检索结果-南通市图书馆

微生物学通报 2013年第3期40卷 454-463页

作者：曹樱蔡慧农李利君倪辉苏文金集美大学生物工程学院福建厦门361021 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心福建厦门361021 厦门市食品与生物工程技术研究中心福建厦门361021

【目的】从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma)7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础。... 详细信息

【目的】从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma)7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术,克隆得到asy基因全长cDNA序列,将其克隆到表达载体pET32a中,通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量;进一步在E.coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR16Δcrtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链),用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化,鉴定可溶性表达的Asy酶活性。【结果】法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No.DQ002007.1)一致性达到97%,该序列总长1 971 bp,最大开放阅读框为1 614 bp,编码538个氨基酸,在E.coli BL21(DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD;条件优化后转化asy基因的重组菌在26°C、0.5 mmol/L IPTG的条件下诱导时,可溶性融合蛋白比例达85%。与pACCAR16Δcrtx单质粒转化相比,共转化pACCAR16Δcrtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化,其中α-胡萝卜素的含量明显减少,伴随出现了3种新的色素,根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质。【结论】从法夫酵母中克隆得到asy基因,通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达量,经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性。

关键词：法夫酵母 β-胡萝卜素转化酶克隆可溶性表达活性分析

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虾青素法夫酵母β-胡萝卜素转化酶的生物信息学分析

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湖北农业科学 2020年第1期59卷 156-158,193页

作者：张爽许勇童琳张忠东叶红安徽省医学科学研究院合肥230061

以虾青素中法夫酵母酶氨基酸序列为研究对象,利用ProtParam、SignalP、PSORT、ProtScale、SOMPA、PredictProtein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在线预测工具,对其理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行分析。结... 详细信息

以虾青素中法夫酵母酶氨基酸序列为研究对象,利用ProtParam、SignalP、PSORT、ProtScale、SOMPA、PredictProtein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在线预测工具,对其理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行分析。结果表明,该转化酶由557个氨基酸残基构成,是一种无信号肽,具有跨膜结构,定位于细胞色素氧化酶中的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规卷曲为主要的二级结构元件。三级结构以PDB ID 5vcc.1的B链为模板,功能预测为细胞色素P450。生物信息学手段分析预测结果可靠性较高,为进一步研究虾青素的生物合成调控机制提供了理论依据。

关键词：虾青素法夫酵母 β-胡萝卜素转化酶生物信息学

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法夫酵母虾青素合成酶基因的原核表达研究及其表达差异分析

法夫酵母虾青素合成酶基因的原核表达研究及其表达差异分析

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作者：曹樱集美大学

学位级别：硕士

虾青素（astaxanthin）是一种抗氧化性能极强的天然类胡萝卜素，具有着色、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物学功能，被广泛的利用于水产养殖、医药、保健食品等行业中。法夫酵母是一种重要的天然虾青素资源，其体内的β-胡萝卜素转化酶（... 详细信息

虾青素（astaxanthin）是一种抗氧化性能极强的天然类胡萝卜素，具有着色、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物学功能，被广泛的利用于水产养殖、医药、保健食品等行业中。法夫酵母是一种重要的天然虾青素资源，其体内的β-胡萝卜素转化酶（Asy）是目前发现唯一一个直接参与氧化β-胡萝卜素成为虾青素的酶，但是关于该酶及编码该酶的基因（asy）的研究相对较少。本文针对法夫酵母中的asy基因进行了以下的研究： 1、采用cDNA末端快速扩增技术，克隆得到法夫酵母（Phaffia rhodozyma）7B12菌株的asy基因全长cDNA序列（Accession NO.HM204708.1），该序列总长1971bp，最大开放阅读框为1614bp，可编码538个氨基酸，与GenBank能检索到的的唯一一条asy基因mRNA序列（Accession NO.DQ002007.1）一致性达到97%。 2、将asy基因的cDNA克隆到pET32a载体后，转化E. coli BL21（DE3）菌株进行表达。表达的Asy融合蛋白分子量约为70kDa;优化后，在26℃，0.5mmol/L IPTG的条件下诱导时，可溶性融合蛋白比例可提高至85%;进一步在E. coli BL21（DE3）中共表达携带asy基因的质粒和pACCAR16Δcrtx质粒（携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链），采用液相色谱分析共转化菌株的类胡萝卜素产物时发现，与对照相比，共转化菌株的类胡萝卜素产物的成分发生了明显变化，其中α-胡萝卜素的含量明显减少，伴随出现了三种新的色素，根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物β-隐黄质。 3、初步分析四个具有不同发酵特征和产类胡萝卜素特性的菌株中类胡萝卜素、β-胡萝卜素和虾青素的合成量与asy基因表达量的关系发现：JMU-LY322和JMU-15spw的产物中检测不到虾青素，但是这两个菌株的asy基因均有表达;JMU-MVP14和JMU-VDL668能合成虾青素，48h时，前者的asy基因表达量高于后者，培养48h和120h时，JMU-MVP14的总类胡萝卜素、β-胡萝卜素和虾青素的产率都比JMU-VDL668高，由此可以看出，相对于JMU-VDL668，JMU-MVP14的asy基因的高效表达可能是该菌高产虾青素的原因之一。 4、在摇瓶培养的不同时间添加β-胡萝卜素，JMU-VDL668的总类胡萝卜素产量总是维持在300-400μg/g的水平。当JMU-VDL668自身合成的总类胡萝卜素含量接近或低于300μg/g时，可以吸收环境中的β-胡萝卜素，这说明JMU-VDL668细胞内的总类胡萝卜素含量可能存在一个阈值，总类胡萝卜素低于阈值时吸收β-胡萝卜素，高于阈值时，对外源β-胡萝卜素的吸收就受到了影响。 5、通过摇瓶培养进一步研究JMU-MVP14和JMU-VDL668中asy基因的表达情况与产总类胡萝卜素、β-胡萝卜素和虾青素在不同时间点的动态变化关系。结果表明：当两个菌株处于生长阶段时，asy基因的表达水平较高，36h时表达量最高。两个菌株处于稳定期时，asy基因的表达水平降低，96h表达量最低，此阶段，asy基因的表达与菌体的生长关系紧密。与JMU-MVP14不同，JMU-VDL668具有二次生长现象。在此期间胞内asy基因的表达量迅速增加，并且能将外界摄入的β-胡萝卜素转化成虾青素。JMU-VDL668的二次生长具有促进asy基因的表达的作用，进而提高了细胞氧化代谢β-胡萝卜素的能力。此外，在108-120h，JMU-MVP14的虾青素产量增加，β-胡萝卜素的产量下降，此时的asy基因的表达一直处于较低的水平，因此，我们推测JMU-MVP14调节转化β-胡萝卜素成为虾青素的机制，除了酶量调节外还存在着其它代谢调节方式。

关键词：法夫酵母 β-胡萝卜素转化酶原核表达差异分析高产菌株

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