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作者：潘晓斌福建师范大学

学位级别：硕士

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)病是一种高发病率、高致死率的番鸭传染病。自暴发以来,已给番鸭业造成严重的经济损失,成为制约我国番鸭业健康发展的主要疫病之一。目前国内外有关MDRV疫苗的研究报导仅见于福建省农业科学... 详细信息

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)病是一种高发病率、高致死率的番鸭传染病。自暴发以来,已给番鸭业造成严重的经济损失,成为制约我国番鸭业健康发展的主要疫病之一。目前国内外有关MDRV疫苗的研究报导仅见于福建省农业科学院畜牧兽医研究所选育的番鸭呼肠孤病毒弱毒株,该弱毒活疫苗具有良好的保护率,在有效防制番鸭呼肠孤病毒病中发挥了重要作用。但弱毒苗往往存在着水平排毒、毒力返强等安全性问题。因此有必要研制更安全、有效的疫苗。本实验以此为目的,构建了番鸭呼肠孤病毒σc编码基因重组腺病毒载体,并在AD293细胞上组装了重组腺病毒,为今后研究σc编码基因重组腺病毒疫苗奠定技术基础。根据已知的番鸭呼肠孤病毒MW9710分离株σc编码基因的核苷酸序列设计一对PcR引物,从σc编码基因重组T载体质粒中扩增出目的片段,构建了两端分别添加有Kpn I和Not I位点的σc编码基因片段。将Kpn I、Not I双酶切处理后的目的基因片段和pShuttle-cMV穿梭载体经过粘性末端连接,构建了含有σc编码基因的pShuttle-cMV-σc重组载体。pShuttle-cMV-σc阳性质粒经Pine I线性化后,电转化BJ5183感受态细胞,与pAdEasy-1骨架载体同源重组,构建成pAdcMV-σc重组腺病毒载体。pAdcMV-σc重组腺病毒载体经Pac I线性化后转染AD293细胞。转染后的AD293细胞于第7天产生病变,表明已在AD293细胞上组装了重组腺病毒。重组病毒经连续传代、PcR鉴定验证,表明σc编码基因能稳定地存在于重组腺病毒基因组中。有限稀释法测定结果表明重组病毒TcID为10TcID/ml。

关键词：番鸭呼肠孤病毒 σc编码基因腺病毒载体

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以番鸭呼肠孤病毒σc表达蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2006年第3期36卷 171-176页

作者：耿宏伟郭东春张云胡奇林刘明张序王立群中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350003 哈尔滨市兽医卫生防疫站黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学生命科学院黑龙江哈尔滨150030

将鸭呼肠孤病毒小外壳σc蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,获得了重组质粒pET32a-σc,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞后,经SDS-PAGE和Western-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病... 详细信息

将鸭呼肠孤病毒小外壳σc蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,获得了重组质粒pET32a-σc,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞后,经SDS-PAGE和Western-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15 mmol/L IPTG诱导,5 h后融合蛋白σc表达量可达高峰,分子质量为50ku;融合蛋白纯化后被用作包被抗原,建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA,经对检测条件优化,最佳包被浓度为5μg/mL,标准阳性血清的最适稀释倍数为1∶40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测,与琼脂扩散抗体检测法相比,ELISA具有良好的特异性和敏感性。

关键词：番鸭呼肠孤病毒 σc编码基因原核表达酶联免疫吸附试验

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以番鸭呼肠孤病毒σc表达蛋白为抗原的ELISA方法的建立

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水禽世界 2008年第1期 34-39页

作者：张云耿宏伟郭东春胡奇林刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 福建农科院牧医所福建福州350003

将鸭呼肠孤病毒小外壳σc蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,得到重组质粒pET32a-σc,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,经SDS-PAGE和Western-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康... 详细信息

将鸭呼肠孤病毒小外壳σc蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,得到重组质粒pET32a-σc,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,经SDS-PAGE和Western-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15m mol/LIPTG诱导,5h后融合蛋白σc表达量可达高峰,分子量为50ku;融合蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测鸭血清中的呼肠孤病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,最佳包被浓度为5μg/ml;标准阳性血清的最适稀释倍数为1:40;用该方法对50份鸭血清样品进行检测,并与琼扩抗体检测法相比较,证明该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,该研究为今后鸭呼肠孤病毒的诊断试剂盒的研制奠定了基础。

关键词：番鸭呼肠孤病毒 σc编码基因原核表达酶联免疫吸附试验

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