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NT-3基因转染的大鼠骨髓干细胞在树枝状两亲性肽凝胶中培养向神经元分化的研究

NT-3基因转染的大鼠骨髓干细胞在树枝状两亲性肽凝胶中培养向神经...

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作者：蒋星海南昌大学

学位级别：硕士

目的:研究将NT-3基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞接种于树枝状两亲性肽凝胶内部行三维培养,大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化情况。方法:取4-6周SD大鼠无菌下分离、培养骨髓间充质干细胞并鉴定。以巨细胞病毒作为启动子,构建1个携带NT-... 详细信息

目的:研究将NT-3基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞接种于树枝状两亲性肽凝胶内部行三维培养,大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化情况。方法:取4-6周SD大鼠无菌下分离、培养骨髓间充质干细胞并鉴定。以巨细胞病毒作为启动子,构建1个携带NT-3基因的腺病毒载体即AdvNT-3,表达绿色荧光。以不同感染复数(MOI值)将AdvNT-3转染大鼠骨髓间充质干细胞,转染2天后观察绿色荧光蛋白表达情况确定最佳病毒感染复数。以AdvNT-3转染大鼠骨髓干细胞即为NT-3-BMSC。1 wt%多肽溶液和细胞悬液混合,细胞分布于凝胶内部形成三维培养体系。实验分三组,A组:BMSC二维培养组;B组:NT-3-BMSC二维培养组;C组:NT-3-BMSC+凝胶三维培养组;三组分别于体外培养7天后采用免疫荧光及qPCR检测神经元特异性标记物MAP-2、β-iii Tubulin的表达情况。结果:分离培养的细胞通过流式细胞仪鉴定为骨髓干细胞。病毒转染骨髓间充质干细胞48h后荧光显微镜下观察有绿色荧光表达,且随着MOI值增大荧光表达越强烈,MOI=100时,荧光到达峰值,MOI为300时,显微镜下观察部分细胞死亡,因此最佳MOI为100。肽溶液在DMEM/F12触发下形成三维凝胶,肉眼观察呈透明凝胶状,在电镜下观察可见凝胶呈成三维网状纤维。免疫荧光结果显示:A组MAP-2、β-iii Tubulin表达阴性,B组及C组MAP-2、β-iii Tubulin均表达阳性,C组阳性率高于B组。qRCR的结果和免疫荧光的结果相同,B组、C组的神经元特异性标记物MAP-2、β-iii Tubulin相对表达量均较A组升高,且C组的MAP-2、β-iii Tubulin相对表达量均高于B组。因此经过NT-3基因改性BMSCs在三维凝胶中培养,能够促进细胞向神经元方向分化,且三维培养优于二维培养。

关键词：两亲性肽生物支架组织工程脊髓损伤骨髓干细胞三维培养基因转染神经营养因子3(NT-3) 微管相关蛋白2 β-iii微管蛋白

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