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水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)β-微管蛋白基因克隆及与多菌灵抗药性关系

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微生物学报 2012年第5期52卷 581-587页

作者：马晓伟邢春杰于金凤王勇陈子豪王建新周明国陈长军南京农业大学植物保护学院江苏省农药学重点实验室南京210095

【目的】揭示水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)对多菌灵的抗药性与其β-微管蛋白基因的相关性。【方法】结合形态学和TEF-1α基因序列对分离菌株进行鉴定;根据近源种拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)核基因组测序菌株7600的β-... 详细信息

【目的】揭示水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)对多菌灵的抗药性与其β-微管蛋白基因的相关性。【方法】结合形态学和TEF-1α基因序列对分离菌株进行鉴定;根据近源种拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)核基因组测序菌株7600的β-微管蛋白核苷酸序列设计引物,采用PCR方法克隆并比对分析了***对多菌灵不同敏感性表型的5个菌株的β-微管蛋白基因全序列;利用实时定量技术(qRT-PCR)分析了β-微管蛋白基因在上述5个菌株中的表达特性。【结果】***的β-微管蛋白基因核苷酸序列(GenBank登录号:JQ026022)全长1671 bp,包含4个内含子,编码447个氨基酸残基;2个敏感性菌株和3个抗药性菌株的β-微管蛋白基因核苷酸序列同源性100%;在无药剂处理下该基因在2个敏感性菌株中的表达水平显著高于3个抗药性菌株(p=0.05),且对同一菌株而言,药剂处理能够显著提高β-微管蛋白基因表达水平(p=0.05),但在相同药剂处理条件下,菌株间差异不显著。【结论】***对多菌灵的抗药性机制与β-微管蛋白无关,有待进一步研究。

关键词：水稻恶苗病菌 β-微管蛋白基因表达特性多菌灵抗药性

禾谷镰孢菌β-微管蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

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南京农业大学学报 2011年第1期34卷 51-56页

作者：张聪徐建强于俊杰陈长军王建新周明国南京农业大学植物保护学院/农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室江苏南京210095 河南科技大学林学院河南洛阳471003

分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a... 详细信息

分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisTrapTM HP Columns纯化并做了Western-blot验证,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。

关键词：禾谷镰孢菌 β-微管蛋白基因原核表达纯化 Western-blot

肌动蛋白基因和β-微管蛋白基因用于真黏菌系统发育的可行性研究

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菌物学报 2013年第6期32卷 1004-1011页

作者：方玲刘歧莎李倩闫淑珍李玉陈双林南京师范大学生命科学学院江苏南京210023 吉林农业大学菌物研究所吉林长春130118

真黏菌是一类独特的菌物。目前对其进行的系统发育研究主要是基于形态特征,分子水平的系统发育研究上小亚基核糖体RNA基因和蛋白质合成延长因子基因研究相对较多。为了扩充能有效地进行真黏菌系统发育研究的基因资源,探讨了肌动蛋白基... 详细信息

真黏菌是一类独特的菌物。目前对其进行的系统发育研究主要是基于形态特征,分子水平的系统发育研究上小亚基核糖体RNA基因和蛋白质合成延长因子基因研究相对较多。为了扩充能有效地进行真黏菌系统发育研究的基因资源,探讨了肌动蛋白基因和β-微管蛋白基因用于真黏菌系统发育的可行性。共获得14个基因序列,肌动蛋白基因和β-微管蛋白基因各7个。在GenBank中除多头绒泡菌Physarum polycephalum外并无其他真黏菌的肌动蛋白基因和β-微管蛋白基因序列,研究获得的14个基因序列为真黏菌基因的新序列。系统发育分析表明,肌动蛋白基因能够有效地将无丝菌目、团毛菌目、绒泡菌目和发网菌目区分为4个分支,其中发网菌目为一个独立的进化支,支持了根据子实体发育所认识的真黏菌纲内部具有两条进化路线的观点,因此显示出肌动蛋白基因对于真黏菌系统发育研究的重要价值。

关键词：肌动蛋白基因 β-微管蛋白基因无丝菌目团毛菌目绒泡菌目发网菌目

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

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蚕业科学 2006年第4期32卷 507-511页

作者：朱勃沈中元曹喜涛徐莉唐顺明江苏科技大学生物与环境工程学院镇江212018 中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室镇江212018

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Jo... 详细信息

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。

关键词：家蚕微孢子虫 β-微管蛋白基因系统发育

亚洲镰孢菌（Fusarium asiaticum）β-微管蛋白基因的点突变及其内含子对多菌灵药敏性的调控机制研究

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亚洲镰孢菌（Fusarium asiaticum）β-微管蛋白基因的点突变及其...

作者：罗舜文南京农业大学

学位级别：硕士

亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)是我国小麦赤霉病发生最为严重的江淮流域和西南麦区的主要病原菌。近年来,随着全球气候变暖和耕作制度的改变,小麦赤霉病在我国长江中下游和黄淮冬麦区呈逐年加重的趋势。该病害侵染主要发生在小麦抽穗... 详细信息

亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)是我国小麦赤霉病发生最为严重的江淮流域和西南麦区的主要病原菌。近年来,随着全球气候变暖和耕作制度的改变,小麦赤霉病在我国长江中下游和黄淮冬麦区呈逐年加重的趋势。该病害侵染主要发生在小麦抽穗扬花期,靠风雨传播,引起穗腐。该病害不仅会造成严重的产量损失,而且该病菌产生的DON毒素对人畜有毒害作用。当前常用的杀菌剂多菌灵防治小麦赤霉病已产生严重的抗药性,因此研究它的抗性机理并如何避免产生抗药性成了一项重大课题。已知亚洲镰孢菌中存在两个β-微管蛋白基因:β1-tub和β2-tub基因,其中β1-tub基因编码的氨基酸序列与其它真菌的β-微管蛋白基因的同源性在90%以上,但只含3个内含子;而β2-tub基因编码的氨基酸序列与β1-tub基因的同源性只有77%,内含子有6个,与其它真菌的β-微管蛋白基因数量相同。先前的研究表明,亚洲镰孢菌对多菌灵的抗药性是由于β2-tub基因的点突变引起的,β1-tub基因的缺失也会导致杀菌剂的抗性水平大大增加。然而,我们对β1-tub基因的点突变知之甚少。在本文研究中,我们证明β1-tub基因的第3位和第193位氨基酸点突变能影响对多菌灵的敏感性。实验结果显示,在敏感菌株中,β1-tub点突变S-β1E3K和S-β1V193F都能减慢菌丝生长,且影响菌株对多菌灵的药敏性,S-β1E3K对多菌灵的敏感性增加,而S-β1V193F对多菌灵的敏感性降低;在以高抗菌株JT04为出发菌株中,β1-tub点突变R-β1E3K和R-β1V193F都能减慢菌丝生长,而且对多菌灵的抗药性比亲本菌株更高。qRT-PCR结果显示,点突变S-β1E3K、R-β1E3K和R-β1-V193F,它们β1-tub的mRNA表达量水平显著上调,但在S-β1V193F突变体中是β2-tub的mRNA表达量水平显著上调。分子对接模型分析,显示点突变E3K和V193F的β1-tub与多菌灵分子亲和力下降。亚洲镰孢菌β2-tub基因是苯并咪唑类杀菌剂的重要靶基因,李雁军通过分别敲除β2-tub基因的6个内含子发现缺失第4个内含子显示对杀菌剂多菌灵的药敏性增加,缺失第1个或第2个内含子表现出对多菌灵的敏感性下降。在本章研究中,我们深入探究了第4个内含子的分子机制,通过分段敲除、序列增长和序列替换的方法获得突变体,找到了一些比较重要的内含子序列。结果表明,敲除第4个内含子的第2段(第13～24bp,命名为Δβ2i4-2)显示菌丝生长变慢,对多菌灵的药敏性增加;敲除第1段(第1～12bp,Δβ2i4-1)、第 4 段(第 37～48bp,Δβ2i4-4)和第 5 段(第 49～58bp,Aβ2i4-5)导致β2-tub基因的cDNA序列移码突变,菌丝生长显著变慢,对多菌灵变得非常敏感;而序列增长和替换对亚洲镰孢菌的生物表型和药敏性没有显著影响。此外,qRT-PCR显示β2-tub基因的mRNA转录水平在Δβ2i4-2突变体中显著下调,在序列增长突变体中显著上调;而在Δβ2i4-1等cDNA序列移码突变体中虽然不表达β2-tub基因的mRNA,但β1-tub基因的mRNA转录水平显著上调。总体而言,本章研究结果表明,亚洲镰孢菌内含子的两端含有较长的剪接识别区域,第2段(12bp)内含子序列决定了第4个内含子的调控作用。基于RIP技术,实验室前期实验发现与亚洲镰孢茵β2-tub mRNA水平互作蛋白基因有很多,但有些互作强度高的假定蛋白还没有功能性地表征。在本文研究中,我们描述了亚洲镰孢菌β2-tub mRNA水平互作蛋白FaSed1p和FaChr基因的生物学功能。结果表明,FaSed1p和FaChr基因敲除体(命名分别为AFaSed1p和ΔFaChr)菌丝生长正常,但产孢量显著下降;而且ΔFaSed1p致病力显著下降,菌丝穿透能力下降,外源添加胁迫因子过氧化氢、刚果红和氯化钠也会显著抑制菌丝生长。另外,ΔFaSed1p和ΔFaChr不影响对多菌灵和戊唑醇的药敏性,表明FaSed1p和FaChr基因虽然与β2-tub mRNA水平互作强度高,但不调控对多菌灵和戊唑醇的药敏性,而FaSed1p基因在细胞壁的稳定方面表现重要作用。

关键词：亚洲镰孢菌 β-微管蛋白基因点突变内含子多菌灵

禾谷镰孢菌β-微管蛋白基因内含子对多菌灵药敏性的调控研究

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禾谷镰孢菌β-微管蛋白基因内含子对多菌灵药敏性的调控研究

作者：陈东明南京农业大学

学位级别：硕士

小麦是我国主要的粮食作物之一,由禾谷镰孢菌（Fusarium graminesrum）为优势种的复合种群引起的小麦赤霉病一直严重影响着我国麦类作物的安全生产。该病害不仅严重影响小麦产量,还可以使感染的麦粒产生单端孢霉烯族化合物,严重影响食... 详细信息

小麦是我国主要的粮食作物之一,由禾谷镰孢菌（Fusarium graminesrum）为优势种的复合种群引起的小麦赤霉病一直严重影响着我国麦类作物的安全生产。该病害不仅严重影响小麦产量,还可以使感染的麦粒产生单端孢霉烯族化合物,严重影响食品质量与安全。一直以来,以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂是田间防治小麦赤霉病的主要应急措施。但随着药剂使用年限的增长及使用剂量的增加,抗药性问题已逐渐成为威胁小麦生产和食品安全的重大农业问题。已有研究表明β-微管蛋白是苯并咪唑类药剂的选择性作用靶标。禾谷镰孢菌含有两个β-微管蛋白基因,分别为β1-tub和β2-tub。目前已经证明,β1-tub与其他真菌β-微管蛋白基因具有更高的同源性,但β2-tub的点突变引起对多菌灵的抗性。禾谷镰孢菌β1-tub含有4个外显子,3个内含子,β2-tub含有7个外显子,6个内含子。前期已有研究证明,内含子参与调控基因表达,但内含子是否参与调控禾谷镰孢菌宿主基因表达尚未有相关报道。本文通过内含子的缺失和替换策略,研究了禾谷镰孢菌β-微管蛋白基因内含子对多菌灵药敏性的调控作用。对禾谷镰孢菌β1-tub基因序列分析发现,β-tub有4个外显子,3个内含子。为了研究该基因中的内含子功能,本文利用同源重组技术得到了相应内含子的缺失突变体。结果表明,β1-tub基因缺失第2个内含子,β1-tub的转录水平显著上升,对多菌灵的敏感性增加。缺失第1个和第3个内含子不影响β1-tub的转录水平,突变体对多菌灵的敏感性也无显著差异。此外,β1-tub基因任何一个内含子的缺失对禾谷镰孢菌的菌丝生长,分生孢子和致病力都没有显著影响。因此,禾谷镰孢菌中β1-tub第2个内含子通过调节β1-tub的转录水平,从而调控对多菌灵的敏感性。禾谷镰孢菌β2-tub是多菌灵的靶标基因,包含7个外显子,6个内含子。实验室前期研究表明,缺失第1个内含子时,突变体对多菌灵敏感性下降,β2-tub缺失第4个内含子时,突变体对多菌灵敏感性显著增加,即不同内含子具有正调控或负调控药敏性的专化性。本文通过对第1个内含子进行分段敲除和对第4个内含子序列分段替换的方法,发现内含子具有调控药敏性的序列特异性。结果表明,与出发菌株相比,分段敲除β2-tub第1个内含子的所有突变体对多菌灵的敏感性增加,但缺失不同片段的碱基序列,药敏性增加的程度存在差异,即序列对内含子发挥功能有重要作用。通过cDNA测序发现,第1段（1-12bp）、第5段（49-61bp）、第6段（3-12bp）和第7段（49-59bp）片段的内含子碱基序列敲除后,改变了β2微管蛋白基因cDNA序列,这一结果说明这些序列对内含子的剪接起重要作用。对β2-tub第4个内含子进行碱基序列分段替换,发现第12-20bp,21-29bp,30-38bp和48-56bp碱基替换后,突变体对多菌灵敏感性增加,但与内含子4缺失突变体（β2Δi4）相比,敏感性增加幅度较低,这一结果表明第4个内含子负调控药敏性具有序列特异性和长度累加效应。通过cDNA测序发现第4个内含子的3-11bp,39-47bp碱基替换后,第4个内含子未能被识别剪切,成为编码序列,改变了β2-cDNA序列,证明3-11bp,39-47bp序列对于第4个内含子的剪切至关重要。综上所述,禾谷镰孢菌β1-tub和β2-tub内含子对多菌灵的敏感性调控作用不仅具有内含子专化性,而且具有序列特异性,并且靠近内含子“GT”开头,“AG”结尾的序列对内含子的剪接具有重要作用。

关键词：禾谷镰孢菌内含子 β-微管蛋白基因多菌灵敏感性

禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）对多菌灵的抗药性监测及β-微管蛋白基因生物学功能初步研究

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禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）对多菌灵的抗药性监测及β-...

作者：张雁南南京农业大学

学位级别：硕士

小麦赤霉病(Wheat Scab),其病原菌无性态为禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum Schw),有性态为玉黍赤霉(Gibberella ***),是世界范围内小麦最重要病害之一。在中国主要发生在长江中下游、淮河流域和东部海岸地区,但是近十年来在北部和西... 详细信息

小麦赤霉病(Wheat Scab),其病原菌无性态为禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum Schw),有性态为玉黍赤霉(Gibberella ***),是世界范围内小麦最重要病害之一。在中国主要发生在长江中下游、淮河流域和东部海岸地区,但是近十年来在北部和西部的小麦产区也有加重发生趋势。小麦赤霉病不仅可以造成产量损失,而且还会因病菌产生DON毒素威慑食品安全。30多年来,我国主要依靠使用多菌灵防治小麦赤霉病。本文研究了江苏和安徽省小麦赤霉病菌近年对多菌灵的抗药性群体变化及与多菌灵靶标有关的β-微管蛋白基因主要生物学特性。在2006～2008年从江苏省、安徽省的不同地区采集分离小麦赤霉病菌测定其对多菌灵的敏感性。采集的4869个菌株中大多数菌株对多菌灵是敏感的,对多菌灵的抗药性菌株频率为5.65%。抗药性菌株频率在不同地区和不同年份的变化范围为0～8.29%。研究比较了禾谷镰孢菌β1-和β2-微管蛋白基因敲除体及其恢复体对多菌灵的敏感性、菌丝生长、无性繁殖、有性繁殖和致病性等生物学特性。结果显示野生敏感菌株2021的β1-微管蛋白基因敲除体对多菌灵的敏感性下降,ECso值由0.4579μg/ml上升至1.0774μg/ml,而抗药性菌株JT04的β1管蛋白基因敲除体对多菌灵的抗性水平则从中抗变为极高抗,EC5o上升了50～100倍。相反,野生敏感菌株2021和抗药性菌株JT04敲除β2-微管蛋白基因后,对多菌灵则表现超敏感,EC5o值相似,分别由0.4579μg/ml下降至0.1583μg/ml;6.298μg/ml下降至0.1029μg/ml。证明β2-微管蛋白基因与菌体对多菌灵抗性有关,而β1-微管蛋白基因与菌体对多菌灵的抗性无关,β1-和β2-微管蛋白基因均是多菌灵的作用靶标,且β1-比β2-微管蛋白基因对多菌灵更加敏感;β1-微管蛋白基因敲除体的菌丝生长、分生孢子和子囊孢子形成及致病性与原始菌株没有显著差异,而β2-微管蛋白基因敲除体的菌丝生长、分生孢子和子囊孢子产生量及致病力则分别下降。β1-或β2-微管蛋白基因恢复体的上述生物学性状均与原始出发菌株相似。结果显示β2-微管蛋白基因对于禾谷镰孢菌的生命活动较β1-微管蛋白基因更为重要。

关键词：小麦赤霉病多菌灵抗药性监测 β-微管蛋白基因敲除突变体生物学功能

黏菌肌动蛋白基因和β-微管蛋白基因的初步研究

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黏菌肌动蛋白基因和β-微管蛋白基因的初步研究

作者：方玲南京师范大学

学位级别：硕士

黏菌作为真核生物中的一个特殊类群,在生物界中占有重要地位。因其独特的兼具动物和真菌某些特征的生活史,使其在生物界中的地位一直没有得到统一。目前黏菌归属于原生动物,但是其究竟是与真菌的亲缘关系近,还是与原生动物的亲缘关系更... 详细信息

黏菌作为真核生物中的一个特殊类群,在生物界中占有重要地位。因其独特的兼具动物和真菌某些特征的生活史,使其在生物界中的地位一直没有得到统一。目前黏菌归属于原生动物,但是其究竟是与真菌的亲缘关系近,还是与原生动物的亲缘关系更近,始终是生物分类学者讨论的一个课题。为了建立一个更趋自然的黏菌分类系统,寻找解决传统分类学上较困难的问题,本文采用分子生物学技术对黏菌部分分类单元的肌动蛋白基因和β-微管蛋白基因进行PCR扩增和序列测定,通过序列分析探讨其分子系统学关系。纯培养得到鳞钙皮菌和长发丝菌的原生质团,通过原生质团提取基因组DNA与常规通过子实体提取基因组DNA比较发现,消耗约相同质量的子实体,排除人为操作造成纯培养的污染外,原生质团提取的基因组品质较好,浓度相对较高且没有拖带现象,直接用于后续PCR的效果较好。这种方法将一定程度上解决黏菌子实体量少、难以获得的难题,也是获得较高品质DNA的一种新方法。利用一对引物对黏菌纲内7种黏菌的肌动蛋白基因进行PCR扩增和序列测定,并结合GenBank中6条多头绒泡菌序列进行分子系统学分析。用最大似然Maximum Likelihood (ML)法构建系统发育树。从系统发育关系看出基于肌动蛋白基因基本能够将黏菌纲内无丝菌目、团毛菌目、绒泡菌目和发网菌目区分开来,并且展现出两条并行的分支演化路线,一支由无丝菌目、团毛菌目和绒泡菌目组成,另一支由发网菌目组成。利用一对引物对黏菌纲内7种黏菌的p-微管蛋白基因进行PCR扩增和序列测定,并结合GenBank中2条多头绒泡菌序列进行分子系统学分析。用最大似然Maximum Likelihood (ML)法构建系统发育树。从系统发育关系上看绒泡菌目的鳞钙皮菌先与发网菌目的长发丝菌聚为一个分支,之后才与同目的白柄菌再聚为一个较大的分支,这表明该基因并不适合于用作黏菌纲目级水平系统发育的分子指标。推测得到7种黏菌的肌动蛋白和p-微管蛋白氨基酸序列。其中肌动蛋白氨基酸序列种间差异约28%,而p-微管蛋白氨基酸序列种间差异约7%,发现p-微管蛋白比肌动蛋白更加保守。2种蛋白都能较好的将植物、真菌、动物和原生生物区分开来,其中肌动蛋白能够较好的说明黏菌与真菌和动物亲缘关系较近,与传统意义上对黏菌的分类一致;而p-微管蛋白由于过于保守没有较好的反映出黏菌的亲缘关系。

关键词：黏菌原生质团肌动蛋白基因 β-微管蛋白基因分子系统学

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基于微管蛋白基因的烟草根黑腐病菌分子检测

中国烟草科学 2016年第6期37卷 60-65页

作者：曹继芬户艳霞王新中徐发华杨明英赵志坚云南省农业科学院农业环境资源研究所昆明650205 云南省烟草公司大理州公司云南大理671000

建立一种烟草根黑腐病菌新靶标的分子检测方法。以β-微管蛋白基因为靶标设计了特异性引物Tbas-tub2F/Tbas-tub R用于根黑腐病菌的PCR检测,对其检测特异性、灵敏度、早期诊断技术进行了测试。结果显示,只有根黑腐病菌能扩增到一条254 b... 详细信息

建立一种烟草根黑腐病菌新靶标的分子检测方法。以β-微管蛋白基因为靶标设计了特异性引物Tbas-tub2F/Tbas-tub R用于根黑腐病菌的PCR检测,对其检测特异性、灵敏度、早期诊断技术进行了测试。结果显示,只有根黑腐病菌能扩增到一条254 bp的特异性条带,其他19种真菌、卵菌及阴性对照均无扩增产物,表明该对引物能特异性地检测根黑腐病菌。该引物对根黑腐病菌基因组DNA检测的灵敏度为10 fg/μL。Tbas-tub2F/Tbas-tub R可从接种侵染24 h后的烟草组织中检测到根黑腐病菌,从而对根黑腐病进行准确的早期诊断。开发了烟草根黑腐病菌新靶标的分子检测和早期诊断技术。

关键词：烟草根黑腐病菌 β-微管蛋白基因分子检测