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小菜蛾β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP基因的克隆与表达

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福建师范大学学报（自然科学版） 2017年第5期33卷 31-38页

作者：陈少威吴程蔡斌斌杨梅福建师范大学生命科学学院福建福州350117

为研究小菜蛾的先天免疫机制,从小菜蛾幼虫体内克隆得到一条β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan recognition protein,βGRP)基因,利用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白的理化性质、疏水性、结构等方面进行分析与预测,同时构建系... 详细信息

为研究小菜蛾的先天免疫机制,从小菜蛾幼虫体内克隆得到一条β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan recognition protein,βGRP)基因,利用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白的理化性质、疏水性、结构等方面进行分析与预测,同时构建系统进化树.为研究该蛋白的功能,以大肠杆菌为宿主表达该基因,利用镍柱纯化目的蛋白.实验结果表明,该序列的开放阅读框长1 287 bp,编码428个氨基酸,编码的蛋白质理论分子质量约48.13 ku,理论的等电点为6.18,为亲水性蛋白;进化树分析表明,该蛋白跟家蚕、柞蚕、菜青虫、棉铃虫、冬尺蠖蛾、粉纹夜蝶归为同一大类;经大肠杆菌表达的蛋白均为不溶性的包涵体,通过对包涵体的变性及镍柱的纯化,得到了浓度较高的可溶性目的蛋白.

关键词：小菜蛾 β-1,3-葡聚糖识别蛋白先天免疫

小金蝠蛾幼虫β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP1基因的分子特征与生物信息学分析

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安徽农业科学 2021年第19期49卷 95-98,101页

作者：贺元川罗昌树游华建陈仕江重庆市中药研究院重庆400065 甘孜州康定贡嘎中华虫草产业有限责任公司四川康定626000

[目的]探索冬虫夏草寄主昆虫小金蝠蛾幼虫的β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP1基因的结构特征与进化关系。[方法]通过PCR法克隆获得小金蝠蛾幼虫βGRP1基因的编码序列,并采用Protparam、NetPhos 2.0 Server cDNA、MEGA等软件分析βGRP1蛋白... 详细信息

[目的]探索冬虫夏草寄主昆虫小金蝠蛾幼虫的β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP1基因的结构特征与进化关系。[方法]通过PCR法克隆获得小金蝠蛾幼虫βGRP1基因的编码序列,并采用Protparam、NetPhos 2.0 Server cDNA、MEGA等软件分析βGRP1蛋白的理化特征和进化分析。[结果]小金蝠蛾幼虫βGRP1基因编码序列1593 bp,推断可编码530氨基酸组成的蛋白,该蛋白为分泌型蛋白,含有20个氨基酸的信号肽,包含2个功能结构域,该结构域与葡聚糖的识别密切相关;同源分析和分子系统进化树分析表明,鳞翅目昆虫中的βGRPs基因家族分为4个进化分枝,其中小金蝙蝠蛾与勾蝠蛾为单独的一个进化分枝,小金蝠蛾幼虫βGRP1进化较钩蝠蛾早,介于I型和Ⅲ型分支。[结论]该蛋白具有识别β-1,3-葡聚糖的结构域,并可能通过丝氨酸磷酸化激活酚酶源级联系统,启动免疫,为进一步探索βGRP1蛋白的免疫功能奠定基础。

关键词：冬虫夏草小金蝠蛾 β-1,3-葡聚糖识别蛋白先天免疫

西花蓟马被球孢白僵菌侵染后βGRPs基因的鉴定及表达分析

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中国生物防治学报 2017年第2期33卷 206-212页

作者：赵倩倩张桃王小奇王海鸿中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 成都市植物检疫站成都610041 沈阳农业大学植物保护学院沈阳110000

本文旨在鉴定西花蓟马β-1,3-葡聚糖识别蛋白(FoβGRP)基因,分析其在受到球孢白僵菌侵染后的表达模式,探讨其在西花蓟马先天免疫过程中的作用。根据高通量转录组测序结果,比对非冗余核苷酸数据库,筛选E值小于10^(-5)的基因为目标基因,... 详细信息

本文旨在鉴定西花蓟马β-1,3-葡聚糖识别蛋白(FoβGRP)基因,分析其在受到球孢白僵菌侵染后的表达模式,探讨其在西花蓟马先天免疫过程中的作用。根据高通量转录组测序结果,比对非冗余核苷酸数据库,筛选E值小于10^(-5)的基因为目标基因,对筛选出的FoβGRPs基因编码的蛋白序列进行结构分析鉴定,通过构建系统进化树分析其与其他物种同源基因的进化关系,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测分析不同活性球孢白僵菌孢子侵染西花蓟马成虫后FoβGRPs的表达模式。筛选出3条βGRP基因,分别命名为FoβGRP1、FoβGRP2和FoβGRP3,其编码的蛋白序列均含有βGRP蛋白家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域;FoβGRP1与FoβGRP2和FoβGRP3分属两类不同的FoβGRP;在检测的60 h内,与对照相比,西花蓟马被高致病性和低致病性真菌菌株侵染后,3条FoβGRP基因的诱导表达量均在12 h时最高,而且对于同一基因来说,高活性真菌菌株对其的诱导水平均高于低活性的真菌菌株;经灭活真菌处理的西花蓟马体内3条FoβGRP基因表达量均呈不同程度的下降。3条FoβGRP基因可能参与到西花蓟马先天免疫反应中。本文为后续深入研究其在西花蓟马先天免疫反应中的作用奠定了基础。

关键词：西花蓟马 β-1,3-葡聚糖识别蛋白先天免疫反应

烟粉虱模式识别受体βGRPs的先天免疫应答

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植物保护学报 2016年第1期43卷 48-54页

作者：于洁王登杰雷仲仁王海鸿中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

为探索烟粉虱的β-1,3-葡聚糖识别蛋白（BtβGRP）在烟粉虱先天免疫过程中的重要作用,对烟粉虱中鉴定的3个BtβGRPs基因编码的蛋白质进行结构分析,并与其它物种的23个同源蛋白进行系统进化分析,同时通过实时荧光定量PCR（quantitative r... 详细信息

为探索烟粉虱的β-1,3-葡聚糖识别蛋白（BtβGRP）在烟粉虱先天免疫过程中的重要作用,对烟粉虱中鉴定的3个BtβGRPs基因编码的蛋白质进行结构分析,并与其它物种的23个同源蛋白进行系统进化分析,同时通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）检测分析球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态不同时间点后BtβGRPs的时间表达模式。结果显示：经鉴定3个BtβGRPs蛋白序列均含有βGRP家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域;且3个BtβGRPs独自聚在进化树的一支上,可能参与烟粉虱特有的级联路径;3个BtβGRPs基因在不同虫态和不同诱导时间点与对照相比,除BtβGRP3在卵期未表达外,均有上调表达趋势,但诱导程度不同;成虫诱导24~36 h后达到峰值,比卵和若虫稍晚,可能是由于烟粉虱成虫体表有白色蜡粉等物质,延迟了球孢白僵菌对虫体的侵染。研究表明3个BtβGRPs蛋白可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生防的新靶标。

关键词：烟粉虱 β-1,3-葡聚糖识别蛋白实时荧光定量PCR 免疫反应

Serpin2和βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能研究

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Serpin2和βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能研究

作者：赵雅扬州大学

学位级别：硕士

昆虫的天然免疫分为细胞免疫(cellularimmunity)和体液免疫(humoral immunity)。昆虫的细胞免疫是指多种血细胞参与的防卫反应,包括吞噬作用(cytophagy)、结节形成(nodulation)和细胞包囊(encapsulation);体液免疫涉及抗菌肽的诱导、酚... 详细信息

昆虫的天然免疫分为细胞免疫(cellularimmunity)和体液免疫(humoral immunity)。昆虫的细胞免疫是指多种血细胞参与的防卫反应,包括吞噬作用(cytophagy)、结节形成(nodulation)和细胞包囊(encapsulation);体液免疫涉及抗菌肽的诱导、酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)激活导致的黑化反应(melanization)。丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor,Serpin),是血淋巴中对丝氨酸蛋白酶有抑制作用的一类蛋白质,用来调节昆虫内环境的平衡。β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucanrecognitionprotein,βGRP)作为一种模式识别蛋白,能够识别真菌的细胞壁成分,在昆虫的免疫系统中占有重要地位。本文利用RT-PCR和RACE扩增技术,克隆了亚洲玉米螟幼虫Serpin2基因的全长cDNA序列。该基因全长1447bp核苷酸,其中包含一个1137bp的开放阅读框(ORF),一个163 bp的5'非编码区(5'UTR)和一个147bp的带有加尾信号的3'非编码区(3'UTR)。开放阅读框从第164个核苷酸开始,终止于第1300个核苷酸,共编码378个氨基酸。Of-Serpin2的计算分子量约为41.71kDa,估测等电点pI为5.29。生物信息学分析表明:Of-Serpin2无跨膜结构域,N端无信号肽,不存在糖基化位点,含有39个磷酸化位点,均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明:Of-Serpin2的氨基酸序列与尺蠖Lonomia obliqua Serpin2、甜菜夜蛾 Spodoptera exigua Serpin2、野桑蚕 Bombyx mandarina Serpin2、家蚕 Bombyx mori Serpin2、大斑蝶Daanaus plexippus Serpin2高度同源。三维结果显示,Of-Serpin2有8个α螺旋,3个β折叠。利用RNA干扰技术,研究干扰βGRP3基因后亚洲玉米螟幼虫体内与体液免疫相关基因Serpin1、PAP、PPO等的表达情况,以及对细胞免疫能力的初步影响。以DEPC水处理组和绿色荧光报告蛋白(GFP)处理组为阴性对照,制备了βGRP3和GFP的dsRNA,采用注射方法,分别将βGRP3和阴性对照GFP的dsRNA导入4龄初亚洲玉米螟幼虫体内,采用实时荧光定量PCR检测RNAi后幼虫体内Serpin1、PPO、PAP等免疫相关基因在转录水平的变化,进一步分析RNAi对血淋巴中PO活性的影响,探索βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能。结果表明:将βGRP3基因干扰后72h,亚洲玉米螟幼虫体内该基因的表达量开始明显降低(P蛋白酶)、PPO(酚氧化酶原)的表达量也显著低于对照;干扰后幼虫体内PO酶活性在72 h开始呈现显著下调,这表明Of-βGRP3正调控PO活性,即在PPO级联调控中起重要作用。对干扰后亚洲玉米螟幼虫血细胞观察发现,72h开始,类绛色细胞、浆血细胞和原血细胞的数量开始下降(P0.05),说明宿主昆虫在受到外来入侵物影响时,其血细胞会自行进行免疫调节,以维持宿主昆虫体内的正常生理活动。RNAi后再次注射细菌,发现只注射大肠杆菌处理组的致死中时间(3d)显著大于RNAi处理后二次注菌处理组(1 d),结果表明:βGRP3在昆虫抵抗病原菌侵染中起重要作用。

关键词：亚洲玉米螟丝氨酸蛋白酶抑制因子 β-1,3-葡聚糖识别蛋白 cDNA克隆原核表达荧光定量PCR RNA干扰 PO活性血细胞

白背飞虱模式识别受体βGRP1及βGRP2的结构与功能研究

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白背飞虱模式识别受体βGRP1及βGRP2的结构与功能研究

作者：罗春丽遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:1.研究白背飞虱中β-1,3-葡聚糖识别蛋白(βGRPs)的分子结构特点及在不同发育阶段和不同组织中的发育表达模式;2.研究βGRPs对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的免疫应答作用,为揭示βGRPs在白背飞虱先天免疫中的作用奠定基础。方法:... 详细信息

目的:1.研究白背飞虱中β-1,3-葡聚糖识别蛋白(βGRPs)的分子结构特点及在不同发育阶段和不同组织中的发育表达模式;2.研究βGRPs对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的免疫应答作用,为揭示βGRPs在白背飞虱先天免疫中的作用奠定基础。方法:利用在线数据库及相关软件对βGRP1及βGRP2进行序列特征及进化关系分析;使用qRT-PCR方法明确白背飞虱中βGRP1及βGRP2基因的时空表达模式及被不同细菌诱导后的转录表达水平的变化;通过SDS-PAGE和Western Blot分析纯化后的βGRP1与βGRP2蛋白;用荧光显微镜检测βGRP1与βGRP2对***及***的凝集作用;通过平板生长抑制法和CCK-8法明确βGRP1与βGRP2对***和***生长的抑制作用;通过RNAi技术抑制βGRP1与βGRP2基因的表达,qRT-PCR检测Toll通路及Imd通路基因的表达。结果:1.通过对白背飞虱转录组的比对分析,筛选获得2个βGRP基因,βGRP1和βGRP2。其中,βGRP1蛋白在靠近C端212-557 aa之间存在一个糖苷水解酶结构域(Glyco＿hydrolase＿16,GH16),在第345-556 aa之间存在凝集素/葡聚糖酶结构域。βGRP2蛋白在靠近C端234-541 aa之间存在一个糖苷水解酶结构域GH16,在第318-539 aa之间存在凝集素/葡聚糖酶结构域。Inter Pro GO项分析表明,βGRP1及βGRP2具有水解酶活性,可以参与糖类的结合和水解;2.进化树结果显示,这两个βGRPs与同科目的褐飞虱的亲缘关系最近;3.βGRP1和βGRP2基因在白背飞虱的所有发育阶段和组织中都有表达。其中,βGRP1在若虫的第3天到5龄第2天表达量逐渐增加,然后开始下降,成虫期又逐渐增加。βGRP2在若虫的第2天更为丰富,然后从5龄第2天到成虫的第1天逐渐减少;另外,βGRP1在脂肪体中的表达量最高,其次是肠,而βGRP2在肠中的表达量最高,其次是脂肪体;4.肠和脂肪体中βGRP1及βGRP2基因在***和***诱导后的表达均出现不同程度的增加;5.成功表达并纯化了βGRP1与βGRP2重组蛋白,且重组蛋白βGRP1与βGRP2对***和***具有很强的凝聚力,能够与两种细菌发生凝集;6.平板生长抑制法和CCK-8法实验均显示出重组蛋白βGRP1与βGRP2对***的生长具有明显的抑制作用,而对***的生长则没有明显影响;7.利用注射RNAi技术下调βGRP1与βGRP2的基因表达,再用***感染后可显著下调Toll通路的Toll和Dorsal基因的表达,但对Imd通路的Imd和Relish基因的表达没有明显影响。结论:βGRP1及βGRP2蛋白均具有水解酶活性,可以参与糖类的结合和水解且可能主要参与白背飞虱脂肪体和肠中病原菌感染的免疫应答;βGRP1及βGRP2虽然能与***和***都发生凝集,但只能抑制***的正常生长,并且抑制作用主要通过对Toll信号通路的激活实现。

关键词：白背飞虱 β-1,3-葡聚糖识别蛋白模式识别受体免疫应答