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月季(Rosa chinensis)丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及其表达分析

园艺学报 2012年第7期39卷 1387-1394页

作者：王海萍晏慧君张颢蹇洪英王其刚邱显钦李淑斌周宁宁唐开学华中农业大学园艺林学学院武汉430070 云南省农业科学院花卉研究所云南省花卉育种重点实验室昆明650205

根据GenBank发表的丁香酚合成酶(EGS)基因的蛋白保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR技术,从古老月季(Rosa chinensis)品种‘月月粉’盛开期的花瓣中获得了1个新的丁香酚合成酶基因RcEGS1,GenBank登录号为JQ522949。该基因全长为11... 详细信息

根据GenBank发表的丁香酚合成酶(EGS)基因的蛋白保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR技术,从古老月季(Rosa chinensis)品种‘月月粉’盛开期的花瓣中获得了1个新的丁香酚合成酶基因RcEGS1,GenBank登录号为JQ522949。该基因全长为1171bp,开放阅读框(ORF)951bp,编码317个氨基酸;蛋白质理论分子量为35.64kD,等电点为7.36。氨基酸同源性分析表明,RcEGS1与矮牵牛PhIGS1的氨基酸同源性达到70%,与罗勒ObEGS1的同源性为59%,与月季RhEGS1的同源性仅为48.2%。运用实时荧光定量PCR法分析RcEGS1在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达,发现其在叶片和茎段中没有表达,在花瓣和萼片中有表达,在盛开期的花瓣中表达量最高。

关键词：月季花香丁香酚合成酶基因实时定量PCR

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北细辛丁香酚合成酶基因克隆及其表达分析

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西北植物学报 2021年第3期41卷 368-376页

作者：梁岩岩王亚男张银萍王鹰李强吴秀菊东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

丁香酚合成酶(eugenol synthase,EGS)是北细辛(Asarum heterotropoides)主要活性成分甲基丁香酚体内合成途径中的关键酶之一。该研究根据北细辛转录组数据库中筛选到的序列设计特异引物,以RT-PCR法扩增获得北细辛丁香酚合成酶基因(AhEGS... 详细信息

丁香酚合成酶(eugenol synthase,EGS)是北细辛(Asarum heterotropoides)主要活性成分甲基丁香酚体内合成途径中的关键酶之一。该研究根据北细辛转录组数据库中筛选到的序列设计特异引物,以RT-PCR法扩增获得北细辛丁香酚合成酶基因(AhEGS)的开放阅读框(ORF)序列,进行了相应的生物信息学分析。同时运用实时定量PCR法分析AhEGS在不同发育时期(幼叶期、花期、果期)和不同组织部位(叶、根茎、根)中的表达谱,并进行原核表达分析。结果显示:(1)AhEGS基因ORF序列长为951 bp,编码316个氨基酸,理论分子量为34.93 kD,等电点为6.19,AhEGS蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽序列;同源序列比对发现,北细辛AhEGS与月季RcEGS(AFQ98278.1)同源性最高。(2)实时定量PCR分析表明,AhEGS基因在北细辛幼叶期的根中表达量最高。(3)成功构建了原核表达载体pET28a-AhEGS-BL21,经pET28a-AhEGS重组子转化*** BL21(DE3),SDS-PAGE检测显示在大肠杆菌(Escherichia coli,***)中诱导产生了35 kD左右的特异性蛋白,与理论分子量一致;最佳诱导条件为16℃、14 h,IPTG浓度为0.2 mmol/L。该研究首次克隆了北细辛的EGS基因,构建了原核表达载体,筛选出该蛋白最佳诱导条件,研究结果为北细辛甲基丁香酚代谢工程的应用奠定基础。

关键词：北细辛丁香酚合成酶基因序列分析原核表达诱导条件

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月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

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中国农业科学 2012年第3期45卷 590-597页

作者：晏慧君张颢蹇洪英王其刚邱显钦张婷唐开学云南省农业科学院花卉研究所/云南省花卉育种重点实验室

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物... 详细信息

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达,且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol.L-1IPTG诱导4 h后,携带RhEGS1 ORF的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。

关键词：月季丁香酚合成酶基因 RT-PCR Gateway克隆原核表达

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月月粉丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及分析

月月粉丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及分析

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作者：王海萍华中农业大学

学位级别：硕士

丁香酚(Eugenol)是月月粉(Rosa chinensis’Pallida’)重要的花香成分之一,具有浓郁的丁香气味。前人研究表明,丁香酚是以乙酸松柏酯(Coniferyl acetate)为底物,由丁香酚合成酶催化形成的。克隆分析月季丁香酚合成酶基因,不仅有利于明... 详细信息

丁香酚(Eugenol)是月月粉(Rosa chinensis’Pallida’)重要的花香成分之一,具有浓郁的丁香气味。前人研究表明,丁香酚是以乙酸松柏酯(Coniferyl acetate)为底物,由丁香酚合成酶催化形成的。克隆分析月季丁香酚合成酶基因,不仅有利于明确丁香酚合成酶基因在花香调控中的作用,而且为利用转基因技术培育具有香味的月季品种提供候选基因。本文以古老月季品种月月粉为材料,利用RT-PCR结合RACE-PCR技术,克隆了月月粉RcEGS1基因,并运用实时荧光定量PCR法进行了该基因在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达分析。将RcEGS1基因的完整编码框通过酶切、连接转到植物表达载体pBIA31中,构建了植物表达载体pBIA31-RcEGSl,采用农杆菌介导的叶盘法成功转化矮牵牛。本研究结果为进一步对RcEGSl进行功能验证和深入探讨月季苯基丙烯类物质代谢路径奠定基础。具体研究结果如下： 1.利用GenBank发表的丁香酚合成酶基因的氨基酸保守序列设计引物,用同源克隆法和RACE-PCR技术,从中国古老月季月月粉盛开期的花瓣中获得了一个新的月季丁香酚合成酶基因,命名为RcEGS1, GenBank登录号为JQ522949。该基因全长为1171bp,开放阅读框(ORF)951bp,编码317个氨基酸,具有EGS基因的保守结构域KQVDVVIS和KⅡAAIK;其蛋白质理论分子量为35.64kD,等电点为7.36。氨基酸同源序列比较发现,月季RcEGS1与矮牵牛PhIGS1的氨基酸保守区同源性最高,具有70%同源性,与罗勒ObEGS1同源性达59%,与月季RhEGS1的同源性为48%。 2.运用实时荧光定量PCR法对月月粉6个不同发育时期的花朵和4个不同组织部位进行分析,发现RcEGS1基因在花瓣、萼片中有表达,在叶片、茎段中没有表达,以花瓣中的表达量为最高,且在花蕾期没有表达,在盛开期的表达量最高,凋谢期表达量较低。即该基因的表达和月季花香物质释放量呈现一致的规律。 3.用Smal、SaiI双酶切质粒pMD18-RcEGSl和表达载体pBIA31,将回收的全长基因片段和pBIA31大片段,用T4DNA连接酶连接,转化感受态细胞Trans5α对重组子菌液进行PCR扩增和双酶切鉴定,电泳获得预期约1000bp的条带,说明已成功构建了植物表达载体pBIA31-RcEGSl。 4.将构建好的重组质粒转化根瘤农杆菌LBA4404感受态细胞,采用叶盘法转化无菌矮牵牛的幼嫩叶片。经过共培养和抗性筛选,提取再生植株的叶中DNA,进行PCR检测,初步证实得到7个阳性再生植株。

关键词：月月粉花香丁香酚合成酶基因实时定量PCR 表达载体构建转化

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月季‘月月粉’丁香酚合成酶基因（RcEGS）功能初步验证

月季‘月月粉’丁香酚合成酶基因（RcEGS）功能初步验证

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作者：杨俊凯华中农业大学

学位级别：硕士

随着生活质量的不断提高,人们对观赏植物品质的要求也越来越高,不仅仅要有丰富的花色,还希望有怡人的香味。传统的育种技术在花香改善方面作用非常有限,为了能突破这一瓶颈,进一步提高花卉品质,大量花香基因被研究人员克隆出来,其相应... 详细信息

随着生活质量的不断提高,人们对观赏植物品质的要求也越来越高,不仅仅要有丰富的花色,还希望有怡人的香味。传统的育种技术在花香改善方面作用非常有限,为了能突破这一瓶颈,进一步提高花卉品质,大量花香基因被研究人员克隆出来,其相应的遗传转化体系的建立就显得尤为重要。课题组前期已成功从月季‘月月粉’中克隆得到丁香酚合成酶(RcEGS)基因,本试验通过以月季‘月月粉’胚性愈伤和矮牵牛(Petunia hybrida)叶盘为受体,对丁香酚合成酶基因进行遗传转化,进而进行目的基因RcEGS转化的鉴定和表达分析,初步验证此基因的功能,研究结果如下： (1)月季‘月月粉’腋芽在低浓度6-BA lmg/L下萌发效果更好,萌发的丛生苗在1/2MS+NAA0.05mg/L生根培养基上的生根效果佳,叶片量多、自然舒展,‘月月粉’丛生苗在增殖培养基上能大量增殖,但叶片卷缩,不利于后期利用;(2)愈伤的诱导多发生在叶柄处,不同梯度浓度的2,4-D对‘月月粉’愈伤诱导的试验发现,当2,4-D3mg/L、碳源为葡萄糖时,‘月月粉’的愈伤诱导率最高,达到90.33%,愈伤状态最佳,添加AgNO310mg/L能进一步提高‘月月粉’的愈伤诱导率,达到95.00%;(3)试验发现TDZ浓度(?)5mg/L无法通过愈伤途径获得月季‘月月粉’不定芽,月季‘月月粉’愈伤在原愈伤诱导培养基上可以产生不定芽,但再生率只有0.21%： (4)含有GUS基因的农杆菌(OD600值=0.5)侵染‘月月粉’愈伤10min, GUS染色发现‘月月粉’愈伤瞬时表达率达到93.3%;(5)用带有RcEGS基因的农杆菌EHA105(OD600值=0.5)侵染月季‘月月粉’胚性愈伤15min,三个月连续培养成功获得月季‘月月粉’小苗;(6)矮牵牛含有丁香酚(EGS)合成的底物松柏酯,常被作为花香研究的模式植物。利用“叶盘法”获得转基因矮牵牛小芽,通过抗生素筛选和分子水平筛选获得阳性植株,统计发现矮牵牛转化成功率是55%;(7)组培矮牵牛成功驯化一段时间后,观察发现转基因植株长势比野生植株弱,通过RT-PCR表达分析发现不同株系的阳性植株目的基因RcEGS的表达量存在差异。以野生矮牵牛花香成分为对照,对矮牵牛花香物质进行GC-MS花香成分分析,结果发现野生矮牵牛无甲基丁香酚成分,转基因植株含有的甲基丁香酚,占主要花香成分的0.47%,由此可知RcEGS基因参与了甲基丁香酚的生物合成。

关键词：月季‘月月粉’ 丁香酚合成酶基因体细胞胚矮牵牛遗传转化

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