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黑曲霉内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究

黑曲霉内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表...

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作者：黄君华中农业大学

学位级别：硕士

内切β-1,4-葡聚糖酶(EC3.***.1.4)是一种重要的工业用酶,广泛应用于饲料工业,酿造业等领域。随着生产的发展,β-1,4-葡聚糖酶需求量日益增加。本实验的主要目的就是,从分泌热稳定性的β-1,4-葡聚糖酶的黑曲霉高产菌株中,克隆该基因,利用... 详细信息

内切β-1,4-葡聚糖酶(EC3.***.1.4)是一种重要的工业用酶,广泛应用于饲料工业,酿造业等领域。随着生产的发展,β-1,4-葡聚糖酶需求量日益增加。本实验的主要目的就是,从分泌热稳定性的β-1,4-葡聚糖酶的黑曲霉高产菌株中,克隆该基因,利用基因工程手段实现高效表达,满足工业生产的需求。实验首先是利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillus niger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1-1#和1-5#,在摇瓶发酵水平上,以0.5%的β-葡聚糖为底物检测,酶活分别达到1 456 U/mL和1 928 U/mL。重组酶最适pH为5.0,最适反应温度为70℃,在70℃时保温30 min后仍然具有90%以上的活力。为了进一步提高表达量,根据毕赤酵母偏爱的密码子优化来源于*** L3的内切β-1,4-葡聚糖酶的DNA序列,共改变193个碱基,G+C%由54%下降到44.22%。设计了14对寡聚核苷酸引物,采用重叠延伸PCR三步法获得全长基因序列共改变。将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9k-syn-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板以及摇瓶筛选,得到重组毕赤酵母工程菌2-7#。摇瓶发酵条件下,以0.5%的葡聚糖和1%的CMC-Na为底物检测,酶活分别达到3 658 U/mL和591.9 U/mL;采用50 L发酵罐进行发酵,酶活则分别达到65 649.6 U/mL和39 728.32 U/mL。

关键词：黑曲霉 β-1,4-葡聚糖酶毕赤酵母密码子优化表达

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杜仲β-1,4葡聚糖酶基因克隆及酵母工程菌的制备

杜仲β-1,4葡聚糖酶基因克隆及酵母工程菌的制备

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作者：王润英贵州大学

学位级别：硕士

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是杜仲科杜仲属落叶乔木,是一种名贵的产胶植物和中药材。杜仲是雌雄异株植物。杜仲雄花茶是营养成分和天然活性成分极其丰富的饮品。杜仲胶有很好的绝缘性,且耐酸、耐碱及耐海水缓蚀,可生产高强度海底... 详细信息

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是杜仲科杜仲属落叶乔木,是一种名贵的产胶植物和中药材。杜仲是雌雄异株植物。杜仲雄花茶是营养成分和天然活性成分极其丰富的饮品。杜仲胶有很好的绝缘性,且耐酸、耐碱及耐海水缓蚀,可生产高强度海底电缆、制作高强度粘合剂等。杜仲雌株种皮杜仲胶含量丰富、提取率高、胶杂质少。杜仲胶提取时通常选用杜仲种皮,而在药用方面希望获得更多的雄株。因此,结合其生产用途,杜仲的种植具有一定的性别偏好性。然而杜仲通常种植十年后才开花从而分辨其性别。因此,杜仲雌雄株选育存在困难。嫁接是一种无性繁殖技术,嫁接对性别的选育已在生产上投入应用。嫁接的存活率受砧木和接穗细胞融合程度的影响。研究发现,β-1,4-葡聚糖酶有助于嫁接植物砧木和接穗的细胞融合。然而,在植物中提取β-1,4-葡聚糖酶过程繁琐、提取困难、杂质多、成本高。酵母工程菌在表达外源蛋白时容易操作、易于纯化、成本较低、活性较高并且可大规模生产。毕赤酵母表达系统是一种常用的蛋白表达系统,其优势在于可以对表达的蛋白进行翻译后修饰,相较于原核表达系统能够得到生物活性较高的蛋白。此外,它的蛋白得率也相对较高。因此,本研究旨在开发一款酵母工程菌来生产提高嫁接成活率的酶,为嫁接提供辅助工具。基于此目的,本研究拟通过毕赤酵母表达系统来表达杜仲β-1,4-葡聚糖酶,并将β-1,4-葡聚糖酶应用于杜仲嫁接,取得了以下的结果:1、杜仲β-1,4葡聚糖酶基因克隆及生物信息学分析本研究通过RT-PCR克隆技术,成功获得杜仲中编码β-1,4-葡聚糖酶的基因,该基因全长1917 bp,编码638个氨基酸。通过分析,此基因所编码蛋白的分子量为70.20 KDa,第84-106个氨基酸之间存在一个跨膜结构域,功能结构域位于121-601个氨基酸之间,共有七个糖基化位点,无信号肽。蛋白的二级结构预测结果显示,α螺旋所占比例为31.94%,β转角占比1.88%,无规则卷曲所占比例为52.82%。蛋白理化性质预测结果显示,该蛋白等电点为5.63,总负电荷残基数(Asp+Glu)为71,正电荷的残基(Arg+Lys)为55。在蛋白稳定性方面,不稳定指数为41.74,这个蛋白是不稳定蛋白。平均亲水指数为-0.313,为亲水性蛋白。2、杜仲β-1,4-葡聚糖酶酵母工程菌的制备基于生物信息学分析对杜仲β-1,4-葡聚糖酶基因进行优化并创制酵母工程菌。分析结果显示,其功能结构域区间外存在一个跨膜结构域,为提高酵母工程菌表达成功率,将目标蛋白跨膜结构域去掉后对C端胞外段进行表达。依据毕赤酵母密码子偏好性优化编码杜仲β-1,4-葡聚糖酶的密码子,以使其在酵母工程菌中能更好的表达。将优化的基因构建在带有信号肽的载体p PIC9K上,然后将其转入毕赤酵母菌株GS115中。用Western Blot检测阳性菌株的蛋白表达情况。结果显示,酵母工程菌在温度28.5℃、转速220 rpm、诱导培养基甲醇添加量为1%的条件下诱导70h可以表达杜仲β-1,4-葡聚糖酶。3、杜仲β-1,4-葡聚糖酶的表达及纯化通过检测发现目标蛋白的分子量为130-250 KDa之间,而所预测的分子量为60 KDa,说明所表达蛋白可能以多聚体形式出现,并且SDS-PAGE和Western Blot图显示所表达蛋白有很强的糖基化。此结果与此酶在天然条件下为多聚体并且有很强的糖基化特点相符。蛋白质谱结果显示共鉴定到了24条多肽,蛋白质序列覆盖率达到67%。结合以目标蛋白融合的6X His标签为抗原进行蛋白免疫印迹,通过特异性抗体检测出蛋白条带的表达情况,表明表达出来的蛋白是目标蛋白。对毕赤酵母工程菌分泌表达β-1,4-葡聚糖酶发酵条件进行优化。结果表明,诱导96 h后即可终止发酵;诱导初始p H最佳值为6;诱导温度最佳值为28℃;最佳甲醇添加量为1.5%。在最优发酵条件下对毕赤酵母工程菌诱导表达β-1,4-葡聚糖酶进行30 L发酵培养。粗酶液用Ni-NTA进行蛋白分离纯化。纯化后蛋白SDS-PAGE结果显示蛋白条带单一。结合以目标蛋白融合的6XHis标签为抗原进行蛋白免疫印迹,通过特异性抗体检测出蛋白条带的表达情况,表明纯化的蛋白即是目标蛋白。目标蛋白酶活为286.35 U/ml。对30 L发酵液纯化得到的目标蛋白进行蛋白冻干,共得到29.46 g蛋白粉末。4、β-1,4-葡聚糖酶在杜仲嫁接中的应用有研究表明,β-1,4-葡聚糖酶有助于嫁接植物砧木和接穗细胞融合,从而提高嫁接的存活率。本研究将发酵产生的β-1,4-葡聚糖酶应用于杜仲嫁接,为了进行对照同时也将商品化β-葡聚糖酶(β-1,3-葡聚糖酶和β-1,4-葡聚糖酶混合物)用于杜仲嫁接。结果显示,与对照组相比,实验的酶浓度都能提高杜仲嫁接的成活率,其中在最高发芽率的情况下,所用的杜仲β

关键词： β-1,4-葡聚糖酶毕赤酵母蛋白表达杜仲

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本氏烟草来源的NbGH9B3蛋白表达与纯化研究

本氏烟草来源的NbGH9B3蛋白表达与纯化研究

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作者：何黎冰深圳大学

学位级别：硕士

跨种植物嫁接的不相容性一直都是农业嫁接中的关键问题,同种植物嫁接易于存活,而亲缘关系远的植物之间嫁接常常会导致植物死亡,克服物种间嫁接的不相容性对促进未来农业生产具有重大意义。研究人员发现嫁接存活的植物通常伴随着gh9b3基... 详细信息

跨种植物嫁接的不相容性一直都是农业嫁接中的关键问题,同种植物嫁接易于存活,而亲缘关系远的植物之间嫁接常常会导致植物死亡,克服物种间嫁接的不相容性对促进未来农业生产具有重大意义。研究人员发现嫁接存活的植物通常伴随着gh9b3基因表达的上调,尤其是在植物细胞壁的融合阶段,该基因的活跃度显著上升,但跨种嫁接时gh9b3基因无上调现象,伴随着嫁接失败。茄科植物的嫁接相对于别的物种有一定优势,本氏烟草Nicotiana benthamiana(Nb)可以与多种植物建立跨种嫁接关系,所编码β-1,4-葡聚糖酶的NbGH9B3在嫁接中可以使损伤的细胞壁疏松,有促进组织粘附的能力,使细胞壁得以重建从而促进嫁接的成功。本论文研究开展了 NbGH9B3蛋白的表达及纯化研究,为后续的结构与功能解析打下了基础,有望进行更广泛的物种之间嫁接。在第一部分工作中,采用最常见的原核生物大肠杆菌来表达重组蛋白,对NbGH9B3编码基因的cDNA序列进行了密码子优化和商业合成。尝试了以下几种方法:(1)通过添加不同浓度的葡萄糖山梨醇改变细胞的渗透压;(2)通过降低诱导剂IPTG的浓度来减少蛋白的表达量,减缓表达速度从而使蛋白折叠缓慢;(3)通过添加分子伴侣,并且尝试不同助溶标签如TrxA、GST、NusA、MBP、SUMO、Trigger Factor等;(4)考虑到纯化标签可能会对蛋白的表达有所影响,尝试改变His纯化标签在NbGH9B3蛋白两端的位置。通过以上方法成功得到了NbGH9B3蛋白在大肠杆菌中的重组表达,遗憾的是蛋白均为包涵体,无法开展后期的纯化实验。鉴于NbGH9B3来源于植物本氏烟草,可能存在翻译后修饰,故考虑更换为本氏烟草进行表达。在第二部分工作中,采用农杆菌介导的瞬时表达方法来构建工程菌株,通过农杆菌侵染法在本氏烟草叶片中瞬时表达NbGH9B3蛋白。逆转录PCR技术证实NbGH9B3基因在烟草叶片中已成功转录,对照质粒的GUS染色测试酶活证实基因的转入与侵染烟草过程操作无误,然而SDS-PAGE以及Western blot技术证实NbGH9B3蛋白在本氏烟草中无表达。在第三部分工作中,采用真核生物毕赤酵母作为表达宿主,电转化法将NbGH9B3基因整合于酵母染色体上,通过甲醇来诱导NbGH9B3蛋白的表达。经SDS-PAGE和Western blot验证证实NbGH9B3蛋白成功表达,在上清液中有可溶性蛋白。

关键词：跨种嫁接 β-1,4-葡聚糖酶 NbGH9B3蛋白蛋白表达蛋白纯化

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