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φc31整合酶与转基因动物研制

中国生物工程杂志 2009年第2期29卷 103-107页

作者：曲立娟黄英上海交通大学医学遗传研究所上海200040

链霉菌噬菌体φc31整合酶是一种位点性特异重组酶。它以单向整合方式进行重组,无须其他辅助因子,且整合效率高、表达稳定,所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合,并被应用于哺乳动物的转基因整合技术中,它为... 详细信息

链霉菌噬菌体φc31整合酶是一种位点性特异重组酶。它以单向整合方式进行重组,无须其他辅助因子,且整合效率高、表达稳定,所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合,并被应用于哺乳动物的转基因整合技术中,它为攻克转基因动物研制过程中的随机整合、整合效率低、表达水平不高等技术瓶颈提供了新思路。对链霉菌噬菌体φc31整合酶的作用机制和特点优势作了简要的阐述,并对其广阔的应用前景作一展望。

关键词： φc31整合酶转基因动物位点特异整合

基于φc31整合酶的高等真核生物基因组操作技术研究进展(英文)

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蚕业科学 2011年第3期37卷 507-519页

作者：许龙霞赵爱春龙定沛谭兵向仲怀西南大学生物技术学院重庆400716 西南大学蚕学与系统生物学研究所重庆400716

位点特异性重组系统已经成为基因组操作的强有力工具。来自链霉菌噬菌体φc31的整合酶是丝氨酸重组酶家族的一员,可催化2个不同的识别位点attB和attP间发生有效的单向性重组。总结了φc31整合酶可能的重组机制以及在人类细胞、小鼠胚胎... 详细信息

位点特异性重组系统已经成为基因组操作的强有力工具。来自链霉菌噬菌体φc31的整合酶是丝氨酸重组酶家族的一员,可催化2个不同的识别位点attB和attP间发生有效的单向性重组。总结了φc31整合酶可能的重组机制以及在人类细胞、小鼠胚胎干细胞、果蝇和植物等真核生物基因组操作上的应用,并对该系统的优点和存在问题进行了分析。φc31整合酶系统有望成为高等生物基因功能分析、转基因标记删除、生物合成等研究领域最强有力的手段之一,为此也简要介绍了家蚕个体水平上φc31整合酶介导的盒式交换的研究进展,期望能为家蚕基因组的操作技术研究提供一些借鉴。

关键词： φc31整合酶位点特异性重组基因功能分析转基因标志删除生物合成

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φc31整合酶与生物医学

医学分子生物学杂志 2007年第4期4卷 339-342页

作者：徐焕宇马晴雯上海交通大学医学遗传研究所上海市200040

来源于链霉菌噬菌体фc31的整合酶可通过介导链霉菌attB序列与多种生物内源性特异性序列产生重组反应,将外源基因定点整合到生物基因组中。在基因治疗研究中应用φc31整合酶,可使外源基因长期高水平表达,从而达到较好的治疗效果;且由于... 详细信息

来源于链霉菌噬菌体фc31的整合酶可通过介导链霉菌attB序列与多种生物内源性特异性序列产生重组反应,将外源基因定点整合到生物基因组中。在基因治疗研究中应用φc31整合酶,可使外源基因长期高水平表达,从而达到较好的治疗效果;且由于外源基因定点整合,故安全隐患较小。此外,фc31整合酶还可以用来生产外源基因定点整合的转基因动物,在基础研究和应用研究领域都有很高的潜在应用价值。

关键词： φc31整合酶基因治疗转基因动物假attP位点

牛基因组中有利于φc31整合酶介导的外源基因高效表达位点的研究

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牛基因组中有利于ΦC31整合酶介导的外源基因高效表达位点的研究

Φc31位点特异性整合酶DNA结合功能域的鉴定

中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会

作者：欧海龙曲立娟许淼蔡勤巩芷娟黄英曾溢滔上海交通大学医学遗传研究所

来源于链霉菌(Streptomyces)噬菌体的φc31整合酶能介导携带 attB 序列的重组载体在人、鼠等动物基因组中实现高效定点整合,染色体上的整合位点称为假 attP 位点。假 attP 位点广泛存在于多种物种的动物基因组中,而且每个物种往往存在... 详细信息

来源于链霉菌(Streptomyces)噬菌体的φc31整合酶能介导携带 attB 序列的重组载体在人、鼠等动物基因组中实现高效定点整合,染色体上的整合位点称为假 attP 位点。假 attP 位点广泛存在于多种物种的动物基因组中,而且每个物种往往存在着多个假 attP 位点,如人基因组中存在着约100多个假 attB 位点,小鼠基因组中约有57个。另外在大鼠、兔、果蝇中也发现若干个假 attP 位点。多假 attP 位点的存在使外源基因的整合变得非特异性,并给利用φc31整合酶重组系统的遗传操作带来麻烦。然而,研究揭示在基因组中诸多的假 attP 位点中存在着若干优先整合位点(热点),例如小鼠基因组 mpsL1位点的整合频率最高,且整合入该位点的外源基因均能得到持续高效地表达。在人基因组中的假 attP 位点 A 的外源基因在该位点的整合率也高达40%,被认为是整合的热点,在该位点整合的外源基因可保持稳定、高水平地表达,而且所表达的蛋白功能正常。为了分析牛基因组中假 attP 位点的分布情况,寻找牛基因组中高频整合的假 attP 位点以及各假 attP 位点对外源基因表达水平的影响, 我们继在牛基因中首次了2个分别位于19号和28号染色体上假 attP 位点 BpsM 1和 BpsF1 后,进一步采用含有 attB 序列及表达 GFP 的质粒 pEGFP-N1-attB 与φc31整合酶质粒 pcMV-int 共转染牛耳皮肤成纤维细胞,并应用 PcR、反向 PcR、荧光原位杂交(FISH)、ELISA、FAcS 等方法对 GFP 不同表达水平的细胞克隆中的外源基因的整合位点进行分析。结果显示,1、共转染牛耳皮肤成纤维细胞并经 G418筛选后获得 GFP 不同表达水平的细胞克隆,分别对表达水平最强及最弱的两个细胞克隆的整合位点进行分析,发现外源载体均在 attB 序列的核心位置发生整合,说明其均在假 attP 位点发生了位点特异性重组。经序列比分析,高表达细胞中 GFP 基因整合在4号染色体上,该假 attP 位点(BF4)在 Gli 蛋白家族3基因的下游3’的 UTR 区, 附近序列富含 A-T 碱基,与下游的一个功能未知的蛋白的基因相距17K 多;在低表达细胞中, GFP 基因整合在10号染色体上,该假 attP 位点(BFIO)在距 FLRT2基因的5’约85K 处,其下游基因未知。这两个假 attP 位点的 FISH 检测,检测结果与序列比对相吻合。2、对我们所发现的牛基因组中的四个假 attP 位点的整合频率分析结果表明,在获得的57个独立的、稳定整合外源基因的细胞克隆中,整合于 BE4位点占74%(42/57),整合在 BF10和 BpsF1位点分别有4个(7%,4/57),而在 BpsM1位点没有检测到外源基因的整合。上述结果表明, φc31整合酶介导的外源基因在牛基因组中整合并不是随机的,而且整合位点的选择明显地偏好于 BF4位点,为整合热点。3、FAcS 和 ELISA 对分别整合于 BF4和 BF10位点的外源基因的表达水平的检测结果显示,整合于 BF4位点 GFP 基因均显示出较高水平地表达,为337μg/mg, 是整合于 BF10位点表达水平的两倍以上。据此,我们在牛基因组中鉴定出了一个能被高频介导整合、且能促进外源基因高效表达的假 attP 位点 BF4。本研究对促进转基因动物的生产、基因治疗和基因转导的遗传操作等提供了重要应用价值的科学资料。

关键词： φc31整合酶牛基因组假 attP 位点整合

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第7期26卷 622-629页

作者：辛清婷马金芳王玮刘绍辉李荣秀朱焕章复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢教育部重点实验室上海200240

DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定Φc31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对φc31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用... 详细信息

DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定Φc31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对φc31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用PcR和克隆技术在pET22b原核表达载体上构建φc31整合酶重组截短突变体表达质粒,将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达,经镍柱纯化获得了纯度达90%以上的重组蛋白,分子量也与预期大小一致,Western印迹确定了重组蛋白的特异性.凝胶迁移滞后实验显示野生型以及截短突变体蛋白Φc311-528、Φc311-472、Φc311-413能与细菌附着位点DNAattB和噬菌体附着位点DNAattP结合的条带,而截短突变体Φc311-353、Φc311-279、Φc311-120观察不到相应的结合条带.6个截短突变体质粒在体内重组活性蓝白斑实验中均表现为蓝斑,显示出皆丧失体内重组活性.研究证实,φc31整合酶半胱氨酸富集域(第353～413位氨基酸)具有DNA结合的功能,而c末端缬氨酸富集区(第528～613位氨基酸)也与其重组活性相关.这为进一步了解φc31整合酶的结构与功能,最终引导其结构进化,提高其特异性和整合效率奠定了基础.

关键词： φc31整合酶截短型突变体原核表达和纯化 DNA结合能力

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位点特异整合酶φc31的作用机制及应用

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2012年第6期40卷 47-51页

作者：上官陶朱其军孙涛李光鹏仲跻峰何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心山东济南250100 山东省泰安市畜牧兽医局山东泰安271000 内蒙古大学实验动物研究中心内蒙古呼和浩特010021

链霉菌噬菌体φc31整合酶是一种位点特异整合酶(Site-specific recombinase,SSR),其能够精确并单向的促进attP位点与attB位点的重组,是继cre/Loxp、FLP之后又一个倍受关注的位点特异整合酶,该整合酶已经成为基因治疗、转基因研究等领域... 详细信息

链霉菌噬菌体φc31整合酶是一种位点特异整合酶(Site-specific recombinase,SSR),其能够精确并单向的促进attP位点与attB位点的重组,是继cre/Loxp、FLP之后又一个倍受关注的位点特异整合酶,该整合酶已经成为基因治疗、转基因研究等领域的常用技术手段。现对φc31位点特异性整合酶的作用机制、整合位点及其在转基因和基因治疗中的应用进行了综述,并对其发展前景进行了展望。

关键词： φc31整合酶位点特异性整合转基因基因治疗

链霉菌噬菌体Φc31位点特异性整合酶的结构与功能初步探讨

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链霉菌噬菌体ΦC31位点特异性整合酶的结构与功能初步探讨

作者：辛清婷复旦大学

学位级别：硕士

Φc31位点特异性整合酶由于能介导携带有attB序列的目的基因位点特异性整合到哺乳动物细胞基因组中,因而该系统已成为基因操作及基因治疗的强有力工具。然而,该整合酶在哺乳动物细胞上介导整合的位点特异性和整合效率仍需进一步提高。... 详细信息

Φc31位点特异性整合酶由于能介导携带有attB序列的目的基因位点特异性整合到哺乳动物细胞基因组中,因而该系统已成为基因操作及基因治疗的强有力工具。然而,该整合酶在哺乳动物细胞上介导整合的位点特异性和整合效率仍需进一步提高。而解析Φc31位点特异性整合酶结构与功能关系是解决上述问题的基础和关键。为此,本研究利用生物信息学对Φc31位点特异性整合酶结构进行预测,结合分子生物学技术对其结构与功能关系进行初步探讨,其结果如下： 1、利用生物信息学对包含Φc31位点特异性整合酶在内的丝氨酸位点特异性重组酶家族30个成员进行同源比对,结果显示：aa1—120为催化结构域,其在整个家族里是保守的;aa291-359含有许多带电残基(22aa)和极性残基(10aa),预测为蛋白多聚化相关区域,4个保守的cys残基位于aa353—405,该区域可能是DNA结合相关区域,aa416—504为Leu富含区,包含了14个Leu,aa457—527预测为α螺旋结构。 2、依据Φc31位点特异性整合酶结构预测构建了pET22b-Φc311-528等八个截断突变体质粒。这些质粒分别与Φc31报告质粒共转在体内进行整合活性检测。结果显示所有的截断突变体均表现为蓝斑,而对照野生型表现为白斑,提示所有截断突变体已丢失重组活性。 3、截断突变体质粒pET22b-Φc311-528等转化Rossetta菌经诱导表达及镍柱纯化,结果显示八个蛋白分子量由大到小分别为54KD、49KD、43KD、37KD、31KD、16KD、37KD、16KD,其中六个蛋白的纯度达到90%以上。上述蛋白经Western blot检测,显示的条带与预期大小一致。 4、截断突变体DNA结合能力检测。利用凝胶迁移滞后实验技术分别检测八个截断突变体的DNA结合能力,结果显示：Φc311-528;Φc311-472;Φc311-413和Φc31279-613可见相应的结合条带,提示其具有DNA结合能力,而Φc311-353;Φc311-279;Φc311-120;Φc31353-472观察不到相应的结合条带,提示其已经丧失了DNA结合能力。总之,本研究在生物信息学结构预测的基础上,利用生物学技术和方法通过对Φc31截断突变研究,率先证实了aa353-413与其DNA结合能力相关,发现了即使缺失c末端aa528-613也影响其重组活性。这一发现对于进一步了解Φc31位点特异性整合酶的结构信息,对其结构进化,并为提高其特异性和整合效率奠定了基础。

关键词： φc31整合酶位点特异性重组 att位点结构预测蛋白表达纯化重组活性 DNA结合功能域

φc31整合酶系统介导的位点特异性整合研究进展

同方学位论文库评论

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遗传 2011年第6期33卷 567-575页

作者：马晴雯上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040

来源于链霉菌(Streptomyces)噬菌体φc31的整合酶可介导链霉菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)之间的同源重组,这种重组亦可在多种动植物细胞内进行;而且,该整合酶还可介导含attB位点的载体以位点特异性方式整合于多种真核生物基... 详细信息

来源于链霉菌(Streptomyces)噬菌体φc31的整合酶可介导链霉菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)之间的同源重组,这种重组亦可在多种动植物细胞内进行;而且,该整合酶还可介导含attB位点的载体以位点特异性方式整合于多种真核生物基因组内的假attP位点,并使转基因持续高效表达。因此,φc31整合酶在基因修饰、基因治疗及转基因动物研制等方面得到了广泛的应用。文章就近年来φc31整合酶整合规律、提高效率方面的改进及安全性等相关领域的研究进展进行了综述。

关键词： φc31整合酶位点特异性整合基因治疗转基因安全性

调控红霉素工业生产菌发酵液组分的代谢工程研究

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调控红霉素工业生产菌发酵液组分的代谢工程研究

作者：张庆林华东理工大学

学位级别：硕士

红霉素(Erythromycin)是由红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的一类14元大环内酯类抗生素。在其发酵液中,红霉素A(Er-A)为主要产物,此外还有少量副产物红霉素B,c和D(Er-B, c和D)的积累。红霉素A的抑菌活性最高,在临床上被... 详细信息

红霉素(Erythromycin)是由红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的一类14元大环内酯类抗生素。在其发酵液中,红霉素A(Er-A)为主要产物,此外还有少量副产物红霉素B,c和D(Er-B, c和D)的积累。红霉素A的抑菌活性最高,在临床上被广泛应用,目前市场上主要以其作为原料药进行新一代红霉素的合成。红霉素D是其生物合成途径中第一个具有生物活性的中间产物,红霉素B和c的活性较差,且具有一定的毒副作用,但红霉素B比A更具有耐酸性,红霉素c可被转化为巨大霉素及其相关衍生物,它们也可能作为先导化合物被用于开发活性更好的衍生物,具有一定的应用价值。为了提高红霉素工业生产菌株中红霉素A的含量,并得到能以红霉素B、c和D为主要产物的工业生产菌,本课题以红霉素工业生产菌株为对象,针对催化红霉素D转化为A的羟基化酶(erythromycin c-12 hydroxylase, EryK)和甲基化酶(erythromycin O-methyltransferase, EryG),进行代谢工程改造。首先,我们利用φc31整合酶介导的位点特异性整合,将羟基化酶和甲基化酶表达单元PermE-eryK-eryG-eryK整合到含φc31整合酶识别位点attB的S. erythraea-attB的染色体上,从而构建了重组菌S. erythraea-KGK。重组菌的发酵液中Er-A的比例可达91.1%,且Er-A产量提高了18.6%。这一结果表明,利用attB插入盒子实现的整合策略是可行的,为进一步在此基础上优化红霉素组分和产量奠定了基础。其次,为了在单一菌株中分别实现红霉素B,c和D的大量积累,我们分别采用同源单交换和同源双交换,通过在工业菌HL 3168 E3染色体的eryG位点插入失活和对eryK基因缺失失活,得到高产Er-c的重组菌S. erythraea QL-G和高产Er-B的重组菌*** QL-K,使Er-c和Er-B的浓度分别达到2.55mg/ml和1.88mg/ml。在重组菌QL-K的基础上,对eryG基因进行插入失活,从而得到以Er-D为主要产物的重组菌*** QL-KG,其Er-D的浓度可达2.05mg/ml。这三个重组菌中各红霉素的产量与出发菌中红霉素A的产量相比没有明显变化,表明对后修饰途径的羟基化酶和甲基化酶进行遗传操作并不会影响红霉素的合成。此外,通过对各重组菌发酵过程中不同红霉素组分的分析,我们还发现在红霉素D向B和c转化的分支途径中,EryG催化合成红霉素B的效率,要高于EryK催化合成红霉素c。这三个突变株的成功构建,不仅使Er-B,c和D的大量获得变得更为简单易行,也对我们解析红霉素合成及后修饰途径提供了重要的信息。

关键词：红霉素A 红霉素B 红霉素c 红霉素D φc31整合酶羟基化酶甲基化酶