDC、SV40 early promoter、TH、mPGK promoter、GCH1,使用BamHI-HF和XhoI对载体pMT174(pLV-RSV-CMV-WPRE)进行酶切,回收载体片段备用。进而在无缝反应液作用下,将各目的片段与回收后的线性化表达载体进行同源重组。利用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序,测序无误后进行质粒提抽。最后目的质粒与辅助质粒pCMV-dR8.9、pCMV-VSV-G共转染HEK293T细胞进行病毒包装,经纯化、浓缩后保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定。取出DDC+TH+GCH-rLV及对照rLV冰上融化,感染HEK293T细胞。72 h后,提取总蛋白,对DDC、TH、GCH1进行Western blot检测。结果PCR结果显示,在1429 bp、412 bp、1614 bp、551 bp、791 bp处可见特异性目的基因DDC,SV40 early promoter,TH,mPGK promoter,GCH1目的基因条带;使用BamHI-HF和XhoI对工具载体pMT174进行酶切,回收6508 bp载体片段;菌落PCR转化子鉴定结果显示,阳性克隆得到1436 bp片段;测序结果正确;与辅助质粒共转染HEK293T细胞,72小时后获得DDC+TH+GCH1-rLV和对照rLV颗粒,经过纯化浓缩后-80℃保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定,分别为5.56×10 v·g·mL、1.07×10 v·g·mL。Western blot结果可见,DDC+TH+GCH1-rLV感染组在3种DDC、TH和GCH1蛋白相对分子质量处可见特异性的蛋白分子表达条带。结论成功构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV,其浓度及所携带基因功能满足后续实验需要。第二部分过表达DDC,TH和GCH1 rLV在PD大鼠模型中的作用探究目的评价DDC+TH+GCH1-rLV对PD大鼠模型的治疗效果,检测目的基因是否正确表达。方法大鼠6-OHDA MFB两点法立体注射,构造单侧损毁PD模型。挑选完全损伤模型,其标准为旋转圈数每分钟>7圈,或30分钟>210圈。运用Snc部TH免疫荧光,检测PD大鼠DA能神经元损毁情况。24只PD大鼠模型分为随机分为三组:生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体三点注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果6-OHDA MFB两点法立体注射构建PD大鼠模型,符合PD大鼠旋转行为标准,挑选PD模型大鼠。PD大鼠Snc部TH免疫荧光结果显示:损毁侧DA能神经元大量丢失(P1),行为学观察及免疫荧光检测证明PD模型构建成功。PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(

关键词：帕金森病多巴胺脱羧酶酪氨酸羟化酶三磷酸鸟苷环化水解酶1 重组慢病毒基因治疗高效液相色谱-串联质谱联用法

大鼠SNI疼痛模型中GCH1的空间与时相研究

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大鼠SNI疼痛模型中GCH1的空间与时相研究

作者：李雪松济宁医学院

学位级别：硕士

目的:神经病理性疼痛是临床中最常见的疼痛之一,由于其发病机制不明,目前仍缺乏有效的治疗措施。GCH1可通过调节相关炎症因子引起免疫细胞活化介导神经性疼痛的发生。本实验使用SD(Sprague Dawley)大鼠建造SNI模型,通过使用蛋白定量、... 详细信息

目的:神经病理性疼痛是临床中最常见的疼痛之一,由于其发病机制不明,目前仍缺乏有效的治疗措施。GCH1可通过调节相关炎症因子引起免疫细胞活化介导神经性疼痛的发生。本实验使用SD(Sprague Dawley)大鼠建造SNI模型,通过使用蛋白定量、免疫荧光定位技术,检测和观察GCH1在大鼠模型体内时间与空间的表达。方法:首先建立大鼠SNI模型,选择健康雌性SD大鼠120只,随机分为正常组(24只)和SNI组(96只)。观察行为学改变,利用Von-Frey纤维丝和热痛刺激仪检测大鼠术前及术后3、7、14、21天的机械缩足反射阈值和足底热痛阈值。在检测完足底疼痛阈值后,麻醉大鼠分别取汇成坐骨神经相对应的脊神经节段,每组每个时间点取12只模型进行Western Blotting蛋白定量检测,其余用于免疫荧光定位。观察GCH1在SNI模型中动态变化和细胞表达情况。结果:1.机械缩足反射阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT):SNI模型组各时间点机械缩足反射阈值均明显低于正常组(P1)。SNI模型组组间比较,术后3天机械缩足反射阈值开始下降(P1),第7天最显著,后阈值恢复至21天后平稳,但仍比正常值低(P1)。2.热缩足反射阈值(Thermal withdrawal threshold,TWT):SNI模型组各时间点足底热痛阈值均明显低于正常组(P1天后平稳,但仍比正常值低(P1 Western Blotting蛋白定量检测:组间比较,SNI模型组GCH1水平均高于正常组(P1水平开始升高(P1水平开始降低至21天后平稳,但仍比正常值高(P1免疫荧光定位:正常组大鼠的脊髓中,GCH1主要表达在神经元中,小胶质细胞与星型胶质细胞中几乎检测不到;但在SNI疼痛模型组大鼠的脊髓中GCH1不但在神经元中表达,在小胶质细胞中表达也升高,与此同时,小胶质细胞的数量也随GCH1的水平变化而改变。结论:大鼠神经病理性疼痛的发生发展与体内GCH1水平密切相关。大鼠SNI模型建立后,可导致体内GCH1表达先升高后下降,总体水平升高趋势,相应造成一系列的行为改变。与此同时,GCH1的过表达也可引起小胶质细胞的活化增多。GCH1作为神经病理性疼痛发生过程的一个重要的标记性蛋白,在调控疼痛发生发展方面发挥了重要的作用。

关键词：三磷酸鸟苷环化水解酶1 小胶质细胞神经病理性疼痛

酪氨酸羟化酶基因新突变导致多巴反应性肌张力障碍家系分析

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中山大学学报（医学版） 2019年第4期40卷 598-603页

作者：段丽芬王惠萍孙莹王春霞王左华张霞沈茹昆明市儿童医院神经内科云南昆明650228 昆明市儿童医院检验科云南昆明650228

【目的】研究多巴反应性肌张力障碍(DRD)家系TH基因突变特点。【方法】提取先证者及其父母和两个姐姐外周血基因组DNA,使用高通量测序(NGS)的方法对已知肌张力及运动障碍相关的256个致病基因进行检测。【结果】家系中2例患者(先证者和... 详细信息

【目的】研究多巴反应性肌张力障碍(DRD)家系TH基因突变特点。【方法】提取先证者及其父母和两个姐姐外周血基因组DNA,使用高通量测序(NGS)的方法对已知肌张力及运动障碍相关的256个致病基因进行检测。【结果】家系中2例患者(先证者和其大姐)的酪氨酸羟化酶(TH)基因外显子14、9存在c.1481C>T(***494Met)、c.943G>A(***315Ser)复合杂合突变,父母分别携带一个杂合突变,其表型正常的二姐和50名正常对照者均未检测到该突变。【结论】TH基因c.1481C>T(***494Met)、c.943G>A(***315Ser)突变导致了该DRD家系的基因异常,并且发现了新的TH基因突变,扩展了DRD基因型与临床表型的关系谱,对DRD的早期精准诊断和治疗是改善预后的关键。

关键词：多巴反应性肌张力障碍酪氨酸羟化酶基因高通量测序三磷酸鸟苷环化水解酶1