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常见犬病毒即时检测新方法的研究

常见犬病毒即时检测新方法的研究

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作者：徐虎浙江大学

学位级别：硕士

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)及犬冠状病毒(Caninecoronavirus,CCoV)是常见的犬类病毒,在犬类中传播广泛并造成循环感染。犬病毒的现有检测方法主要包括分离培养鉴定、血清学诊断、核酸检测、免疫检测等。这些检测方法存在着步骤繁琐、耗时长、成本高昂、需在专业实验室完成等局限性。亟需建立一种便捷、快速、灵敏且特异性强的方法应对日益增长的犬类病毒临床检测需求。针对犬病毒的常见临床样品类型,在本课题中通过表征不同表面活性剂相对于磁珠法的裂解效率及其对重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)的影响建立了一种基于表面活性剂的样品处理方法,使用0.01%SDS及3%Tween-80在10 min内可完成样品处理并且无需额外步骤即可进行后续等温核酸扩增反应。该方法克服了传统化学裂解法步骤繁琐以及物理裂解法裂解效率低的缺点,具有无需精密温控仪器、环境友好、操作便捷、耗时较短的优点,对粪便、唾液、咽拭子及血清样品表现出良好的裂解效果。利用上述基于表面活性剂的样品处理方法,本课题基于重组酶聚合酶技术,联用侧流层析试纸条(Lateralflow strip,LF)构建了针对五种犬病毒的核酸检测新平台即重组酶聚合酶扩增-侧流试纸条(RPA-LF),用于检测CPV VP2基因、CAVE1基因、CDVH基因、CCoVN基因及CPIVN基因,灵敏度分别达到10 copies/μL、10 copies/μL、100 copies/μL、100 copies/μL及 10 copies/μL,对 CPV实际样品具有良好的检测效果,具备良好的实际应用潜力。此外针对RPA-LF方法中容易受到环境中气溶胶污染及开盖液体转移操作使检测过程更加复杂的问题设计并开发了一种针筒式微流控核酸检测装置,将RPA反应、稀释以及试纸条检测集成在同一装置内完成。该装置检测的灵敏度及特异性与RPA-LF方法相当,无需精密仪器及专业操作即可完成,整个检测流程可以控制在30 min内,通过裸眼即可对检测结果进行观察。该方法简化了检测流程,具有POCT应用及产业化的潜力。本研究构建了一种常见犬病毒的即时检测新方式,对于保护人类和动物健康、防止疾病传播具有重要意义。

关键词：犬病毒核酸样品处理方法即时检测一体化检测装置

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