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食品与发酵工业 2024年

作者：韦欢林苹鑫刘秀霞刘春立杨艳坤李业白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江南大学工业生物技术教育部重点实验室韩国科学技术院环境与分子微生物实验室韩国大田广域市

三乙酸内酯(triacetic acid lactone， TAL)是一种具有广泛应用前景的聚酮，可用作各种有机化合物的前体。为了提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中TAL的产量，该研究利用基因组重复序列整合的方法构建了S. cerevisiae多拷贝整... 详细信息

三乙酸内酯(triacetic acid lactone， TAL)是一种具有广泛应用前景的聚酮，可用作各种有机化合物的前体。为了提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中TAL的产量，该研究利用基因组重复序列整合的方法构建了S. cerevisiae多拷贝整合系统，应用该系统提高TAL的生产。首先以绿色荧光蛋白表征多拷贝Delta1整合，通过截短遗传霉素和潮霉素B两种抗生素基因的启动子以及增加抗生素浓度的方法增加筛选压力，进而提高整合效率和拷贝数，最优参数为将抗生素基因启动子截短至15 bp的同时采用160 μg/mL的抗生素。该优化系统随后用于新的多拷贝整合位点Delta2的表征。最后应用该系统合成TAL，通过HPLC分析TAL产量。结果表明，利用Delta1和Delta2序列表征绿色荧光蛋白的最高拷贝数分别为10和7，Delta1略优于Delta2。应用该系统在S. cerevisiae中合成TAL，Delta1和Delta2的产量分别为1.50、1.17 mmol/L，比单拷贝菌株产量分别提高460%和337%。该多拷贝系统有效提高了TAL的产量，为S. cerevisiae异源途径的表达提供了一种高效、模块化的多拷贝整合方法。

关键词：酿酒酵母多拷贝整合 delta整合三乙酸内酯启动子

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RANEY^(█) Ni催化三乙酸内酯氢转移反应的研究

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分子催化 2018年第3期32卷 205-210页

作者：赵泽伦高广孙鹏夏春谷李福伟中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室甘肃兰州730000 中国科学院大学北京100049

基于氢转移原理,以醇为氢源,将RANEY~? Ni催化剂用于三乙酸内脂(TAL)的加氢反应.通过筛选醇溶剂等条件,在氮气气氛中,以异丙醇为氢源,50℃下反应10 h可高选择性地制得89%的4-羟基-6-甲基四氢-2-吡喃酮.循环稳定性实验和氨基酸毒化实验证... 详细信息

基于氢转移原理,以醇为氢源,将RANEY~? Ni催化剂用于三乙酸内脂(TAL)的加氢反应.通过筛选醇溶剂等条件,在氮气气氛中,以异丙醇为氢源,50℃下反应10 h可高选择性地制得89%的4-羟基-6-甲基四氢-2-吡喃酮.循环稳定性实验和氨基酸毒化实验证实RANEY~? Ni催化剂在该反应中优异的稳定性.

关键词：生物质三乙酸内酯氢转移雷尼镍

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利用木质纤维素原料生产三乙酸内酯的解脂酵母工程菌的构建

利用木质纤维素原料生产三乙酸内酯的解脂酵母工程菌的构建

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作者：刘洋铭北京化工大学

学位级别：硕士

三乙酸内酯(TAL)作为一种重要的平台化合物,是联系生物转化与化学催化的“桥梁”,在食品、医药、材料以及燃料添加剂领域等具有广泛的应用。构建微生物细胞工厂合成TAL具有原料价格低、生产成本低、环境友好和副产品少等优势,被认为是... 详细信息

三乙酸内酯(TAL)作为一种重要的平台化合物,是联系生物转化与化学催化的“桥梁”,在食品、医药、材料以及燃料添加剂领域等具有广泛的应用。构建微生物细胞工厂合成TAL具有原料价格低、生产成本低、环境友好和副产品少等优势,被认为是替代化学合成和植物提取法的可行方法。解脂耶氏酵母体内具有大量的聚酮前体乙酰辅酶A,是生产三乙酸内酯的优势宿主。但其木糖利用效率低,限制了廉价木质纤维素原料在TAL合成中的综合利用。本课题通过构建一株能够稳定利用木糖高效生产TAL的解脂酵母整合菌株,为实现以廉价的木质纤维素为原料生产TAL奠定了基础,具体研究内容包括:1.高效代谢木糖产TAL的解脂酵母工程菌的构建与优化。将木糖代谢途径的三个基因(***1、***2、***3)和2-吡喃酮合成酶基因(gh2ps)整合到解脂酵母基因组上,整合菌能够利用通用YPX培养基生产TAL,产量达1.59 g/L。通过在整合菌体内以游离质粒形式增加拷贝数强化gh2ps表达,表明增加两个gh2ps拷贝数的效果最好;表达柠檬酸裂解酶ACL1和ACL2构建柠檬酸补回途径,表明过表达ACL1对TAL产量提升作用最明显;分别将两拷贝gh2ps和ACL1进行整合表达后,发现整合两拷贝gh2ps的Yali05-10#菌株产量最高,利用YPX培养基产TAL达1.75 g/L,产率提升26.8%。表明整合菌Yali05-10#可较好利用木糖合成TAL。2.整合菌Yali05-10#共利用葡萄糖与木糖产TAL的发酵过程优化及调控。为实现对木质纤维素水解液的利用,本研究以整合菌Yali05-10#为基础,探究了葡萄糖与木糖的共发酵过程,通过优化葡萄糖木糖的添加比例,确定了当葡萄糖与木糖比例为3:1时,TAL产量最高,达到2.32 g/L,结合浅蓝菌素的添加抑制脂肪酸的合成,TAL产量达到3.39 g/L。利用脂肪酸响应型启动子P构建了CRISPR-d Cas9系统,替代浅蓝菌素抑制脂肪酸合成酶的表达,TAL产量可达到2.69 g/L。3.整合菌Yali05-10#利用木质纤维素原料产TAL的发酵过程优化及调控。以上述研究为基础,本论文探究了外源添加浅蓝菌素后整合菌Yali05-10#利用木质纤维素水解液合成TAL的能力,以及利用启动子P构建了CRISPR-d Cas9系统的整合菌利用木质纤维素水解液合成TAL的效果。以整合菌Yali05-10#为基础,以未脱毒和脱毒的木质纤维素水解液为原料,外源添加浅蓝菌素,TAL产量均稳定超过3 g/L,表明整合菌Yali05-10#能够较好利用木质纤维素水解液合成TAL。以构建的CRISPR-d Cas9系统替代浅蓝菌素,以未脱毒和脱毒的木质纤维素水解液为原料,TAL产量分别为2.73 g/L和3.04 g/L。通过在整合菌Yali05-10#体内引入来自黑曲霉的木聚糖酶(xln D)和里氏木霉的木糖苷酶(xyn2)后,工程菌能够直接以木聚糖为底物合成TAL,产量达到0.74 g/L,为实现木质纤维素原料直接合成TAL的研究奠定了基础。

关键词：三乙酸内酯解脂耶氏酵母木质纤维素代谢调控

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代谢工程改造解脂耶氏酵母生产三乙酸内酯

代谢工程改造解脂耶氏酵母生产三乙酸内酯

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作者：黄晓斓北京化工大学

学位级别：硕士

三乙酸内酯作为一种小分子聚酮平台化合物,应用广泛。以乙酸为原料的化学合成法及植物提取法存在环境污染严重、石油资源依赖性强、生产周期长等诸多问题。以可再生生物质为原料,通过构建微生物细胞工厂生产三乙酸内酯成为解决上述问题... 详细信息

三乙酸内酯作为一种小分子聚酮平台化合物,应用广泛。以乙酸为原料的化学合成法及植物提取法存在环境污染严重、石油资源依赖性强、生产周期长等诸多问题。以可再生生物质为原料,通过构建微生物细胞工厂生产三乙酸内酯成为解决上述问题的新方法。解脂耶氏酵母胞内具有高通量的聚酮前体乙酰辅酶A代谢流,是工业化生产三乙酸内酯的优势底盘。木质纤维素来源的葡萄糖与木糖可作为微生物合成三乙酸内酯的廉价原料,但木糖的低效转化是目前尚待解决的关键问题。因此,本课题通过构建并优化木糖代谢途径,结合碳流及能量流调控,实现木糖向三乙酸内酯的高效转化,具体研究内容包括:（1）以解脂耶氏酵母为出发菌,通过表达2-吡喃酮合成酶,成功构建了三乙酸内酯合成途径,以葡萄糖为原料,TAL产量达到0.72 g/L。在此基础上,分别过表达内源及树干毕赤酵母来源的木糖代谢途径,提高了工程菌对木糖的利用效率,TAL产量可分别达到1.27g/L、1.60g/L。（2）2-吡喃酮合成酶的活性依赖于辅因子NADPH,本研究比较了解脂耶氏酵母工程菌利用葡萄糖及木糖合成三乙酸内酯过程中胞内NADPH含量,表明代谢木糖时胞内总还原力高于葡萄糖。进一步,分别过表达了mae、mndh1、mndh2、idp2、zwf1、gnd1、gnd2 等 7 种 NADPH 循环系统的关键基因,但TAL的产量提升不明显,表明木糖代谢产生的还原力可以满足TAL的合成。（3）为提高工程菌转化木糖的效率,课题进一步探究了碳氮比、pH及副产物等因素对三乙酸内酯合成的影响,确定了最优碳氮比为80:1,以0.2MPBS缓冲液调控pH,添加1.5 mg/L浅蓝菌素抑制副产物脂肪酸合成,TAL产量提高至4.99 g/L,较未优化时提高了 2.1倍。达到了目前报道摇瓶中的最高水平。本研究通过优化并调控木糖转化合成三乙酸内酯的代谢途径,成功构建了可高效利用木糖合成三乙酸内酯的解脂耶氏酵母工程菌,为实现木质纤维素原料转化合成聚酮化合物的研究奠定了基础。

关键词：三乙酸内酯解脂耶氏酵母木糖辅因子循环系统 pH调控

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毕赤酵母乙酰辅酶A合成途径的构建与优化

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作者：丰林娟浙江大学

学位级别：硕士

乙酰辅酶A是所有生物体中最重要的中心碳代谢物之一,而乙酰辅酶A供应不足是目前限制下游衍生产物高效合成的关键因素,为解决上述问题,本研究旨在以毕赤酵母为研究对象,在其胞质中构建和优化乙酰辅酶A合成途径,通过生长补偿和目标产物合... 详细信息

乙酰辅酶A是所有生物体中最重要的中心碳代谢物之一,而乙酰辅酶A供应不足是目前限制下游衍生产物高效合成的关键因素,为解决上述问题,本研究旨在以毕赤酵母为研究对象,在其胞质中构建和优化乙酰辅酶A合成途径,通过生长补偿和目标产物合成来评价乙酰辅酶A合成途径的功能效果。首先,对毕赤酵母染色体上6个特定位点(Int54,Int56,Int57,Int58,Int59,Int60)的整合效率和整合稳定性进行了鉴定。以红色荧光蛋白编码基因mCherry为报告基因,检测工程菌的荧光蛋白表达量,结果表明,位点Int56、Int57、Int59和Int60的整合效率分别达到83.33%、91.67%、100%和96.83%,这些位点表现出较高的整合效率和良好的整合稳定性,可作为外源乙酰辅酶A合成途径相关酶基因的插入位点。其次,在毕赤酵母中对磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶途径(PK)、柠檬酸裂解酶途径(ACL)、甲醛合成乙酰辅酶A途径(SACA)进行基于生长补偿试验的功能验证。通过敲除糖酵解途径中的6-磷酸果糖激酶(PFK1)或丙酮酸激酶(PYK1)阻断毕赤酵母中胞质乙酰辅酶A的合成,在缺陷菌株中引入PK途径,恢复了细胞生长,证明了 PK途径胞内功能的有效性;通过敲除催化乙酸合成乙酰辅酶A的乙酰辅酶A合酶(ACS1/ACS2)阻断胞质乙酰辅酶A的直接合成,引入ACL途径的工程菌在葡萄糖中恢复生长,而在乙醇中仍无法生长,证明了 ACL途径胞内功能的有效性;通过同时敲除丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙酰辅酶A水解酶(ACH1)、丙酮酸脱氢酶β亚基(PDB1)阻断胞质乙酰辅酶A通过甲醇同化的直接合成,引入PK途径的工程菌在甲醇中恢复了一定生长,而SACA途径则功能较弱或在胞内无法正常发挥功能。最后,以三乙酸内酯(TAL)为目标产物,对上述乙酰辅酶A合成途径进行进一步功能验证。在TAL工程菌中引入PK途径,并结合木糖同化途径进一步提高PK途径的前体供应,利用木糖高效合成乙酰辅酶A,相比对照,工程菌在SCX中的TAL产量达825.6 mg/L,相比未整合PK途径的菌株的TAL发酵产量提高了 1.6倍。PK途径结合甲醇代谢可进一步提高乙酰辅酶A的合成,工程菌在SCM中发酵产量达到57.1 mg/L,相比未整合PK途径的菌株的TAL发酵产量提高了 2.8倍。研究表明,结合PK途径和木糖利用途径的策略、结合PK途径和甲醇同化途径的策略、结合ACL途径和葡萄糖途径的策略可提高不同碳源的利用过程中胞内乙酰辅酶A的总体合成水平。本研究通过基于生长补偿的和基于TAL合成的乙酰辅酶A合成途径的功能验证,证明了 PK途径、ACL途径和SACA途径对于利用不同碳源提高胞质乙酰辅酶A的总体合成水平的有效性,有望通过上述途径的组合构建毕赤酵母乙酰辅酶A合成平台菌株,为乙酰辅酶A衍生产物的高效合成提供技术基础。

关键词：乙酰辅酶A 毕赤酵母三乙酸内酯合成生物学

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