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大肠杆菌O157∶H7Ⅲ型分泌系统的缺陷突变株对HeLa细胞黏附能力的影响

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军事医学 2014年第10期38卷 795-798页

作者：王玉瑞廖翔周围戴红梅宋婷梁龙军事医学科学院生物工程研究所北京100071 安徽大学生命科学学院合肥230601

目的构建O157∶H7 EDL933菌株Ⅲ型分泌系统(T3SS)缺陷突变株ΔescR,感染HeLa细胞后检测其黏附能力。方法通过重叠延伸PCR扩增出中间为卡那霉素抗性基因,两侧为escR基因上下游同源序列的重组线性DNA片段,电击转入含pKD46的EDL933感受态... 详细信息

目的构建O157∶H7 EDL933菌株Ⅲ型分泌系统(T3SS)缺陷突变株ΔescR,感染HeLa细胞后检测其黏附能力。方法通过重叠延伸PCR扩增出中间为卡那霉素抗性基因,两侧为escR基因上下游同源序列的重组线性DNA片段,电击转入含pKD46的EDL933感受态细胞中,escR基因被kan基因替换而缺失。绘制野生株与ΔescR生长曲线,并利用免疫荧光观察两株细菌对HeLa细胞的黏附能力。结果获得缺陷突变株ΔescR,相较于野生株,该突变株在DMEM(10%FBS)培养基中生长速度以及对HeLa细胞的黏附能力明显下降。结论 T3SS结构蛋白escR基因的缺失破坏了EDL933 T3SS的形成,影响了该菌株黏附能力,其构建为后续研究T3SS奠定了基础。

关键词：大肠杆菌 0157:H7 Ⅲ型分泌系统 escR基因 HeLa细胞 λred同源重组

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇ldhA基因缺失菌株的构建

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生物技术通报 2015年第3期31卷 121-126页

作者：陈利飞李猛马春玲杨建楼齐鲁工业大学食品与生物工程学院山东省微生物工程重点实验室济南250353

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)甘油歧化发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,乳酸是氧化途径最主要的副产物,乳酸的产生和积累,不仅限制了菌体本身的生长,而且严重影响了1,3-丙二醇的转化率。利用λred重组技术对Klebsiella pneumo... 详细信息

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)甘油歧化发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,乳酸是氧化途径最主要的副产物,乳酸的产生和积累,不仅限制了菌体本身的生长,而且严重影响了1,3-丙二醇的转化率。利用λred重组技术对Klebsiella pneumonia中的酶乳酸脱氢酶基因(ldhA)进行改造。在λred重组系统作用下,将带有300 bp的线性同源片段ldhA1-Cm-ldh A2与基因组DNA的同源重组,经过抗性筛选和PCR鉴定最终获得了ldhA基因缺失菌株***2-1ΔldhA。经过24 h发酵可知,乳酸最大产出浓度由原来的10.16 g/L降为0.49 g/L,1,3-PD由原来的78.83 g/L增长为85.76 g/L,甘油转化率由60.64%增长到65.97%,提高了5.33%。

关键词：克雷伯氏菌 ldhA基因 λred同源重组 1,3-丙二醇

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇aldH基因缺失菌株的构建

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中国酿造 2016年第4期35卷 56-60页

作者：杨建楼郑海杰马春玲王瑞明陈利飞齐鲁工业大学食品与生物工程学院山东省微生物工程重点实验室山东济南250353 山东华牧天元农牧股份有限公司山东济南250353

该研究利用λred重组技术对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)中的乙醛脱氢酶(ald H)基因进行敲除,成功构建缺失菌株***2-1Δald H,与原始菌株相比,缺失菌株***2-1Δald H发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L,降低了93.51%;1... 详细信息

该研究利用λred重组技术对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)中的乙醛脱氢酶(ald H)基因进行敲除,成功构建缺失菌株***2-1Δald H,与原始菌株相比,缺失菌株***2-1Δald H发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L,降低了93.51%;1,3-丙二醇产量由原来的78.83 g/L增长至82.55 g/L,提高了4.72.%;甘油转化率由60.64%增长至63.50%,提高了2.86%。缺失菌株***2-1Δald H 50 L发酵罐小试试验中,1,3-丙二醇的产量为78.13 g/L,乙醇产量为0.50 g/L。

关键词：克雷伯氏菌 1 3-丙二醇 aldH基因 λred同源重组

沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA缺失株的构建

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沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA缺失株的构建

作者：杨林扬州大学

学位级别：硕士

沙门菌是一种兼性胞内致病菌,能够引起系统或局部感染。宿主感染后既可引起胃肠炎、流产、败血症等症状,又可表现为带菌不发病的状态。随着抗菌药物在临床和动物饲料中的广泛使用,沙门菌耐药性日趋严重,在多种动物中的感染率亦逐渐上升... 详细信息

沙门菌是一种兼性胞内致病菌,能够引起系统或局部感染。宿主感染后既可引起胃肠炎、流产、败血症等症状,又可表现为带菌不发病的状态。随着抗菌药物在临床和动物饲料中的广泛使用,沙门菌耐药性日趋严重,在多种动物中的感染率亦逐渐上升,引起了巨大的经济损失。沙门菌的鉴定主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等传统方法,但是传统方法费时费力,有些血清型难以区分。因此,迫切需要一种能够快速检测沙门菌的方法,并且采取有效的防制措施来降低家禽的感染率,提高家禽及其产品的质量。本研究根据沙门菌属特异性基囚(hut)及肠炎沙门菌(Sdf Ⅰ),鼠伤寒沙门菌(Spy),鸡白痢沙门菌(glgC,鸡伤寒沙门菌(glgC和speC)的血清型特异性基因分别设计一对引物,建立了mPCR方法,可同时检测鉴定出肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及鸡伤寒沙门菌。选取由mPCR方法鉴定出的鸡白痢沙门菌S004、S005、S017及实验室保存菌S6702株,利用λred同源重组技术,成功构建了鸡白痢沙门菌αroA缺失株：S004AaroA、 S005AaroA、S017AaroA和S6702AaroA,并对其生物学特性及毒力进行了测定,为沙门菌减毒活疫苗的研制奠定了基础。1快速检测肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌mPCR方法的建立根据沙门菌属特异性基因(hut、495bp)及肠炎沙门菌(SdfⅠ、304bp)、鼠伤寒沙门菌(Spy、401bp)、鸡白痢沙门菌(glgC、252bp)和鸡伤寒沙门菌(glgC、252bp和speC、174bp)的血清型特异性基因分别设计引物,调节模板用量,dNTP、Taq酶的比例和退火温度,建立mPCR方法。菌液PCR敏感度结果显示：肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的最低检出量均为3×103CFU;提取沙门菌DNA的敏感度结果显示：鉴别肠炎、鼠伤寒、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的最低检量分别为162pg/μL、202pg/μL、214pg/μL和178pg/μL。与常规的分离鉴定相比,所建立的mPCR检测沙门菌属和鼠伤寒沙门菌的敏感性、特异性、符合率均为100%;检测肠炎沙门菌的敏感性、特异性、符合率分别为100%、98%、98.2%;检测鸡白痢沙门菌的敏感性、特异性、符合率分别为100%、94.6%、96.4%。不在其中的血清型也可以通过属特异性基因hut基因的扩增检测出,因此不会漏检临床样品中的沙门菌。2鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性的初步研究根据GenBank提供的基因序列扩增鸡白痢沙门菌临床分离菌株的aroA基因。利用λred同源重组技术,构建鸡白痢沙门菌aroA缺失株：S004△aroA、S005△aroA、S6702△aroA和S6702△arnA。通过PCR鉴定,缺失株构建成功。4株野生株及其缺失株的生长曲线显示,野生株中S6702生长速度最快,其它3株鸡白痢沙门菌生长速度相似;与野生株相比,缺失株的生长速度均有所下降,缺大株中S6702△aroA生长速度最快。用不同剂量的野生株与缺失株分别通过肌肉接种2日龄SPF雏鸡,测定其半数致死量(LD50),结果显示,野生株S004、S005、S017和S6702的LD50分别为106.30、107.040、106.612和108.34,而缺失株S004△aroA、S005△aroA、S6702△aroA和S6702ΔaroA的LD50分别为108.60、108.256、108190和108.57。可以看出,S004缺失株毒力显著降低,S6702缺失株毒力降低最少,但是其野生株毒力较其他野生株毒力也较弱。因此,aroA的缺失对鸡白痢沙门菌的致弱作用与菌株有关。鸡白痢沙门菌aroA致弱株的构建为疫苗候选株的筛选奠定了基础。

关键词：鸡白痢沙门菌多重PCR aroA基因 λred同源重组缺失株

利用red系统构建人组织型纤溶酶原激活剂突变体BAC乳腺特异表达载体

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利用Red系统构建人组织型纤溶酶原激活剂突变体BAC乳腺特异表达载...

作者：辛艳丽中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是治疗血栓栓塞性疾病的重要药物。本项目的t-PA突变体,活性提高,半衰期延长,已成功获得表达。目前t-PA主要来自于哺乳动物细胞大规模培养,成本高昂,价格昂贵。利用动物乳腺生物反应器来生产不仅维持生产的... 详细信息

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是治疗血栓栓塞性疾病的重要药物。本项目的t-PA突变体,活性提高,半衰期延长,已成功获得表达。目前t-PA主要来自于哺乳动物细胞大规模培养,成本高昂,价格昂贵。利用动物乳腺生物反应器来生产不仅维持生产的成本低,而且产量高,能够进行翻译后修饰、正确折叠。但位置效应的影响是其主要技术瓶颈之一。细菌人工染色体容量大,可装载乳蛋白基因的所有调控序列,乳蛋白基因座中的一些边缘序列具有绝缘子的功效,能使乳蛋白基因表达调控不受周围序列的影响,作为转基因载体就有可能克服外源基因的位置效应。本研究主要构建了由β-酪蛋白基因调控序列指导的t-PA突变体BAC转基因载体。采用了λ噬菌体red同源重组系统介导的同源重组方法对含有鼠β-酪蛋白基因的RPCI23-440C1 BAC进行了快速改构。这种方法要明显优于传统的——利用微生物本身的RecA重组系统进行重组的方法。首先通过PCR方法,获得两端带有鼠β-酪蛋白基因同源序列的tPAm-Zeo和tPAm-BGHpA-Zeo同源重组片段,将其电击转化至已含有编码red重组酶质粒和BAC的宿主菌。在λred重组系统的帮助下,通过同源重组片段两端与β-酪蛋白同源的序列在体内与β-酪蛋白基因发生同源重组,将其置换。经Southern blot和测序鉴定,得到了t-PAm基因定点敲入的tPAm-Zeo/tPAm-BGHpA-Zeo BAC转基因载体。最后通过FLP位点专一性重组,利用Zeocin抗性基因两侧的FRT位点,将抗性基因剔除。Southern blot和序列分析鉴定,获得了无抗性基因且编码两种重组酶质粒丢失的t-PAm BAC载体。最后利用上述两种转基因载体分别从细胞和动物水平初步验证了其有效性。由此建立了快速高效的BAC重组技术,获得了转基因所需的BAC载体,为转基因动物以及动物乳腺生物反应器的制备提供了新的方法,这一方法的建立也为利用BAC研究基因调控和功能提供了新途径。

关键词：人组织型纤溶酶原激活剂突变体(ht-PAm) 转基因动物乳腺生物反应器位置效应细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome) λred同源重组 FLP位点专一性重组

大肠杆菌O157:H7效应分子NleB1和NleB2的初步研究

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大肠杆菌O157:H7效应分子NleB1和NleB2的初步研究

作者：王玉瑞安徽大学

学位级别：硕士

肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic ***, EHEC)O157:H7是一种非侵入性的革兰氏阴性致病菌,可引起腹泻、出血性结肠炎、尿毒综合征等一系列并发症,对人体有强烈的致病性与致死性,严重危害人类的生命健康。O157:H7对小肠上皮细胞的黏... 详细信息

肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic ***, EHEC)O157:H7是一种非侵入性的革兰氏阴性致病菌,可引起腹泻、出血性结肠炎、尿毒综合征等一系列并发症,对人体有强烈的致病性与致死性,严重危害人类的生命健康。O157:H7对小肠上皮细胞的黏附能力是疾病发展的关键,细菌可通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)黏附在宿主细胞表面并向细胞内注入了各种毒力效应分子,这些毒力效应分子共同破坏宿主细胞正常的生理机制,如聚集肌动蛋白形成基座结构,破坏细胞之间的紧密连接,最终在小肠上皮细胞表面发生黏附/擦拭损伤(A/E损伤),从而使致病菌逃避细胞的免疫反应。毒力相关的T3SS是一种结构和功能高度保守的,呈“针”样结构的蛋白质运输装置,大约由20多个保守蛋白构成。由escR基因编码的EscR蛋白是T3SS的结构蛋白之一,该保守蛋白的缺失会导致T3SS功能发生缺陷,从而影响致病菌对细胞的黏附作用。鼠类柠檬酸杆菌感染小鼠可导致小鼠的A/E损伤,相较于0157：H7对人体强烈的致病性,该菌不能感染人体,可作为研究0157：H7的模式菌。NleB是A/E损伤致病菌中存在的保守蛋白,蛋白质分子量约为38kDa。鼠类柠檬酸杆菌中的效应分子NleB是一种糖基转移酶,其酶活性与NleB中"DXD"结构密切相关,并可特异性抑制TNF介导的NF-κB信号通路的激活。O157:H7EDL933菌株中有两套nleB基因,即z4328和zO985,分别编码假想蛋白NleB1(Z4328)和NleB2(Z0985。我们通过序列比对分析发现,EDL933菌株中的基因z4348和zO985,分别和鼠类柠檬酸杆菌的nleB基因有89%和62%的一致性。通过对氨基酸序列分析,我们发现EDL933的假想蛋白NleB1和NleB2中均具有‘'DXD"结构。我们大胆推测假想蛋白NleB1、NleB2具有与NleB类似的生化作用机制,并围绕相关内容进行课题的研究。本研究中构建了pGEX-2TK-NleB2原核表达载体,IPTG成功诱导GST-NleB2融合蛋白的表达,该蛋白主要以可溶性形式进行表达,我们对其可溶性表达条件进行摸索和优化,谷胱甘肽琼脂糖凝珠纯化该蛋白后多次免疫小鼠,成功制备了小鼠抗GST-NleB2融合蛋白的多克隆抗体,并成功检测到了N1eB2蛋白在0157：H7野生株中的天然表达。本研究结合重叠延伸PCR技术以及经典的λred同源重组技术,融合了含卡那霉素抗性基因kan以及escR基因上游和下游基因的同源打靶DNA片段,采用一步敲除法,电击转入含pKD46质粒的EDL933感受态细胞中,以抗性基因kan置换0157:H7EDL933菌株的escR基因,经过抗性筛选、PCR以及测序鉴定分析,成功构建了使EscR蛋白的功能失活的T3SS缺陷突变株△escR。绘制了0157：H7野生型菌株和T3SS缺陷突变株△escR在LB和DMEM (10%FBS)培养基中培养的生长曲线,观察二者的生长速度变化。用DMEM (10%FBS)培养过夜的野生型菌株与△escR分别感染HeLa细胞,洗去未黏附的细菌后,通过免疫荧光分析二者对HeLa细胞的黏附能力。结果反应,与野生株相比,缺陷突变株△escR对HeLa细胞的黏附能力显著下降。该结果提示T3SS对0157：H7致病性的重要性。本实验构建的T3SS缺陷株△escR,是用于鉴定NleB1和N1eB2是否为可通过T3SS系统分泌且注入细胞的效应蛋白。我们以EDL933菌株基因组为模板,对基因z4348和z0985进行了克隆,分别连接到原核胞质表达载体pFLAG-MAC上,并将获得的这两种重组质粒分别转化到野生型0157：H7和T3SS缺陷突变株△escR中,通过Western blot印迹分析得知,IPTG可成功诱导Flag-NleB1、 Flag-NleB2重组蛋白在这两种菌株中表达。用DMEM (10%FBS)培养基分别培养以上四种菌株,收集菌液以及过滤除菌的培养基上清,浓缩蛋白后进行Western blot印迹分析,我们发现,野生型O157:H7培养基上清中检测到Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白,△escR菌株培养基上清中均未检测到这两种重组蛋白,说明缺失了T3SS的△escR菌株不能分泌Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白。随后,用以上四种菌株分别感染HeLa细胞,洗去未黏附的细菌,用Flag标签抗体进行免疫荧光定位分析,结果发现,T3SS缺陷株△escR感染的HeLa细胞并未检测到Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白,但可在含重组质粒的野生型O157:H7感染的HeLa细胞检测到,说明Flag-NleB1和Flag-NleB2蛋白需

关键词： O157:H7 Ⅲ型分泌系统 λred同源重组多克隆抗体 Z0985 Z4328 NleB