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中草药 2022年第24期53卷 7864-7870页

作者：柳勤海杨馨李晓静兰平秀李凡谭冠林云南农业大学植物保护学院云南昆明650201 云南农业大学现代教育技术中心云南昆明650201

目的建立一种高效、快速、准确地同步检测侵染三七Panax notoginseng的2种病毒——三七y病毒(Panax notoginseng virus y,Pn Vy)和中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TyLCCNV)的双重PCR技术。方法分别以单一... 详细信息

目的建立一种高效、快速、准确地同步检测侵染三七Panax notoginseng的2种病毒——三七y病毒(Panax notoginseng virus y,Pn Vy)和中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TyLCCNV)的双重PCR技术。方法分别以单一感染Pn Vy或TyLCCNV及复合侵染了这2种病毒的染病三七植株为样品,CTAB法提取叶片总核酸作为模板,根据Gen Bank上已登录的Pn Vy和TyLCCNV这2种病毒核酸序列设计特异性检测引物。通过单一PCR技术明确染病三七样品Pn Vy和TyLCCNV的发生情况,筛选出可用于一步法双重PCR检测Pn Vy和TyLCCNV的引物组合及引物浓度,并对反应条件进行优化。对扩增产物进行克隆测序,验证一步法双重PCR检测的准确性和特异性。结果建立的一步法双重PCR检测技术能同步有效地检测三七病样中的Pn Vy和TyLCCNV,检测灵敏度高,最低检测限点为核酸原液的0.01稀释倍数,特异性强。结论所建立的一步法双重PCR检测技术可以高效、快速、准确、特异地同步检测三七样品中的Pn Vy、TyLCCNV 2种病毒。

关键词：三七病毒检测三七y病毒中国番茄黄化曲叶病毒双重PCR技术

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三七y病毒部分ci基因和cp基因的克隆及序列分析

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云南农业大学学报（自然科学版） 2016年第1期31卷 35-42页

作者：李梅蓉李晓静包改丽朱静杨馨谭冠林兰平秀李凡云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室云南昆明650201 云南农业大学教务处现代教育技术中心云南昆明650201 云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201

对云南文山地区三七上获得的三七y病毒（Panax virus y,PnVy）不同分离物进行了部分ci基因和cp基因的克隆及序列分析,获得的部分ci基因长657 nt,编码219个氨基酸;获得的部分cp基因长834 nt,编码278个氨基酸。所获得的11个PnVy分离物的c... 详细信息

对云南文山地区三七上获得的三七y病毒（Panax virus y,PnVy）不同分离物进行了部分ci基因和cp基因的克隆及序列分析,获得的部分ci基因长657 nt,编码219个氨基酸;获得的部分cp基因长834 nt,编码278个氨基酸。所获得的11个PnVy分离物的ci基因之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为80.8%～99.8%和91.3%～100%,与其他PnVy分离物的同源性分别为80.8%～98.8%和92.7%～99.5%。所获得的18个PnVy分离物的cp基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.8%～99.9%和93.9%～100%,与其他PnVy分离物的同源性分别为92.0%～100%和95.7%～100%。系统进化树分析表明,基于ci基因可以将PnVy分为2个大组,第Ⅱ组分离物之间的差异相比第Ⅰ组的复杂;基于cp基因可以将PnVy分为3个大组,第Ⅲ组分离物之间差异最大。基于ci基因和cp基因的分析结果均表明,PnVy不同种群间存在较为丰富的遗传多样性,但尚不清楚PnVy的分子变异是否与PnVy引起的多种症状类型有关。

关键词：三七y病毒 ci基因 cp基因序列分析分子变异

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4种提取试剂对三七y病毒RNA提取效果的比较

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云南农业大学学报（自然科学版） 2014年第6期29卷 822-827页

作者：李晓静刘芳李梅蓉李月月张水英李凡云南农业大学植物保护学院云南昆明650201 云南农业大学农学与生物技术学院云南昆明650201

为比较不同核酸提取试剂对三七y病毒(Panax virus y,Pn Vy)RNA提取效果的差异,本文以感染病毒病的三七叶片为研究对象,选取了3种商业化的RNA提取试剂盒和优化的CTAB总核酸提取法对提取Pn Vy RNA的质量、操作时间、使用成本、RT-PCR扩增... 详细信息

为比较不同核酸提取试剂对三七y病毒(Panax virus y,Pn Vy)RNA提取效果的差异,本文以感染病毒病的三七叶片为研究对象,选取了3种商业化的RNA提取试剂盒和优化的CTAB总核酸提取法对提取Pn Vy RNA的质量、操作时间、使用成本、RT-PCR扩增效率及DNA去除效果等方面进行了比较。结果表明:北京全式金生物技术有限公司的Trans Zol Plant试剂提取的总RNA质量最高,RT-PCR扩增效率较高,DNA去除完全,但成本也最高;宝生物工程(大连)有限公司的RNAiso Plus Total RNA试剂提取的总RNA质量、RT-PCR扩增效率和使用成本居中,无DNA残留;北京百泰克生物技术有限公司的TRIpure试剂提取的总RNA质量、RT-PCR扩增效率最低,成本居中,也无DNA残留,但耗时最短;而CTAB法提取的总核酸质量居中,RT-PCR扩增效率最高,成本最低,能同时提取到RNA及DNA,但耗时最长。对于复合感染DNA和RNA两种核酸类型病毒的样品来讲,CTAB法为最佳选择;对仅由RNA病毒侵染的材料而言,综合考虑后,Ta KaRa的RNAiso Plus Total RNA提取试剂是较为理想的选择。

关键词：核酸提取试剂三七y病毒提取效率 CTAB法

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三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析

三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析

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作者：李晓静云南农业大学

学位级别：硕士

三七是我国中药材中的一颗明珠，具有非常重要的药用和医疗保健价值。但因其特殊的生长、管理条件，很容易造成病毒病的发生，该病害的发生严重影响三七的生活力，降低三七的产量和质量，对生产构成严重的威胁。但到目前为止，有关三七... 详细信息

三七是我国中药材中的一颗明珠，具有非常重要的药用和医疗保健价值。但因其特殊的生长、管理条件，很容易造成病毒病的发生，该病害的发生严重影响三七的生活力，降低三七的产量和质量，对生产构成严重的威胁。但到目前为止，有关三七病毒病的研究很少，而且现有的研究也仅仅停留在三七病毒病原物的鉴定层面上。植物病毒病被称作是“植物的癌症”，防治植物病毒病最重要的工作首先就是要明确病毒病原物，然后才能通过分析各个病原物的传播方式、寄主范围及发生规律等方面防控病毒病的发生。鉴于此，本文旨在通过对三七病毒病病原物开展进一步的鉴定研究，探明三七病毒中除三七y病毒(Panax virus y，PnVy)外的其他种类及优势种，明确其寄主范围，确定病毒分离物/复合体与症状类型的相关性，为进一步深入开展相关病毒的致病性分子机理、病害的监测和预报以及有效防控提供坚实的理论基础和技术指导，并对国内外该领域的相关研究工作起到一定的借鉴和推动作用。本文以三七病叶为材料提取dsRNA及提纯病毒，并尝试以dsRNA为模板构建cDNA文库得到可能的病毒种类，以三七病毒提纯产物为材料通过电镜技术和SDS-PAGE、质谱分析技术分别进行病毒粒子形态观察及可能的病毒种类初步鉴定。结果经dsRNA、提纯病毒及电镜技术等再次验证三七病样除了PnVy之外还存在不止一种病毒病原物。而由于提取的dsRNA浓度过低，致使没能成功完成对cDNA文库的构建。质谱分析的结果显示三七病样中可能存在大豆矮缩病毒(Soybean dwarf virus，SbDV)，但经SbDV特异性引物检测及序列分析，并未在该批三七病样中检测到SbDV。应用双生病毒(geminiviruses)的基因组DNA及卫星(betasatellite)的DNA检测通用引物和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，TyLCCNV)的特异性引物，在三七病样yWSh03中检测到了的TyLCCNV和TyLCCNB，并获得了TyLCCNV和TyLCCNB的全长基因组序列。然后将含有TyLCCNV及TyLCCNB侵染性克隆的农杆菌菌悬液、菌落接种至三七叶片上，并且通过获毒的粉虱对三七进行传毒试验。结果农杆菌接种的三七苗都表现为黄化症状，而粉虱传毒的三七苗症状不明显，但通过PCR检测均能检测到TyLCCNV和TyLCCB。通过分子生物学和生物学的方法证实了TyLCCNV及TyLCCNB对三七的侵染，完成了柯赫氏法则的验证，这是TyLCCNV及TyLCCNB侵染人参属植物的首次报道。以三七病叶、dsRNA和病毒提纯产物为接种材料，将其摩擦接种于供试植株中，接种一月之久，大部分寄主表现出褪绿黄化的症状，但经RT-PCR检测后，PnVy的寄主只有有茄科的黄烟、辣椒和豆科的豇豆。对文山、红河、昆明、曲靖等地的三七种植园进行了病害调查和相关病毒的检测。发现三七病毒病的症状类型多样，发病率逐年增加，且田间表现复合症状的居多。初步建立了PnVy和TyLCCNV的双重PCR检测体系，该体系能够快速及时准确的对三七田间这两种病毒的发生开展检测及分析。运用双重PCR检测体系对不同地区三七病样的PnVy和TyLCCNV的带毒率进行检测，发现由两种病毒复合侵染的现象较多，复合侵染率在38.7%0.0%之间，且从整体来讲，PnVy对三七的侵染率最高。获得了5个PnVy分离物的全基因组序列、6个TyLCCNV分离物基因组全序列及4个TyLCCNB的基因组全序列，并对其进行基因组结构分析及系统进化分析，推测三七病毒病复杂多样的症状类型可能与TyLCCNV及TyLCCNB无太大相关性，但可能与PnVy的基因组结构相关，尤其是PnVy的P1蛋白可能与三七症状多样性相关。

关键词：三七三七y病毒中国番茄黄化曲叶病毒中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNAβ 基因组结构

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三七病毒病病原的初步鉴定

三七病毒病病原的初步鉴定

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中国植物病理学会2012年学术年会

作者：包改丽朱静王海宁谭冠林陈海如李凡云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室云南农业大学现代教育技术中心

三七（Panax notoginseng（Burk）***）具有较高的药用价值,是许多名贵中成药的主要成分。由于其特殊的生长习性,主要集中在云南文山州境内种植。近年来,随着三七的规模化种植,病毒病大面积发生,严重影响了三七的产量和品质,成为制约文... 详细信息

三七（Panax notoginseng（Burk）***）具有较高的药用价值,是许多名贵中成药的主要成分。由于其特殊的生长习性,主要集中在云南文山州境内种植。近年来,随着三七的规模化种植,病毒病大面积发生,严重影响了三七的产量和品质,成为制约文山这一支柱产业发展的一个重要因素。本研究对文山州境内的文山、马关、砚山和邱北等三七主产区病毒病的发生情况进行了调查,并通过生物学、形态学、分子生物学等方法对引起三七病毒病的病原进行了初鉴定。调查结果显示,目前病毒病在文山、马关、砚山和邱北等4个县已普遍发生,部分园区的发病率高达80%,2011年三七病毒病的平均发病率达10%。病毒病在三七苗期和成株期均有不同程度的发生,苗期发病较轻,但随着七龄的增加,病毒病的发生变得越来越重。三七病毒病的症状类型有多种,主要有叶片皱缩、斑驳、花叶、黄化、卷曲、坏死、叶缘缺刻等类型。从部分染病三七中观察到了三类线状病毒粒子,一类病毒粒体长度在400～600nm,另一类病毒粒体长度在700～900nm,还有一类是长线状病毒粒体,长度在1 000～2 000nm。从提纯病毒的SDS-PAGE电泳检测到了两条蛋白条带,一条在32kDa左右,同三七y病毒（Panax virus y,PnVy）的外壳蛋白大小相符,另外一条带在55kDa左右,同长线形病毒科成员的外壳蛋白类似物大小相近。利用potyviruses、tospoviruses和geminiviruses病毒通用引物对三七病样进行了分子生物学检测,从大部分染病三七中检测到potyviruses。对所得片段进行克隆、测序,得到了PnVy的ci基因以及cp基因的部分序列。所获得的PnVy不同分离物ci基因部分核苷酸序列的一致性为80.8%～99.9%,氨基酸序列的一致性为91.3%～100%;所获得的PnVy不同分离物cp基因部分核苷酸序列的一致性在91.9%～98.9%,氨基酸序列的一致性为95%～99.3%,表明不同PnVy分离物间存在明显的分子变异。研究结果显示,目前文山三七病毒病的主要病原为PnVy,可能还存在长线形病毒科的部分成员。

关键词：三七病毒病病原鉴定三七y病毒长线形病毒科病毒

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