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园艺学报 2016年第5期43卷 957-965页

作者：樊荣辉黄敏玲钟淮钦林兵福建省农业科学院作物研究所福建省农业科学院花卉研究中心福建省特色花卉工程技术研究中心福州350013

采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰(Strelitzia reginae Banks)黄色花萼中克隆到1个ζ–胡萝卜素脱氢酶基因(Sr ZDS)。其c DNA全长2 111 bp(Gen Bank收录号:KT428724),具有完整的开放阅读框,共1 710个碱基。与其他物种的氨基酸序列都有一定... 详细信息

采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰(Strelitzia reginae Banks)黄色花萼中克隆到1个ζ–胡萝卜素脱氢酶基因(Sr ZDS)。其c DNA全长2 111 bp(Gen Bank收录号:KT428724),具有完整的开放阅读框,共1 710个碱基。与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与玉米的ZDS同源性最高,达到86%。系统进化树分析显示,Sr ZDS与水仙蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明:Sr ZDS在鹤望兰黄色花萼中高表达,且在花发育的始花期和盛花期表达量最高。应用UPLC对其类胡萝卜素含量进行分析,其总量在黄色花萼中最高,且在盛花期最高,表明Sr ZDS的表达与类胡萝卜素含量成正相关。

关键词：鹤望兰 ζ–胡萝卜素脱氢酶类胡萝卜素生物合成基因克隆 UPLC

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芥蓝CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

芥蓝CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

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作者：郑爱红四川农业大学

学位级别：硕士

芥蓝(Brassica oleracea ***)属十字花科芸薹属蔬菜,其花薹和嫩叶中维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和多酚等营养物质含量丰富。ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)和八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)是植物类... 详细信息

芥蓝(Brassica oleracea ***)属十字花科芸薹属蔬菜,其花薹和嫩叶中维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和多酚等营养物质含量丰富。ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)和八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中重要的限速酶,ZDS和PDS基因分别被沉默后,转基因植株均会表现出明显的白化表型,因此这两个基因常作为CRISPR/Cas9基因编辑、VIGS等体系建立的报告靶基因。在CRISPR/Cas9基因编辑体系中,利用原生质体瞬转化技术筛选优良的CRISPR靶位点是一种高效精确的方法。我们前期研究发现,芥蓝中ZDS基因有一个成员,属单基因;而PDS基因有两个成员,属多基因。因此,本研究以芥蓝为试验材料,以BaZDS与BaPDSs基因为靶基因,首次建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术在芥蓝中的原生质体瞬时转化体系、单基因与多基因编辑的稳定遗传体系。本研究的结果为芥蓝等芸薹属植物上利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究基因功能及新品种选育提供了理论基础和技术支撑。本研究主要结果如下:1.成功建立了芥蓝的CRISPR/Cas9原生质体瞬时转化体系,该体系可用于靶位点筛选。利用CRISPR-P在线软件在BaZDS基因的第1个外显子上选取1号靶位点,在第2个外显子上选取2号靶位点,分别构建pCC-BaZDS-sgRNA1和pCC-BaZDS-sgRNA2重组质粒。通过原生质体瞬时转化系统,转化pCC-BaZDS-sgRNA1载体后,分别培养24 h、36 h、48 h,结果表明培养48 h时转化效率最高,达92.6%,因此最佳的培养时间是48 h,进一步对突变情况检测分析发现,在该靶位点上的突变类型主要以大片段的缺失为主,占86.11%;转化pCC-BaZDS-sgRNA2载体后,发现在该靶位点上,突变率为54.8%,突变类型主要以2 bp的单碱基的替换突变为主,占38.71%,其次是1 bp碱基的插入突变。2.成功建立了芥蓝单基因的CRISPR/Cas9稳定遗传体系。通过农杆菌介导的遗传转化方法,转化pCC-BaZDS-sgRNA1载体,共获得了19个转基因阳性植株,转基因阳性率为95%,其中发生突变的有13株,突变效率为68.42%,突变类型主要以大片段的插入为主,占26.32%;其次是单碱基的替换突变,且所有的突变植株均表现出明显的白化表型。3.成功建立了芥蓝多基因的CRISPR/Cas9稳定遗传体系,CRISPR/Cas9系统在芥蓝中具有同时编辑多个基因的能力。利用CRISPR-P在线软件,分别在BaPDS1和BaPDS2基因的第4个外显子上选取了两个基因的共同靶位点,合成靶序列,构建pCC-BaPDS-sgRNA重组质粒。通过农杆菌介导的遗传转化方法,共获得了68个转基因阳性植株,转基因阳性率是90.76%。突变分析发现,突变率为76.47%,其中BaPDS1、BaPDS2双突出现的比例约为1/5,单突比例超过一半,突变类型均是以短核苷酸的变化为主,没有大于10 bp的碱基的突变发生,且突变植株产生了明显的白化表型。

关键词：芥蓝 CRISPR/Cas9 原生质体瞬时转化稳定遗传转化 ζ–胡萝卜素脱氢酶八氢番茄红素脱氢酶

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