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用于卵巢癌标志物β-gal检测的荧光探针研究进展

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化学试剂 2023年第4期45卷 43-51页

作者：张亚涛何杰芳贵州师范大学生命科学学院贵州贵阳550000

卵巢癌是最常见的妇科癌症之一,其患者大多数在晚期被诊断出,导致卵巢癌患者的死亡率高。因此,对隐匿症状的早期诊断是患者生存率提高的重要保障。β-半乳糖苷酶(β-gal)在原发性卵巢癌中的过表达而被认定为卵巢癌生物标志物,所以快速... 详细信息

卵巢癌是最常见的妇科癌症之一,其患者大多数在晚期被诊断出,导致卵巢癌患者的死亡率高。因此,对隐匿症状的早期诊断是患者生存率提高的重要保障。β-半乳糖苷酶(β-gal)在原发性卵巢癌中的过表达而被认定为卵巢癌生物标志物,所以快速精准的β-gal检测技术对卵巢癌早期诊断至关重要。近年来,荧光探针技术已成为生物体内监测和可视化的有力工具。目前已经报道了大量的用于检测β-gal的荧光探针,但是,用于卵巢癌β-gal检测和可视化成像的荧光探针相对较少。主要综述用于卵巢癌细胞生物标志物β-gal检测的荧光探针的研究进展,并对探针的发展进行展望。

关键词：荧光探针 β-gal 卵巢癌分子成像生物标志物

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果胶降解相关PG/gal与猕猴桃果实后熟软化

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果胶降解相关PG/GAL与猕猴桃果实后熟软化

作者：匡盛浙江大学

学位级别：硕士

采后猕猴桃果实硬度呈下降趋势。猕猴桃果实采后软化既是必要的步骤,以达到可食程度;同时,过度的/快速的软化,则不利于采后贮藏。因此,果实软化始终是猕猴桃采后研究的重要主题之一。前期已有大量论文报道了猕猴桃果实后熟软化过程的生... 详细信息

采后猕猴桃果实硬度呈下降趋势。猕猴桃果实采后软化既是必要的步骤,以达到可食程度;同时,过度的/快速的软化,则不利于采后贮藏。因此,果实软化始终是猕猴桃采后研究的重要主题之一。前期已有大量论文报道了猕猴桃果实后熟软化过程的生理变化及相关基因。本文在前人研究的基础上,以美味猕猴桃’海沃德’（Actinidia deliciosa ’Hayward’,’HWD’）和中华称猴桃’红阳’（Actinidia chinensis ’Hongyang’,’HY’）为材料,以果实软化过程果胶降解为主要关注对象,利用乙烯（ETH）以及1-甲基环丙稀（1-MCP）处理,分析果实软化过程不同类型果胶等的变化规律;分析了果胶降解相关的两个重要酶（多聚半乳糖醛酸酶,PG;β-半乳糖苷酶,β-gal）的活性及其变化规律;基于猕猴桃基因组数据库,分离了 PG和β-gal编码基因,分析了它们的表达情况,并鉴别了参与猕猴桃果胶降解的重要候选成员;利用酵母单杂交筛库体系和烟草双荧光素酶体系,初步探究重要候选成员之一 AdPG1的转录调控。主要研究结果如下:1.后熟软化过程猕猴桃果实细胞壁多糖组分分析。重点分析了不同类型果胶的变化规律,发现两种猕猴桃果实中水溶性果胶（WSP）含量逐渐上升,而离子型果胶（ISP）和共价结合型果胶（CBP）含量均呈下降趋势。同时,细胞壁物质含量、半纤维素和纤维素成分含量均呈下降趋势。ETH和1-MCP处理可分别加速和减缓上述过程,与果实软化显著相关。***和β-gal的活性分析。两个品种中,随着果实的软化,PG和β-gal活性均呈上升趋势,ETH处理可显著诱导PG和β-gal活性,而1-MCP处理显著抑制了 PG和β-gal活性。结果表明,PG和β-gal与果胶降解和果实软化显著相关。***和β-gal编码基因分离与表达分析。基于’红阳’基因组数据库和RNA-seq,分离得到13个PG新基因,分别命名为AdPG1-13,聚类分析发现AdPG1和已报道的CkPGC同源性较高;获得了 9个β-gal基因,分别命名为Adgal1-9,其中Adgal3全长序列包含了前期报道的β-gal片段序列。通过表达分析,获得了与猕猴桃果实后熟软化密切相关的PG和gal成员。CkPGC和AdPG1受ETH诱导（’HWD’和’HY’果实）,且受1-MCP抑制（’HWD’）,它们的基因表达与酶活性的相关系数（R2）在’HWD’达到0.861和0.813,在’HY’中为0.738和0.863。而其他PG成员不仅有酶活性变化的相关性较小,且绝对表达量也较低。与PG基因不同,β-gal基因在两个品种中表达不尽相同。’HWD’中Adgal1、2、5,8与果实软化密切相关,既受ETH上调且受1-MCP下调。综合绝对表达量和相关系数,上述基因中Adgal1可能是影响β-gal活性和’HWD’果实软化的最重要候选β-gal基因。与’HWD’不同,’HY’果实中Adgal1虽受ETH上调,但其表达与酶活性的相关系数（R2）仅为0.418。通过上述分析,CkPGC、AdPG1和Adgal1是参与猕猴桃果实后熟软化的重要候选基因,但不同成员在不同品种中可能存在差异。4.利用酵母单杂筛库,初步分析了参与调控AdPG1的转录因子。利用AdPG1的启动子序列进行酵母单杂筛库实验,获得3个转录因子:AdBPC1,AdBPC2,AdBPC3。酵母单杂单一验证表明AdBPC2和AdBPC3可结合AdPG1启动子。利用双荧光素酶体系发现,AdBPC2和AdBPC3对AdPG1的启动子具有抑制效应。上述结果表明,转录因子可能参与了软化相关基因调控,但具体机制还有待于深入系统分析。

关键词：猕猴桃软化果胶多聚半乳糖醛酸酶 β-半乳糖苷酶 PG β-gal 转录调控

ROSA26小鼠中枢神经系统半乳糖苷酶的表达与分布

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南京医科大学学报（自然科学版） 2009年第3期29卷 308-311页

作者：刘秀玲苏阳方杰肖明韩群颖丁炯南京医科大学人体解剖学系江苏南京210029

目的:观察成年ROSA26小鼠中枢神经系统半乳糖苷酶(X-gal)的表达与分布。方法:应用X-gal组织化学结合尼氏染色及免疫组织化学双标技术研究β-gal在该嵌合体脑内的表达与分布特征。结果:X-gal组织化学染色显示在该线系小鼠脑和脊髓中均广... 详细信息

目的:观察成年ROSA26小鼠中枢神经系统半乳糖苷酶(X-gal)的表达与分布。方法:应用X-gal组织化学结合尼氏染色及免疫组织化学双标技术研究β-gal在该嵌合体脑内的表达与分布特征。结果:X-gal组织化学染色显示在该线系小鼠脑和脊髓中均广泛表达转基因β-gal活性产物,但以灰质为主。X-gal和尼氏双重染色表明,β-gal在神经元、室管膜细胞和脉络丛上皮细胞中均有表达。免疫组化进一步显示β-gal广泛表达于神经元中,但在星形胶质细胞中则未见表达。结论:ROSA26小鼠中枢神经细胞稳定而广泛的表达β-gal,此转基因模式动物将可用于神经细胞培养、移植及其它相关神经生物学研究。

关键词： β-gal X-gal 转基因小鼠中枢神经系统

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BMP-2基因给药修复实验性羊股骨头坏死

中华骨科杂志 2005年第10期25卷 603-607页

作者：陆斌汤亭亭岳冰戴尅戎楼觉人上海第二医科大学附属第九人民医院骨科美国华盛顿大学医学院骨科

目的利用人BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞复合多孔β-磷酸三钙材料治疗股骨头坏死。方法对22只羊建立股骨头缺血性坏死模型。未治疗组4只;治疗组18只于3周后刮除坏死骨组织,右侧植入BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞和多孔... 详细信息

目的利用人BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞复合多孔β-磷酸三钙材料治疗股骨头坏死。方法对22只羊建立股骨头缺血性坏死模型。未治疗组4只;治疗组18只于3周后刮除坏死骨组织,右侧植入BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞和多孔磷酸三钙复合物(BMP-2组),左侧植入β-半乳糖苷酶(β-gal,作为对照基因)基因转染的自体骨髓间充质干细胞和多孔磷酸三钙复合物(β-gal组)。植入后第1、2、3周用ELISA方法测定植入局部的BMP-2蛋白表达水平。植入前、植入后6、10、16周取股骨头标本,观察骨长入情况,并对16周标本行骨形态计量学分析和影像学观察。未治疗组动物于造模后16周摄Χ线片行影像学观察。结果植入后1、2、3周BMP-2组在股骨头局部有BMP-2蛋白的高表达,明显高于β-gal组。植入前软骨下骨部位出现大量空骨陷窝,骨髓腔纤维化。植入后6、10、16周BMP-2组均有明显成骨,16周时坏死区被完全修复;β-gal组只有较少新骨形成,16周时坏死区仍多为纤维组织。BMP-2组新骨体积明显大于β-gal组。造模后16周未治疗组双侧股骨头塌陷;植入后16周β-gal组股骨头存在囊状密度减低区;BMP-2组股骨头形态规则,无塌陷。结论BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞与多孔β-磷酸三钙复合后可修复早期股骨头坏死。

关键词：股骨头坏死山羊间质干细胞骨形态发生蛋白类磷酸钙类 BMP-2基因给药早期股骨头坏死自体骨髓间充质干细胞修复多孔磷酸三钙实验性 β-gal 股骨头缺血性坏死 β-磷酸三钙

高光敏性β-半乳糖苷酶小分子探针的构建及其生物应用的研究

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高光敏性β-半乳糖苷酶小分子探针的构建及其生物应用的研究

作者：刘荣兰川北医学院

学位级别：硕士

目的:基于高性能小分子荧光团（OTPP、TAB）的发光特性,构建一系列水溶性好、能快速地检测β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-gal）的高光敏性小分子荧光探针,用于光动力治疗（photodynamic therapy,PDT）选择性地诱导卵巢癌细胞凋亡... 详细信息

目的:基于高性能小分子荧光团（OTPP、TAB）的发光特性,构建一系列水溶性好、能快速地检测β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-gal）的高光敏性小分子荧光探针,用于光动力治疗（photodynamic therapy,PDT）选择性地诱导卵巢癌细胞凋亡成像及抗菌治疗。方法:首先,本文构建以半乳糖单元为β-gal识别位点基团,OTPP、TAB为荧光团的小分子探针。通过光谱分析测定探针与不同浓度的β-gal响应、生物选择性以及pH影响的实验;其次,测试探针的细胞毒性,并通过荧光共聚焦研究它们溶酶体的共定位能力和选择性地卵巢癌SKOV-3细胞成像中的应用。随后,采用商用二氯荧光素二乙酸酯（HDCF-DA）作为监测光诱导活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成的指标来评估各探针的光敏性。通过细胞实验,考察探针的细胞毒性和在SKOV-3细胞内的ROS生成能力,以及通过细胞凋亡测试来验证探针是否能够作为有效的PDT试剂,选择性地诱导SKOV-3细胞的凋亡或坏死。此外,采用平板菌落计数法进一步检测探针的抗菌性能。结果:设计并成功合成了以下探针:OTPP-6-gal、TAB-6-gal,TAB-4-gal和TAB-2-gal。实验发现,上述探针皆可快速识别β-gal,当β-gal浓度为25 U/m L时,探针的荧光强度增加,且4分钟内快速响应完成;通过生物选择性、pH、水溶性测试,均证实探针TAB-4-gal更适于检测卵巢癌细胞环境下溶酶体中的β-gal活性;溶酶体共定位、竞争性抑制剂和CCK-8实验结果,证实了所有探针都能特异性地检测细胞内β-gal,TAB-4-gal可以用作特定卵巢癌细胞成像的最优异探针。实验还发现,上述探针皆具有低细胞毒性和高光敏性,特别是OTPP-6-gal和TAB-4-gal。在低强度光（仅1.5 m W/cm）光照5分钟,即可在细胞内产生大量ROS,并选择性地诱导卵巢癌细胞凋亡或坏死。此外,细菌实验表明两个探针光照5分钟后,均表现出了明显抗菌效果。结论:本文设计并合成了一系列高光敏性小分子探针,克服了以前报道的一些荧光探针在水溶性及响应率方面的局限性。实验表明TAB-4-gal是靶向选择性卵巢癌细胞性能最佳的荧光探针。此外,由于形成的分子内电荷转移使其还具有高光敏性。探针OTPP-6-gal和TAB-4-gal不仅能选择性地诱导卵巢癌细胞凋亡或坏死,还可用作体外抗菌的PDT剂,这对卵巢癌的早期诊断和后续治疗以及抗菌治疗具有重要意义。

关键词： β-gal 小分子探针细胞成像抗菌 PDT

番木瓜β-半乳糖苷酶同源基因启动子克隆与功能鉴定

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番木瓜β-半乳糖苷酶同源基因启动子克隆与功能鉴定

作者：梁栋福建农林大学

学位级别：硕士

本研究在前人对番木瓜β-gal多基因家族研究的基础上,采用IPCR技术进行了三次步移,获得了β-gal同源基因5'端和启动子区,并对其进行了功能鉴定,为将来采用启动子区RNAi技术研究β-gal多基因家族的各个成员在番木瓜果实软化中的作用大小... 详细信息

本研究在前人对番木瓜β-gal多基因家族研究的基础上,采用IPCR技术进行了三次步移,获得了β-gal同源基因5'端和启动子区,并对其进行了功能鉴定,为将来采用启动子区RNAi技术研究β-gal多基因家族的各个成员在番木瓜果实软化中的作用大小,延长番木瓜果实货价期奠定了基础。具体结论如下:1、完成了番木瓜β-gal同源基因5'端和启动子的克隆和序列分析。利用IPCR技术克隆出番木瓜β-gal同源基因5'端和启动子,并登陆GenBank,序列号为EF694758。利用在线软件Neural Netwok Promoter Prediction对基础启动子区和转录起始位点进行预测,结果发现在195-245bp,552-602bp,560-610bp和591-641bp的位置可能存在基础启动子序列。并采用启动子预测软件Plant CARE和PLACE对该序列进行分析,分析发现,其中具有大多数高等植物启动子的保守元件,并具有一些和果树成熟有关的调控元件,如ABA反应元件。2、完成了启动子功能的初步检测。构建了启动子缺失表达载体,通过农杆菌介导,进行了GUS瞬时检测,初步说明β-gal同源基因启动子在番木瓜果实中具有启动功能。通过染色时间和染色程度推测:在603bp和724bp之间可能存在抑制启动的元件。

关键词：番木瓜 β-gal 反向PCR 融合表达载体 GUS瞬时表达

衰老相关-β-半乳糖苷酶靶向给药系统的研究

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衰老相关-β-半乳糖苷酶靶向给药系统的研究

作者：甄臻华东师范大学

学位级别：硕士

细胞衰老与癌症及特发性肺纤维化（IPF）等多种年龄相关的疾病有关。清除异常积累的衰老细胞对这些疾病的治疗具有积极意义。抗衰老药物由于靶向性差在临床治疗中受到限制。基于衰老细胞β-gal活性升高的特点设计靶向β-gal的抗衰老给... 详细信息

细胞衰老与癌症及特发性肺纤维化（IPF）等多种年龄相关的疾病有关。清除异常积累的衰老细胞对这些疾病的治疗具有积极意义。抗衰老药物由于靶向性差在临床治疗中受到限制。基于衰老细胞β-gal活性升高的特点设计靶向β-gal的抗衰老给药系统,有望实现对衰老细胞的选择性清除,提高药物的安全性。本文以构建β-gal活化的抗衰老前药为目的,先从衰老检测探针的角度进行理论上的验证,再通过抗衰老前药探索初步建立抗衰老靶向给药系统。首先,我们合成了一种新型的水溶性苯并噻唑染料HT-4a,具有荧光强度高、斯托克斯位移大、稳定性好的优点。随后,利用HT-4a构建了β-gal响应的“OFF-ON”荧光增强型季铵盐衰老检测探针FR-2a。酶促实验证明了季铵盐连接子可通过1,6裂解释放染料,细胞荧光成像实验证明了探针FR-2a对衰老细胞的选择性,为抗衰老前药的构建提供了理论基础。随后,我们按照衰老检测探针的构建思路,制备了达沙替尼的前药TR-8,并通过磺丁基-β-环糊精对前药TR-8进行包合制备注射用冻干粉。TR-8能够在β-gal的催化下迅速释药,对非衰老细胞的毒性进一步减小,但对衰老细胞的靶向清除能力有限。为了进一步提高靶向性,我们设计了新型支链化linker 3-14。3-14不仅合成工艺路线简单、适合大量制备,而且能够连接靶向衰老细胞表面的特异性蛋白配体或抗体。利用3-14制备了达沙替尼前药FA-5b-1和OTX-015前药FA-7a-1,并证明了新型支链化linker 3-14对β-gal催化释放原药过程无影响。为改善FA-7a-1的水溶性,同时验证前药支链处引入靶向配体的可行性,我们在FA-7a-1的支链处引入PEG片段合成了FA-10a。酶促实验证明,引入新片段对酶释药不会产生影响。目前进一步的研究实验仍在进行中。

关键词：细胞衰老 β-gal 荧光探针季铵盐连接子前药支链化linker

高脂状态下血管靶向基因给药系统相关问题的研究

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高脂状态下血管靶向基因给药系统相关问题的研究

作者：张蓉四川大学

学位级别：硕士

目的比较常用的两种报告基因β-gal及GFP在大鼠多器官组织中的内源性表达及不同血脂水平下的变化,为构建基因靶向给药系统时报告基因的合理选择提供实验依据。方法 16只SD雄性大鼠,随机分为正常和高脂2组,每组8只,以喂养法建立高血脂... 详细信息

目的比较常用的两种报告基因β-gal及GFP在大鼠多器官组织中的内源性表达及不同血脂水平下的变化,为构建基因靶向给药系统时报告基因的合理选择提供实验依据。方法 16只SD雄性大鼠,随机分为正常和高脂2组,每组8只,以喂养法建立高血脂动物模型。试验结束时,大鼠颈椎脱位处死,取11个器官组织,常规冰冻切片,采用酶组化法检测各组织中β-gal的活性,普通显微镜下观察、拍照;采用荧光法检测各组织中GFP的荧光强度并拍照。结果正常及高脂大鼠的肝脏、脾脏、肺、肾脏、淋巴结、甲状腺、空肠、脑均呈β-gal阳性,血管(胸主动脉)、心脏、膈肌呈β-gal阴性;血管(胸主动脉)、肝脏、脾脏、肺、肾脏、膈肌、甲状腺、有自发荧光;心脏、脑、淋巴结、空肠无自发荧光,血脂水平对结果无明显影响。结论 1 在经典X—gal染色条件下,正常大鼠血管、心脏、膈肌为阴性表达,可用表达β-galLacZ基因作报告基因;而肝脏、脾脏、肺、肾脏、淋巴结、甲状腺、脑、

关键词：报告基因 β-gal GFP 大鼠内源性表达血脂

癌细胞相关生物酶荧光探针的设计、合成及性能研究

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癌细胞相关生物酶荧光探针的设计、合成及性能研究

作者：李敏济南大学

学位级别：硕士

酶对生命至关重要,特别是在疾病发展和药物作用方面,但由于我们还不能直接观察其内部的相互作用,所以开发出将这些过程转化为可读信息的工具对于更好地了解酶以及更有效地对抗疾病是至关重要的。目前,最理想的是能够直接在体内监测酶活... 详细信息

酶对生命至关重要,特别是在疾病发展和药物作用方面,但由于我们还不能直接观察其内部的相互作用,所以开发出将这些过程转化为可读信息的工具对于更好地了解酶以及更有效地对抗疾病是至关重要的。目前,最理想的是能够直接在体内监测酶活性的敏感小分子探针。荧光成像是一种新兴的生物成像技术,因其灵敏度高、成本低、实时成像、非侵入性等优点而引起了人们的广泛关注。特别是,以生物酶为目标的荧光探针可以用于实时监测体内的生物过程。由于生物样品的不稳定和复杂性使得研究过程存在多种未知的问题,最常见的是生物自发荧光和自吸收带来的干扰,所以开发出能够有效解决这些干扰的荧光探针用于生物分析仍是一项具有重要意义的挑战。比率型荧光探针因其供体和受体的两个荧光信号自我校正,减少了外界带来的误差,并且利用明显的色差实现比色成像,因此此类探针有一定的发展前景。此外,双光子荧光探针和近红外荧光探针在生物成像方面具有独特的优势,如对生物样品的损伤更小,对组织的穿透力更强,可有效的防止细胞和组织的自吸收和自身荧光的干扰,因此在生物成像领域具有更广阔的前景。本文以与各种疾病相关的生物酶为研究对象,利用FRET和ICT的荧光机制构建了比率型和双光子的荧光探针用于检测β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal),硝基还原酶(Nitroreductase,NTR)和肠道碱性磷酸酶(Intestinal alkaline phosphatase,IAP)等,并成功应用于生物成像。研究内容如下:(1)设计并合成了一种基于FRET-ICT协同检测β-gal的比率型荧光探针CG,该探针具有快速响应(β-gal具有较高的亲和力。该探针不仅可以检测过表达细胞系中的β-gal,还可以检测瞬态表达细胞系中的β-gal也可以在体外监测β-gal,为以进一步发现生物机体的生理和病理功能提供了一种超灵敏的成像工具。(2)设计并合成了一种检测NTR的红光发射双光子荧光探针P1,该探针具有较高的灵敏度(LOD为0.00245 U/L),且对NTR具有较高的选择性。在生物成像方面,该探针不仅实现了以单光子和双光子模式检测Hep G2细胞(缺氧培养)中NTR,而且可以检测缺氧培养肿瘤组织中的NTR,为进一步探索NTR在癌细胞中的生理和病理功能提供了一种有力工具。(3)设计并合成了一种特异性检测IAP的近红外荧光探针DLOH,该探针的激发和发射波长均可进入近红外(λ=670 nm,λ=725 nm)范围。光学数据显示该探针具有非常低的LOD和高的IAP亲和力。此外,还具有较高的选择性和光稳定性。在生物成像方面,实现了结肠癌细胞内IAP的时间分辨成像。另外,该探针还具有检测经LPS处理的斑马鱼体内IAP的能力,所以该探针可能是深入探索IAP生理功能的有力工具。

关键词：荧光探针 β-gal NTR IAP 性能研究