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作者：曹宁北京化工大学

学位级别：硕士

3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，3-HP）是一种多功能高值化学品。基因工程菌发酵生产3-HP是目前的研究热点。本研究以耐受高浓度甘油的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae DMS2026）为出发菌株，构建基于串联表达载体和λ-red... 详细信息

3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，3-HP）是一种多功能高值化学品。基因工程菌发酵生产3-HP是目前的研究热点。本研究以耐受高浓度甘油的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae DMS2026）为出发菌株，构建基于串联表达载体和λ-red同源重组技术的工程菌，并对工程菌生产3-HP的能力进行了探索，具体研究内容如下： 1、克隆了K. pneumoniae甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC，构建了由甘油脱水酶自身组成型启动子pk调节的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC，电击转化K. pneumoniae DSM2026，获得重组菌K. p(pET-pk-dhaB-puuC)，进行微氧摇瓶发酵及上罐发酵。结果：微氧摇瓶发酵15h后，重组菌的3-HP产量达到最大值7.2g/L，分别为野生型K. pneumoniae和K. p(pET-pk)的6.79和8.47倍，副产物乳酸和乙酸浓度也为整个发酵周期最低值的0.49g/L和1.07g/L;上罐发酵在维持低副产物水平的同时，3-HP产量达到14.2g/L，因此确定重组菌的最佳发酵周期为15h。 2、克隆了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae）的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1，在pET-pk-dhaB-puuC基础上，构建了耦合3-HP生产与NAD+再生的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC-GPD1，对重组菌K. p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)进行微氧摇瓶发酵。结果：引入GPD1后，重组菌生物量较K. p(pET-pk-dhaB-puuC)有明显提升，而3-HP最高值降为1.45g/L，分别为野生型K. pneumoniae和K.p(pET-pk)的1.93倍和2.39倍，乙酸浓度为发酵周期最低值0.54g/L。 3、克隆了λ-red同源重组系统所需的重组酶基因beta、gam、exo以及上游启动子序列区，构建重组质粒pET-ParaB-red，并成功转化*** DMS2026，得到重组菌K. p(pET-ParaB-red)。L-阿拉伯糖梯度诱导实验表明，在40mmol/L L-阿拉伯糖诱导90min后重组酶获得最佳表达量。将连续三轮易错PCR扩增的副产物基因片段lldD、pta、poxB经三轮电击转化至重组菌K. p(pET-ParaB-red），通过高通量筛选获得了两株性状明显的突变菌株K. pneumoniae(32#)和K. pneumoniae(25#)。摇瓶发酵实验结果：K. pneumoniae(32#)的副产物乙酸和乳酸维持在0.4g/L以下，而3-HP也持续低表达，最高值仅为0.33g/L。K. pneumoniae(25#)3-HP产量浓度最高达到0.96g/L;但在副产物生产上，只能较好地控制乳酸水平（＜0.4g/L），而乙酸维持在1.5g/L左右波动。此外，测序结果表明，两株菌在核酸及氨基酸水平上都发生了不同变化;连续传代实验表明，两株重组菌的突变均能稳定遗传，没有发生回复突变。

关键词： 3-羟基丙酸肺炎克雷伯氏菌醛脱氢酶甘油脱水酶 3-磷酸甘油脱氢酶 λ-red 重组重组菌发酵

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CRISPR/Cas9和λ-red基因敲除技术在大肠杆菌中的应用比较

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微生物前沿 2022年第1期11卷 1-10页

作者：吕言任晓昕徐大庆河北农业大学生命科学学院河北保定

λ-red和CRISPR/Cas9基因敲除技术已被广泛应用于染色体基因敲除。本研究分别采用λ-red和CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌BL21菌株染色体丙氨酸消旋酶基因alr进行了敲除,并比较了其敲除效率。对于red敲除技术而言,首先构建由alr上下游同源... 详细信息

λ-red和CRISPR/Cas9基因敲除技术已被广泛应用于染色体基因敲除。本研究分别采用λ-red和CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌BL21菌株染色体丙氨酸消旋酶基因alr进行了敲除,并比较了其敲除效率。对于red敲除技术而言,首先构建由alr上下游同源臂和卡那抗性盒FLT-kanR-FLT组成的打靶片段Lalr-FLT-kanR-FLT-Ralr,转化E. coli BL21/pKD46感受态细胞,在pKD46表达的red重组酶作用下发生同源重组,使染色体alr被卡那抗性盒FLT-kanR-FLT替换;然后,质粒pCP20转化上述发生了alr替换的E. coli菌株感受态细胞,在pCP20表达的FLP重组酶作用下发生位点特异性重组,删除卡那抗性基因kanR;最后,对温敏型质粒进行消除,获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-red。对于CRISPR/Cas9技术而言,首先构建敲除质粒pTargetF-alr,制备打靶供体DNA片段L-alr-R;接着,pTargetF-alr和L-alr-R共转化E. coli BL21/pCas感受态细胞,在pTargetF-alr编码的sgRNA序列引导下,质粒pCas编码的Cas9蛋白结合到alr基因切割靶点DNA,通过对双链断裂的同源重组修复实现对alr基因的无痕敲除,获得alr敲除突变株E. coli BL21 Δalr-CRISPR。实验结果显示:使用基于短、长同源臂靶打靶片段的red技术,E. coli BL21 Δalr-red阳性转化子检出率分别为5%和55%;而使用CRISPR/Cas技术,E. coli BL21 Δalr-CRISPR阳性转化子检出率为95%。实验结果表明:在E. coli中,使用短同源臂靶打靶片段的red敲除技术,转化子脱靶率超高,这使阳性转化子鉴定工作量大增;使用长同源臂打靶片段的red敲除技术,较为容易检测到阳性转化子;使用CRISPR/Cas9技术,敲除效率显著优于λ-red技术。

关键词：大肠杆菌 CRISPR/Cas9 λ-red 基因敲除丙氨酸消旋酶基因

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肠炎沙门氏菌rpoH基因缺陷株的构建及其热激响应特性

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食品科学 2009年第11期30卷 202-206页

作者：曾庆梅张冬冬韩抒司文攻李志强魏春燕吴聪靳靖合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心安徽合肥230009

构建肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis IFO3313株的rpoH基因缺陷株IFO3313-ΔrpoH,比较不同温度下缺陷株与野生株的热激响应特性。利用λ-red重组系统对Salmonella enteritidisIFO3313的rpoH基因进行缺失突变,并使用PCR方法对其进行... 详细信息

构建肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis IFO3313株的rpoH基因缺陷株IFO3313-ΔrpoH,比较不同温度下缺陷株与野生株的热激响应特性。利用λ-red重组系统对Salmonella enteritidisIFO3313的rpoH基因进行缺失突变,并使用PCR方法对其进行验证,在此基础上使用不同培养基对缺陷株与野生株进行不同温度下的热激应答结果和亚致死热损伤修复能力的考察:野生株比缺陷株有更强的热激耐受能力,在DHL平板上对亚致死热损伤的肠炎沙门氏菌的分离检测可能具有假阴性,野生株比缺陷株在TSYA平板上有更强的修复能力。利用λ-red重组系统敲除了肠炎沙门氏菌rpoH基因,有助于了解肠炎沙门氏菌的热激亚致死及其修复机制,对亚致死状态食源性病原微生物的检测做出初步研究。

关键词：基因敲除 λ-red rpoH σ^32 热激应答

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鼠伤寒沙门氏杆菌slrP基因缺失株的构建及其对细胞存活率的影响

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中国预防兽医学报 2019年第7期41卷 677-681页

作者：邵增玉毕彩鸿李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为研究鼠伤寒沙门氏杆菌(ST)E3泛素连接酶SlrP对细胞存活率的影响,本研究利用λ-red介导的同源重组技术,构建了STCVCC542株slrP基因缺失株(CVCC542ΔslrP),同时得到回补株CVCC542ΔslrP/pslrP。通过测定野生菌、缺失株和回补株的生长曲... 详细信息

为研究鼠伤寒沙门氏杆菌(ST)E3泛素连接酶SlrP对细胞存活率的影响,本研究利用λ-red介导的同源重组技术,构建了STCVCC542株slrP基因缺失株(CVCC542ΔslrP),同时得到回补株CVCC542ΔslrP/pslrP。通过测定野生菌、缺失株和回补株的生长曲线及其对HeLa细胞存活率的影响,探究SlrP蛋白在ST感染过程中的作用。生长曲线显示,slrP基因的缺失和回补对CVCC542的生长无影响;细胞存活率试验结果显示缺失菌株与野生菌株相比细胞存活率明显升高(p<0.05),而回补株与缺失株相比细胞存活率明显下降(p<0.01)。本研究为进一步阐释ST引起细胞死亡机制和该病疫苗开发奠定基础。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌 λ-red slrP E3泛素连接酶细胞存活率

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CRISPR/Cas9技术在氟喹诺酮C-7位取代基作用机制探究中的应用

CRISPR/Cas9技术在氟喹诺酮C-7位取代基作用机制探究中的应用

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作者：贾婉军青岛大学

学位级别：硕士

近年来,由于氟喹诺酮类药物的大量使用,导致越来越多的耐药突变菌被发现,这使得研究细菌耐药性产生机制、开发更优良的杀菌剂成为了整个医疗界的重要任务。目前,氟喹诺酮类药物性能的提升主要通过修饰母核C上的取代基来实现,其中C-7位... 详细信息

近年来,由于氟喹诺酮类药物的大量使用,导致越来越多的耐药突变菌被发现,这使得研究细菌耐药性产生机制、开发更优良的杀菌剂成为了整个医疗界的重要任务。目前,氟喹诺酮类药物性能的提升主要通过修饰母核C上的取代基来实现,其中C-7位取代基可变性强,在新药开发中有着较好的运用前景,因此研究C-7位取代基在氟喹诺酮杀菌过程中的作用机制有着重要意义。另外,据前期研究发现,氟喹诺酮C-7环末端恰好落在gyrB466处,但由于还未获得466位单突变体,所以目前还没能真正揭示两者之间的作用关系和强度。CRISPR/Cas9是一项高效准确的新兴基因编辑技术,其在基因功能的研究中具有重要作用。本论文通过使用CRISPR/Cas9技术和λ-red同源重组技术构建了gyrB466C突变体,并对突变体进行了药敏性检测,以分析gyr B466位氨基酸与氟喹诺酮类药物的作用情况,实验主要的内容和结果如下:通过构建CRISPR/Cas9基因编辑系统和λ-red同源重组系统,成功的将编码大肠杆菌MG1655 gyrB466位氨基酸的碱基GAA替换为了TGT,其中,替换效率达到了100%。后对获得的gyrB466单突变体进行了环丙沙星药敏实验,实验结果表明:突变型菌株的最小抑菌浓度(MIC)是野生型菌株的4倍,药物动力学实验表明,其绝对致死浓度(LD100)为0.2μg/ml,为野生型菌株的4倍,且同浓度环丙沙星对突变型菌株的杀菌效率明显降低。实验结果表明:gyrB466位氨基酸与环丙沙星具有相互作用,其突变会降低环丙沙星的杀菌性能。

关键词：氟喹诺酮 gyrB CRISPR/Cas9 λ-red CIP

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