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Isolation and bioactivity screening of soy isoflavones from soybean glycolipids identifies daidzin as a promising anti-inflammatory agent

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Traditional Medicine Research 2024年第3期9卷 1-9页

作者： Xiao-Chuan Fang Xue-Mei He Yuan-Ru Zheng Wen Li Tang-Jia Yang Jing-Tao Yu Jun-Le Li Zi-Zhe Cai Yong Wang Lin-Zhong Yu Jun-Shan Liu Third Level Research Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine PharmaceuticsSchool of Traditional Chinese MedicineSouthern Medical UniversityGuangzhou 510515China Guangdong Saskatchewan Oilseed Joint Laboratory Department of Food Science and EngineeringJinan UniversityGuangzhou 510632China Institute of Biomedical Engineering College of Life Science and TechnologyJinan UniversityGuangzhou 510632China Department of Pharmacy Zhujiang HospitalSouthern Medical UniversityGuangzhou 510515China

Background:Soybean has long been utilized in the realm of traditional Chinese medicine.One of its extracts,soybean glycolipids,serves as a vital by-product of soybean oil refining,but its chemical composition and pharmacological potential have yet to be fully elucidated.Methods:In this study,the chemical components were isolated,and the inhibitory effects of these isolates were explored in different zebrafish inflammatory models by survival rate,Histological examination assay and quantitative Real-time PCR assay.The cytotoxicity of daidzin in RAW264.7 cells was evaluated by cell viability assay,and the effect of daidzin on the release of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells was detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Western blotting,immunofluorescence assay and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors siRNA transfection assay were used to further explore the anti-inflammatory mechanism of daidzin.Results:Four compounds(verticilloside,soya-cerebroside I,soya-cerebroside II and daidzin)were firstly isolated from the soybean glycolipids,among which verticilloside and daidzin inhibited the lipopolysaccharide,CuSO4-and tail cut-stimulated zebrafish inflammation.Noticeably,daidzin exhibited anti-inflammatory activities by increasing the survival rate,alleviating the inflammatory cells infiltration,and down-regulating the expression of pro-inflammatory cytokines and nuclear factor kappa-B,NF-kappa-B inhibitor alpha,and signal transducer and activator of transcription3 in zebrafish.Moreover,daidzin decreased the secretion of IL-6 and TNF-α,inhibited the nuclear translocations of nuclear factor kappa-B p65 and p-signal transducer and activator of transcription3 as well as the NF-kappa-B inhibitor alpha phosphorylation at Ser32 in RAW 264.7 cells.More importantly,it elevated the expression level of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors in both zebrafish and RAW 264.7 cells,and the inhibitory effect of daidzin was attenuated after the addition of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors siRNA.Conclusion

关键词： soybean daidzin anti-inflammation zebrafish α7nachr

奶牛子宫内膜上皮细胞α7nachr 经由JAK2/STAT3信号通路抑制炎性反应机制

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中国兽医学报 2023年第7期43卷 1506-1512页

作者：李微微高瑞峰张剑柄陈灰贺鹏飞内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

旨在探究BEEC α7nachr经由JAK2/STAT3信号通路调控炎症反应机制。应用间接免疫荧光技术鉴定BEEC α7nachr的表达;α7nachr非特异激动剂烟碱、特异激动剂PUN282987及特异性抑制剂MLA预处理BEEC后使用终浓度0.1 mg/L LPS刺激BEEC,ELISA检... 详细信息

旨在探究BEEC α7nachr经由JAK2/STAT3信号通路调控炎症反应机制。应用间接免疫荧光技术鉴定BEEC α7nachr的表达;α7nachr非特异激动剂烟碱、特异激动剂PUN282987及特异性抑制剂MLA预处理BEEC后使用终浓度0.1 mg/L LPS刺激BEEC,ELISA检测IL-6、IL-8、IL-10分泌水平;Western blot检测α7nachr、JAK2、P-JAK2、STAT3和P-STAT3的表达水平。PUN282987及烟碱显著抑制IL-6、IL-8的分泌,促进IL-10的分泌,MLA可拮抗上述效应;PUN282987显著上调STAT3磷酸化水平,α7nachr表达水平与STAT3磷酸化水平则呈负相关,烟碱显著抑制STAT3磷酸化,α7nachr表达水平与STAT3磷酸化水平呈正相关;α7nachr激动剂对JAK2磷酸化水平无显著影响。结果表明:激活BEEC α7nachr通过调控STAT3磷酸化、抑制促炎细胞因子分泌和促进抗炎因子分泌进而抑制炎症反应,BEEC α7nachr是防治奶牛子宫内膜炎潜在靶点。研究表明PUN282987与烟碱调控STAT3磷酸化及α7nachr表达均存在药理学差异,而在其他有关BEEC或α7nachr的研究中暂未见报道。

关键词：奶牛子宫内膜炎奶牛子宫内膜上皮细胞胆碱能抗炎通路 α7nachr JAK2/STAT3信号

电针足三里对紫杉醇诱导神经性疼痛小鼠脾脏及脊髓背角α7nachr调控炎症的机制研究

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康复学报 2022年第5期32卷 426-433页

作者：庞莉娜兰艳艳王志福陈小梅俞向梅福建中医药大学康复医学院福建福州350122 福建中医药大学附属康复医院福建福州350003 福建中医药大学中西医结合学院福建福州350122

目的:探讨电针足三里对化疗药物紫杉醇诱导神经性疼痛(PINP)小鼠脾脏及脊髓背角α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nachr)影响炎症变化的作用机制。方法:选择雄性成年C57BL/6小鼠60只,体质量18~22 g,按照随机数字表法分为对照组、模型组、电针... 详细信息

目的:探讨电针足三里对化疗药物紫杉醇诱导神经性疼痛(PINP)小鼠脾脏及脊髓背角α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nachr)影响炎症变化的作用机制。方法:选择雄性成年C57BL/6小鼠60只,体质量18~22 g,按照随机数字表法分为对照组、模型组、电针组、腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组,每组12只。模型组、电针组、腹腔拮抗剂组和鞘内拮抗剂组腹腔隔日注射紫杉醇(2 mg/kg),总计4次,建立PINP模型,对照组给予同等容量的生理盐水。电针组、腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组从造模第1天开始进行电针干预,隔日1次,共干预7次。腹腔拮抗剂组、鞘内拮抗剂组分别于造模第1、7、13天分别在腹腔、鞘内注射α7nachr拮抗剂α-银环蛇毒素(α-BGT)。采用Von Frey测痛仪及热刺痛仪检测造模第0、7、14天小鼠机械痛阈值(PWT)及热痛阈值(PWL)的变化;采用Western blot检测造模第14天小鼠脾脏、脊髓背角α7nachr蛋白表达;采用RT-qPCR及ELISA法检测造模第14天小鼠脾脏、脊髓背角TNF-αmRNA水平及蛋白表达的变化。结果:(1)行为学测试:5组小鼠造模前PWT和PWL比较,差异无统计学意义(P>0.05);模型组造模第7、14天PWT和PWL较同时段对照组小鼠显著下降,差异有统计学意义(P7、14天PWT和PWL较同时段模型组小鼠明显上升,差异有统计学意义(P7、14天PWT和PWL较同时段电针组小鼠显著下降,差异有统计学意义(Pα7nachr蛋白表达测试:与对照组比较,模型组小鼠脾脏及脊髓背角α7nachr蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(Pα7nachr蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(Pα7nachr表达,降低脾脏、脊髓背角炎症因子TNF-α释放,从而减轻PINP小鼠机械痛和热痛觉过敏。

关键词：紫杉醇诱导神经性疼痛电针足三里脾脏脊髓背角 α7nachr

奶牛子宫内膜上皮细胞α7nachr介导炎症调控机制研究

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奶牛子宫内膜上皮细胞α7nAChR介导炎症调控机制研究

作者：李微微内蒙古农业大学

学位级别：硕士

子宫内膜炎是导致奶牛繁殖性能下降主要的产后疾病之一。子宫内膜上皮是子宫抵御病原侵袭的第一道屏障,调控子宫内膜上皮细胞炎症反应是控制子宫炎症发展有效措施。前期研究表明子宫内膜组织α7型烟碱乙酰胆碱受体(α7-nicotinic acetyl... 详细信息

子宫内膜炎是导致奶牛繁殖性能下降主要的产后疾病之一。子宫内膜上皮是子宫抵御病原侵袭的第一道屏障,调控子宫内膜上皮细胞炎症反应是控制子宫炎症发展有效措施。前期研究表明子宫内膜组织α7型烟碱乙酰胆碱受体(α7-nicotinic acetylcholine receptors,α7nachr)介导调控炎症反应。α7nachr调控JAK2/STAT3、NF-κB、MAPKs信号通路是胆碱能抗炎通路抑制炎症反应的主要机制,但在奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cell,BEEC)研究中未见报道。本研究目的旨在探索BEECα7nachr经由JAK2/STAT3、NF-κB、MAPKs信号通路调控炎症反应机制。应用间接免疫荧光技术鉴定BEECα7nachr的表达;α7nachr非特异性激动剂烟碱、特异性激动剂PUN282987及特异性抑制剂MLA预处理BEEC后使用终浓度0.1 mg/L LPS刺激BEEC,ELISA检测IL-6、IL-8、IL-10、PGE2分泌水平;Western-blotting检测α7nachr、JAK2/STAT3、NF-κB、MAPKs通路关键因子的相对表达水平。PUN282987及烟碱显著抑制炎性细胞因子IL-6、IL-8的分泌,且促进PGE2及抗炎因子IL-10的分泌,MLA可逆转上述效应;PUN282987显著上调STAT3磷酸化水平,α7nachr表达水平与STAT3磷酸化水平则呈负相关。烟碱显著抑制STAT3磷酸化,α7nachr表达水平与STAT3磷酸化水平呈正相关;PUN282987与烟介导NF-κB通路磷酸化,显著上调IκB磷酸化水平,但显著下调P65磷酸化水平;PUN282987与烟碱均显著上调P38磷酸化及ERK磷酸化,PUN282987显著上调JNK磷酸化,上述效应可被MLA逆转。α7nachr特异性激动剂PUN282987与非特异性激动剂烟碱调控STAT3磷酸化及α7nachr表达水平存在药理学差异;PUN282987及烟碱对NF-κB调控作用可能是先促进NF-κB-IκBs解离,在解离之后抑制P65磷酸化。激活BEECα7nachr经由JAK2/STAT3、NF-κB、MAPKs通路可抑制促炎细胞因子IL-6,IL-8的分泌,促进抗炎因子IL-10及PGE2分泌发挥抗炎效应;BEECα7nachr可作为防治奶牛子宫内膜炎的治疗靶点及药物开发靶点。

关键词：奶牛子宫内膜上皮细胞子宫内膜炎 α7nachr 炎症调控机制

石杉碱甲通过α7nachr抑制脓毒症炎症反应的机制研究

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石杉碱甲通过α7nAChR抑制脓毒症炎症反应的机制研究

作者：陈焜森福建师范大学

学位级别：硕士

脓毒症是宿主由于感染反应失调而引起危及生命的器官功能障碍疾病,2020年最新统计表明,2017年全球脓毒症相关死亡人数大约有1100万人,占到全年死亡人数的19.7%,是危害人类健康的重要疾病之一。炎症反应是脓毒症最基础也是最主要的病理过... 详细信息

脓毒症是宿主由于感染反应失调而引起危及生命的器官功能障碍疾病,2020年最新统计表明,2017年全球脓毒症相关死亡人数大约有1100万人,占到全年死亡人数的19.7%,是危害人类健康的重要疾病之一。炎症反应是脓毒症最基础也是最主要的病理过程,是治疗脓毒症的关键点;此外感染会导致宿主的肠道菌群失衡,进一步加重炎症反应。胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP）是神经系统参与炎症调控的重要途径,诸多研究表明CAP对脓毒症起到治疗作用,CAP的关键受体α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nachr）在治疗中发挥重要作用。目前,石杉碱甲（Huperzine A,HupA）作为乙酰胆碱酯酶抑制剂,不仅用于阿尔茨海默症（Alzheimers disease,AD）治疗,也有研究发现HupA具有抗炎作用,可通过CAP对炎症起到调控。因此,本论文通过开展相关的体外和体内实验,以此探究HupA通过α7nachr对脓毒症的治疗作用机制和对脓毒症期间肠道菌群的影响。在体外实验中,本实验室前期研究发现在Raw264.7细胞中,HupA抗炎作用被α-银环蛇毒素（α7nachr特异性拮抗剂）抑制,推测HupA可能通过α7nachr对炎症起到调控。因此在Raw264.7细胞上构建M-α7nachr-sh RNA稳转细胞株,α7nachr敲低后,HupA抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA表达作用消失。以及在骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophage,BMDM）进行实验,α7nachr缺失后,HupA无法抑制IKBα和P65的磷酸化水平,且不能抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA和蛋白表达。说明HupA通过α7nachr对细胞炎症起到调控作用。在体内实验中,构建盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture,CLP）脓毒症小鼠模型,以此分析HupA通过α7nachr对脓毒症的治疗作用机制。研究表明,WT的CLP脓毒症小鼠给予HupA治疗后,提高脓毒症小鼠的生存率,并且体温和行为恢复正常水平。HupA治疗显著下调脓毒症小鼠肺、肝组织中IL-1β、TNF-α和IL-6的m RNA表达,并从HE染色分析发现肺、肝组织病变得到改善,抑制脓毒症引起的器官损伤。以及流式细胞术分析脓毒症小鼠外周血中的免疫细胞变化,HupA治疗抑制CLP引起的CD4+T Cell、B Cell相对含量减少,升高外周血中的Activated NK Cell的相对含量,并减少CLP引起的TNFR2+Tregs的相对含量升高。但是HupA的上述治疗作用在α7nachr的CLP脓毒症小鼠消失,α7nachr缺失后,经HupA处理的脓毒症小鼠生存率、体温和行为并没有得到明显改善;肺、肝组织中炎症因子仍呈现高表达水平,肺、肝组织的病变依旧严重;外周血中的免疫细胞变化并没有因为HupA处理得到改善;上述实验结果表明,HupA通过α7nachr对脓毒症起到治疗作用。此外,HupA通过激活α7nachr调节CAP抑制脓毒症炎症反应,α7nachr激活CAP中的PI3K/AKT通路,即促进PI3K和AKT的磷酸化,抑制下游的GSK-3磷酸化;随后抑制NF-κB通路的过度激活,减少My D88蛋白表达、以及IKBα和P65的磷酸化水平,抑制脓毒症期间的过度炎症。脓毒症期间感染会导致宿主的肠道菌群失衡,导致症状加重,因此分析HupA通过α7nachr对肠道菌群的影响。HupA通过α7nachr改善CLP脓毒症小鼠肠道菌群的物种丰富度和多样性,有利于维持肠道菌群平衡,以及促进短链脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFAs）中乙酸和丙酸的含量增加,SCFAs在抗炎中发挥重要作用,可抑制脓毒症症状的加重。CLP引起小鼠体内变形菌门（Proteobacteria）、埃希氏菌属（Escherichia）等致病菌丰度增加,拟杆菌门（Bacteroidetes）、阿克曼氏菌属（Akkermansia）和副杆状菌属（Parabacteroides）等有益菌丰度减少。HupA通过α7nachr使得上述致病菌丰度显著减少,并增加上述有益菌在脓毒症小鼠中的丰度,有益菌的增加会促进乙酸和丙酸含量升高。相关性热图分析发现炎症因子的表达与埃希氏菌属（Escherichia）、异茎菌属（Allobaculum）和图里西单胞菌属（Turicimonas）呈现正相关,与丹毒梭菌（Erysipelatoclostridium）、隶属于丹毒发菌科（Erysipelotrichaceae）的未鉴定属等负相关。表明HupA可以通过α7nachr改善脓毒症期间的肠道菌群变化。本文分别从体外和体内水平开展实验,对Hup

关键词：脓毒症胆碱能抗炎通路 α7nachr 石杉碱甲 CLP脓毒症模型肠道菌群

中枢神经系统氧中毒的线粒体动力学机制及激活α7nachr的作用及相关机制研究

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中枢神经系统氧中毒的线粒体动力学机制及激活α7nAChR的作用及相...

作者：孔妮中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

中枢神经系统氧中毒(Central nervous system oxygen toxicity,CNS-OT)是指人体在较短时间内吸入高分压的氧,体内呈现氧过饱和状态,导致大脑异常放电,发生四肢强直、肌束颤动、角弓反张等惊厥样改变,严重时造成死亡,其中氧惊厥是其最严... 详细信息

中枢神经系统氧中毒(Central nervous system oxygen toxicity,CNS-OT)是指人体在较短时间内吸入高分压的氧,体内呈现氧过饱和状态,导致大脑异常放电,发生四肢强直、肌束颤动、角弓反张等惊厥样改变,严重时造成死亡,其中氧惊厥是其最严重典型以及最严重的症状。高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)在潜艇脱险、潜水以及临床疾病治疗中有着广泛的用途,目前,民用饱和潜水和临床用氧中,由于严格控制高压氧暴露的压力和时程,CNS-OT的发生率很低。但在竞技和军事领域,CNS-OT的发生率依然较高,吸入高分压氧导致CNS-OT的情况时有发生,所能采取的预防措施也很有限且被动,严重影响作战任务的顺利完成。目前,关于CNS-OT的发生机制主要有神经递质失衡学说、氧化应激学说、腺苷代谢学说等,但这些学说并不能完全阐明CNS-OT的分子机制。随着我国维护海洋利益的决心逐渐凸显,增强海军军事实力势在必行,因此,针对未来可能发生的水下作战,阐明CNS-OT的发生机制,进而寻找其防止靶点,对确保作战人员的生命安全、减少非战争减员显得尤为重要。线粒体作为细胞内一种复杂的细胞器,在细胞中是出于不断动态变化的状态,线粒体通过发生分裂(fission)和融合(fusion)改变线粒体的数量、形态以及结构,称之为线粒体动力学,这种动态变化可使线粒体在胞质中可呈点状、线状、碎片状或条状等不同的形态。线粒体动力学与线粒体的功密切相关,如细胞增殖、迁移及代谢等生理过程,并受多种蛋白质或化学酶调控。一旦线粒体动力学平衡被打破,会对机体生命活动产生重要影响。已有研究表明,线粒体动力学异常与脑血管病、阿尔兹海默症、癫痫、帕金森病等多种神经系统疾病有关,然而线粒体动力学是否参与CNS-OT的发生发展,目前尚未见报道。烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)是种配体门控离子通道蛋白,广泛分布于中枢与外周神经系统,参与受体功能活动的调节。其中α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nachr)是由五个同源α7亚基组成的五聚体,中间是中空的离子通道。α7nachr广泛表达于中枢神经系统的各种细胞中,包括脑血管内皮细胞、神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。目前,α7nachr的神经保护作用已被广泛报道,我们课题组前期的研究也发现激活小胶质细胞上α7nachr能通过促进自噬减轻自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和缺血性脑卒中。此外,亦有大量研究表明,激活α7nachr对帕金森病、缺血性脑卒中、阿尔茨海默症等多种中枢神经系统疾病均具有保护作用,表明其可能成为中枢神经系统疾病治疗的新靶点。因此,基于以上分析,本课题针对中枢神经系统氧中毒与线粒体动力学失衡之间的关系进行研究,并在此基础上进一步阐明激活α7nachr对中枢神经系统氧中毒是否具有保护作用及其与线粒体动力学失衡之间有何关系。研究内容主要分成如下几部分:第一部分,探究中枢神经系统氧中毒发生的线粒体动力学机制;第二部分,在整体动物水平,观察激活α7nachr对中枢神经系统氧中毒小鼠的保护作用及相关机制;第三部分,在体外培养的神经元上,阐明激活α7nachr对HBO暴露诱导的神经元氧化损伤、线粒体功能及线粒体动力学指标的影响。(一)探究中枢神经系统氧中毒发生的线粒体动力学机制1、观察中枢神经系统氧中毒对小鼠脑组织线粒体形态的影响我们将C57小鼠随机分为两组:CON组和HBO组,CON组的小鼠置于正常空气的舱内,而HBO暴露组小鼠则置于高压氧舱(6 ATA,99%氧气)内,两组动物均暴露30分钟,暴露结束后将两组动物处死,取脑组织灌流、固定、制片等,利用透射电镜观察两组动物脑组织中线粒体形态和结构的变化。结果发现,CON组小鼠脑组织中线粒体的形态呈长管状或椭圆状,且分布广泛,线粒体嵴与双层膜结构清晰;而HBO暴露组小鼠的脑组织中线粒体形态肿胀,多呈现圆球状,且大部分处于分裂状态,其异常状态的线粒体比例比CON组显著增加。2、观察中枢神经系统氧中毒后小鼠脑组织线粒体动力学的影响为了进一步观察HBO暴露对小鼠脑组织线粒体动力学的影响,我们将C57小鼠随机分为CON组和HBO暴露组,处理方法同上,暴露结束后分别取脑组织,利用RT-PCR和Western Blot技术分别从基因与蛋白水平检测线粒体动力学相关蛋白Drp1、Drp1 S637、Opa1、Fis1的表达变化。结果发现HBO暴露后小鼠脑组织中线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1的m RNA表达水平显著高于CON组,而线粒体融合相关蛋白Opa1的m RNA表达则低于CON组;蛋白质印迹检测结果发现HBO暴露后小鼠脑组织中线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1的表达也显著高于CON组,而Drp1s637与线粒体融合相关蛋白Opa1的表达则低于CON组,与m RNA水平的变化相一致。这些结果说明HBO暴露引起小鼠脑组织线粒体发生分裂过度,而融合减少,线粒体动力学平衡被打破

关键词：中枢神经系统氧中毒氧化应激线粒体动力学 α7nachr 线粒体功能

基于小胶质细胞探讨α7nachr介导BDNF/TrkB信号通路参与三氟淫羊藿素干预神经病理性疼痛的分子机制

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基于小胶质细胞探讨α7nAChR介导BDNF/TrkB信号通路参与三氟淫羊...

作者：贾丹丹赣南医学院

学位级别：硕士

背景:神经病理性疼痛是最顽固、最难治的一类疾病,严重影响患者的生活质量,致使患者痛苦不堪,此外,神经病理性疼痛还常伴有焦虑、抑郁和社交障碍等,会使患者减少生活乐趣和降低工作能力,症状严重的还会产生自杀倾向而危及生命。神经病... 详细信息

背景:神经病理性疼痛是最顽固、最难治的一类疾病,严重影响患者的生活质量,致使患者痛苦不堪,此外,神经病理性疼痛还常伴有焦虑、抑郁和社交障碍等,会使患者减少生活乐趣和降低工作能力,症状严重的还会产生自杀倾向而危及生命。神经病理性疼痛发病机制较复杂,加大了治疗难度。诸多研究已证实,小胶质细胞与神经元存在复杂的交互作用,影响着痛觉信号的传递。α7烟碱乙酰胆碱受体（α7nicotinic acetylcholine receptor,α7n ACh R）的激活抑制了小胶质细胞的活化,并促进M1型向M2型极化状态的转换,释放抗炎介质,表现出对神经炎症的抑制作用。三氟淫羊藿素（Trifluoro-icaritin,ICTF）是淫羊藿素（Icaritin,ICT）的衍生物,具有抗炎和神经保护等作用。已有研究表明,ICTF对慢性炎性痛具有镇痛抗炎作用,然而,ICTF是否对神经病理性疼痛也发挥镇痛抗炎作用还需进一步探究。因此,本实验旨在探讨ICTF在脊髓水平对坐骨神经分支选择性损伤模型（Spared nerve injury,SNI）诱导的神经病理性疼痛大鼠α7n ACh R-BDNF/Trk B/KCC2信号通路、炎症因子及小胶质细胞的作用,为进一步揭示ICTF的镇痛、抗炎及分子机制提供实验依据。目的:1.观察ICTF对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠机械痛敏、热痛敏、步态、转棒、旷场和高架十字迷宫的影响。2.观察ICTF对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠脊髓α7n ACh R与小胶质细胞及其极化状态之间关系的影响以及α7n ACh R、BDNF、Trk B、KCC2、IL-1β、IL-10、CD11b、CD40、CD206分子的蛋白表达水平的影响。3.观察鞘内给予α7n ACh R拮抗剂α-Bgtx对ICTF作用于SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠机械痛敏及脊髓α7n ACh R、BDNF、Trk B、KCC2、IL-1β、IL-10、CD11b、CD40、CD206分子的蛋白表达水平的影响。4.观察鞘内给予外源性BDNF对ICTF作用于SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠机械痛敏及脊髓BDNF、Trk B、KCC2分子的蛋白表达水平的影响。方法:1.按照文献报道制备SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠模型。2.应用动态足底触觉测量仪和足底测试仪分别检测SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠的机械痛敏和热痛敏,观察ICTF对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠痛敏行为的影响,并筛选ICTF治疗的最佳剂量。3.应用Cat Walk步态行为检测ICTF对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠步态参数的影响。4.应用转棒实验检测ICTF对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠整体运动能力的影响。5.应用相关性分析机械痛敏、步态强度参数和转棒转速之间的关联性。6.应用旷场和高架十字迷宫实验检测ICTF对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠焦虑情绪的影响。7.应用Western blot检测ICTF对SNI大鼠脊髓α7n ACh R、BDNF、Trk B、KCC2、IL-1β、IL-10、CD11b、CD40、CD206蛋白表达水平的作用。8.应用免疫荧光检测ICTF对SNI大鼠脊髓α7n ACh R和小胶质细胞的作用。9.应用动态足底触觉测量仪检测鞘内注射α7n ACh R的拮抗剂α-Bgtx对ICTF干预SNI大鼠机械痛敏的作用。10.应用动态足底触觉测量仪检测鞘内注射外源性BDNF对ICTF干预SNI大鼠机械痛敏的作用。11.应用Western blot检测给予α7n ACh R拮抗剂α-Bgtx对ICTF干预SNI大鼠脊髓α7n ACh R、BDNF、Trk B、KCC2、IL-1β、IL-10、CD11b、CD40、CD206分子的蛋白表达水平的作用。12.应用Western blot检测给予外源性BDNF对ICTF干预SNI大鼠脊髓BDNF、Trk B、KCC2分子的蛋白表达水平的作用。结果:1.ICTF（5 mg/kg）可缓解SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠机械痛敏,而对热痛敏不敏感。为了探究ICTF是否对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠具有镇痛作用?基于文献报道,我们应用机械痛敏和热痛敏行为学进行检测,将ICTF设为0.5 mg/kg、1.5mg/kg、5 mg/kg、15 mg/kg剂量组,结果显示,与Sham组相处,SNI大鼠机械痛敏显著降低;与SNI组相比,经过连续21天ICTF治疗,5 mg/kg ICTF显著升高了机械痛敏阈值;与机械痛敏相比,SNI大鼠对热痛敏不敏感。2.ICTF（5 mg/kg）可有效改善SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠步态参数情况。为了探究ICTF是否对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠步态具有改善作用?我们应用Catwalk步态分析系统进行检测,结果显示,与Sham相比,SNI组大鼠左后爪最大接触时间的最大强度、最大强度、足印面积、站立时间显著下降,而左后爪摆

关键词：神经病理性疼痛三氟淫羊藿素 α7nachr BDNF/TrkB KCC2 M1/M2型小胶质细胞炎症因子

迷走神经在脾脏调节单核细胞α7nachr表达：相关炎症调节

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迷走神经在脾脏调节单核细胞α7nAChR表达：相关炎症调节

作者：周梦筱河北北方学院

学位级别：硕士

迷走神经-脾轴是机体炎症调节的重要途径,也与多种疾病的慢性炎症发生、发展及治疗相关。已有的研究已经证实,脾脏是迷走神经胆碱能抗炎活性维持系统炎症调节所必需的,但其基本机制尚不完全清楚。虽然已经证实胆碱能抗炎途径是通过激活... 详细信息

迷走神经-脾轴是机体炎症调节的重要途径,也与多种疾病的慢性炎症发生、发展及治疗相关。已有的研究已经证实,脾脏是迷走神经胆碱能抗炎活性维持系统炎症调节所必需的,但其基本机制尚不完全清楚。虽然已经证实胆碱能抗炎途径是通过激活脾脏巨噬细胞烟碱型乙酰胆碱受体α7(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n ACh R)抑制系统促炎因子生产的,但它不能完全解释远端组织炎症的调节,提示有另外的机制存在。我们假设迷走神经可以调节单核细胞α7n ACh R表达,脾脏是必需位点。本研究目的就是验证这一假设。为观察脾脏、迷走神经对单核细胞α7n ACh R表达的影响,小鼠行脾切除术、腹腔迷走神经切断术,分为脾切除组和假手术组、迷走神经切断组和假手术组。7天后,各组小鼠从球后静脉丛取血,分离外周血单核细胞,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测外周血单核细胞中α7n ACh R的表达水平。为研究迷走神经在脾脏调节单核细胞α7n ACh R表达的机制,我们以反转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法分析了迷走神经切断小鼠神经相关的神经调节蛋白1(neuregulin-1,NRG-1)在脾脏的表达。在体外观察了NRG-1对来自迷走神经切断小鼠外周单核细胞α7n ACh R表达的影响。为了解NRG-1的作用途径,我们分析了NRG-1受体Er BB(Epidermal growth factor-receptor family of tyrosine kinases)在单核细胞的表达。之后,以NRG-1受体Erb B4的阻断抗体处理这些单核细胞,以RT-PCR分析NRG-1对单核细胞α7n ACh R表达的影响。为了解单核细胞α7n ACh R表达缺失对外周多组织炎症状态的影响,我们用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,诱导炎症常用工具药)和尼古丁(常用的α7n ACh R受体激动剂)刺激迷走神经切断组小鼠和假手术组小鼠,以酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)法测定小鼠血清及脾脏、肝脏、骨骼肌中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)水平。我们发现脾切除术或腹腔迷走神经切断术可消除外周血单核细胞中α7n ACh R的表达。Western blot结果显示假手术组小鼠外周血单核细胞有明显的α7n ACh R条带而脾切除组和迷走神经切断组没有。在迷走神经切断小鼠发现脾脏NRG-1表达显著低下,提示NRG-1可能参与单核细胞α7n ACh R表达。在体外,NRG-1的加入可以诱导迷走神经切断小鼠的单核细胞表达α7n ACh R。对这些单核细胞NRG-1受体的分析显示,Er BB2和Er BB3在单核细胞表达水平低于测定阈值,只有Er BB4显著表达。在抗体阻断Erb B4后,NRG-1的加入不能诱导Erb B4阻断的单核细胞α7n ACh R m RNA表达。此外,迷走神经切断7天后,LPS可以导致迷走神经切断小鼠血浆、肝脏、肾脏和骨骼肌中促炎因子TNF-α和IL-1β的显著增加;尼古丁加入可以降低假手术小鼠血浆及这些组织中TNF-α和IL-1β水平,但是并不能降低迷走神经切断小鼠中脂多糖诱导的血清、肝脏、脾脏和骨骼肌中TNF-α和IL-1β水平的增加,提示迷走神经在脾脏介导的单核细胞α7n ACh R表达参与了外周多组织炎性状态的调节。我们的研究结果揭示,迷走神经通过NRG-1/Erb B4信号途径调节单核细胞α7n ACh R表达,脾脏是必需的位点。迷走神经在脾脏介导的单核细胞α7n ACh R表达参与了外周多组织炎症的调节,是炎症调节和慢性炎症形成的关键。

关键词：脾 α7nachr 单核细胞迷走神经神经调节蛋白-1 炎症

HIIT/MICT降低高脂膳食大鼠肠道炎症反应及α7nachr作用之探析

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HIIT/MICT降低高脂膳食大鼠肠道炎症反应及α7nAChR作用之探析

作者：王伟欢河北师范大学

学位级别：硕士

研究目的:高脂膳食后,机体可通过释放促炎因子,导致肠道炎症、肥胖等等一系列相关慢性代谢性疾病的发生。长时间规律运动可通过调节抗炎机制、降低炎症因子表达等减少肠道炎症反应。α7nachr是迷走神经抗炎通路中的重要受体蛋白,其表达... 详细信息

研究目的:高脂膳食后,机体可通过释放促炎因子,导致肠道炎症、肥胖等等一系列相关慢性代谢性疾病的发生。长时间规律运动可通过调节抗炎机制、降低炎症因子表达等减少肠道炎症反应。α7nachr是迷走神经抗炎通路中的重要受体蛋白,其表达的升高可抑制炎症通路NF-κΒ炎症信号通路的转导,降低肠道炎症反应。目前,高强度间歇训练(HIIT)与中等强度持续训练(MICT)对高脂膳食导致的慢性肠道炎症的影响与机制尚未完全阐明,运动对肠道α7nachr蛋白表达的影响尚不明确。本研究通过实验观察HIIT与MICT对高脂膳食大鼠肠道组织形态、α7nachr、NF-κΒp65及TNF-α蛋白的影响,对比两种运动方案对降低高脂膳食大鼠肠道炎症反应效果的不同,并探讨α7nachr在其中发挥的作用,为运动预防高脂膳食引起的肠道炎症提供相关实验依据。研究方法:5周龄健康雄性SD大鼠32只,适应性喂养1周,随机分为普通膳食安静组(CC组,n=8只),高脂膳食安静组(FC组,n=8只),高脂膳食MICT组(FM组,n=8只),高脂膳食HIIT组(FH组,n=8只)。采用动物跑台对大鼠进行为期12周运动干预,FM组大鼠进行70%V?Omax强度的跑台持续运动,FH组大鼠进行以40%～45%V?Omax和95%～99%V?Omax强度交替的跑台运动,确保FM与FH组大鼠的跑动距离相同。取材前记录大鼠最后体重(kg)与体长(cm),计算Lee’s指数。HE染色用以观察肠道组织形态结构变化,血脂试剂盒检测血清LDL、HDL、TG和FFA水平,ELISA检测血清TNF-α含量,免疫荧光法观察大鼠肠道α7nachr、NF-κΒp65定位与荧光表达,Western Blot检测肠道NF-κΒp65、TNF-α与α7nachr蛋白的表达。采用SPSS25.0统计软件分析处理数据。以CC组为普通膳食安静组,对FC组高脂膳食的作用进行分析,采用独立样本t检验。以FC组为高脂膳食安静对照组,对FM、FH训练的效果进行分析比较,采用单因素方差分析,LSD法进行两组间的多重比较。探讨大鼠体重、α7nachr、NF-κΒp65及TNF-α蛋白表达之间的关系,采用Pearson相关分析。结果:1.4组大鼠的原始体重无差异(P>0.05);12周干预后,FC组大鼠体重(kg)较CC组显著增加(661.30±31.68 vs 544.36±20.40,P0.05)。2.FC组大鼠12周总摄食量(g)少于CC组(2035.30±76.39 vs 2382.65±146.11,P7±386.29 vs 8148.66±534.18,Pα7nachr表达量则明显降低(Pα7nachr表达量显著增加(Pα7nachr荧光强度降低,但无统计学差异;与FC组相比,FM、FH组NF-κΒp65平均荧光强度降低(Pα7nachr平均荧光强度明显增加(Pα7nachr平均荧光强度高于FM组(P7.Pearson相关分析显示,大鼠体重和肠道炎症因子NF-κΒp65、TNF-α蛋白表达呈正相关

关键词：肠道炎症 NF-κΒ α7nachr HIIT MICT 高脂膳食