检索结果-南通市图书馆

重组大肠杆菌产耐热α-l-鼠李糖苷酶高密度发酵条件的优化

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

安徽化工 2024年第1期50卷 69-74页

作者：葛林刘英英周芳名展凌玲苏州健雄职业技术学院生物医药学院江苏太仓215411

为了减少乙酸的生成,提高重组大肠杆菌生产耐热α-l-鼠李糖苷酶的产量,考查了指数流加培养、两阶段指数流加培养、诱导温度、诱导pH对重组大肠杆菌发酵生产耐热α-l-鼠李糖苷酶(TstRhaA)过程中乙酸含量和酶产量的影响。确定最佳发酵工艺... 详细信息

为了减少乙酸的生成,提高重组大肠杆菌生产耐热α-l-鼠李糖苷酶的产量,考查了指数流加培养、两阶段指数流加培养、诱导温度、诱导pH对重组大肠杆菌发酵生产耐热α-l-鼠李糖苷酶(TstRhaA)过程中乙酸含量和酶产量的影响。确定最佳发酵工艺:诱导前比生长速率0.2 h^(-1),诱导后比生长速率0.18 h^(-1),诱导温度33℃,pH 7.2。在最佳发酵工艺条件下,乙酸浓度始终保持在0.8 g/l以下,菌体干重(DCW)最大为69.6 g/l,最高酶活力为589.0 U/ml,是摇瓶发酵的23.4倍,实现了重组大肠杆菌高密度发酵生产TstRhaA。研究结果表明,调节大肠杆菌高密度发酵过程中乙酸含量在合适范围内,能够实现TstRhaA的高效生产,这对其他酶的高密度表达具有重要指导意义。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶大肠杆菌乙酸高密度发酵

山梨醇对黑曲霉源α-l-鼠李糖苷酶(r-Rha1)热稳定性的影响

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

食品与生物技术学报 2022年第10期41卷 96-103页

作者：叶家影孙江李文静倪辉李利君李清彪集美大学海洋食品与生物工程学院福建厦门361021 集美大学福建省食品微生物与酶工程重点实验室福建厦门361021 集美大学厦门市食品生物工程技术研究中心福建厦门361021

提高酶热稳定性是工业酶属性改造的重要目标。山梨醇作为广泛应用于提高酶稳定性的外源添加剂,目前对其影响酶热稳定性的机制仍不明确。因此,作者以黑曲霉源α-l-鼠李糖苷酶(r-Rha1)为研究对象,通过热失活动力学、圆二色谱和荧光光谱的... 详细信息

提高酶热稳定性是工业酶属性改造的重要目标。山梨醇作为广泛应用于提高酶稳定性的外源添加剂,目前对其影响酶热稳定性的机制仍不明确。因此,作者以黑曲霉源α-l-鼠李糖苷酶(r-Rha1)为研究对象,通过热失活动力学、圆二色谱和荧光光谱的谱学分析,研究山梨醇对α-l-鼠李糖苷酶热稳定性的影响机制。结果表明,在60~70℃下,加入山梨醇可改善α-l-鼠李糖苷酶的热稳定性;在60、65、70℃条件下,加入1.2 mol/l山梨醇可分别将半衰期提高29、25、10倍;圆二色谱和荧光光谱结果表明山梨醇通过增强α-l-鼠李糖苷酶的表面疏水活性和结构刚性,从而提高其热稳定性。通过探究山梨醇对α-l-鼠李糖苷酶热稳定性的影响,进一步证明山梨醇提高酶热稳定性的普遍适用性,同时为后续α-l-鼠李糖苷酶的工业应用提供了参考。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶山梨醇热稳定性荧光光谱圆二色谱

极耐热α-l-鼠李糖苷酶的性质及其在异槲皮素制备中的应用研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

食品与生物技术学报 2023年第1期42卷 102-111页

作者：卢姗张珊珊邹康卢昌宁赵林果南京林业大学化学工程学院江苏南京210037

l-鼠李糖苷酶可特异性切除糖苷类化合物上连接的α-l-鼠李糖基,已被广泛用于食品、医药等工业领域。作者旨在获得耐受高温的α-l-鼠李糖苷酶,提高工业生产的效率和降低使用成本。首先对嗜热菌Sulfolobus islandicus来源的α-l-鼠李糖苷... 详细信息

l-鼠李糖苷酶可特异性切除糖苷类化合物上连接的α-l-鼠李糖基,已被广泛用于食品、医药等工业领域。作者旨在获得耐受高温的α-l-鼠李糖苷酶,提高工业生产的效率和降低使用成本。首先对嗜热菌Sulfolobus islandicus来源的α-l-鼠李糖苷酶基因进行克隆及大肠杆菌的异源表达,随后测定了系列酶学性质,接着优化了该酶制备异槲皮素的酶法制备工艺。结果表明:重组酶SisRha在90℃下酶活力最佳,具有极好的热稳定性,其在80℃下孵育120 min后酶活力几乎没有损失;最适反应pH为5.5,在pH 4.5~7.0时,pH稳定性良好;重组酶SisRha对人工底物对硝基苯酚鼠李糖糖苷(p NPR)的Km值为(0.15±0.03) mmol/l,Vmax值为(6.26±0.51)U/mg,k_(cat)值为(10.48±0.86) s^(-1);对底物p NPR、芦丁、朝藿定C、柚皮苷、橘皮苷和淫羊藿苷的比活力分别为25.06、11.89、6.74、3.14、2.77、0.42 U/mg。重组酶SisRha转化芦丁生成异槲皮素的适宜工艺为:用酶量0.40 U/ml,在85℃、pH 5.0的条件下反应1 h,可将2 mmol/l芦丁几乎全部转化,摩尔转化率高达98.56%。本研究丰富了现有的α-l-鼠李糖苷酶资源,为嗜热菌来源的α-l-鼠李糖苷酶的研究奠定了基础,同时提供了一种高温转化芦丁制备异槲皮素的方法。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶嗜热菌热稳定性芦丁异槲皮素

鸟肠球菌(Enterococcus avium)中α-l-鼠李糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学通报 2022年第1期49卷 49-60页

作者：郑鼎玉陈婕郑紫云卢丹丹杨官娥山西医科大学药学院山西太原030001

【背景】前期工作中筛选出一株产α-l-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。α-l-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和... 详细信息

【背景】前期工作中筛选出一株产α-l-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。α-l-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值。【目的】克隆、表达鸟肠球菌中α-l-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究。【方法】以鸟肠球菌(Enterococcus avium)strain 352基因组中推定的α-l-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列。以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli Bl21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以p NPR为底物测定重组蛋白的酶学性质。【结果】重组蛋白Ea Rha1分子量大小约为130 k Da。以p NPR为底物,Ea Rha1最适p H是7.0,最适温度为50℃,在p H 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活。金属离子对Ea Rha1有不同程度的促进或抑制作用。甲醇对Ea Rha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强。酶动力学常数K_(max)和V_(max)分别为0.35 mmol/l和4.2μmol/(mg·min)(R^(2)=0.999)。Ea Rha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁。【结论】通过对重组蛋白Ea Rha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶基因克隆蛋白表达酶学性质

α-l-鼠李糖苷酶发酵制备工艺研究与酶制剂剂型开发

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

α-L-鼠李糖苷酶发酵制备工艺研究与酶制剂剂型开发

作者：刘宁南昌大学

学位级别：硕士

α-l-鼠李糖苷酶(α-l-rhamnosidase)作为一种糖苷水解酶,可以专一性水解黄酮类化合物中与鼠李糖相连的糖苷键,从而切除鼠李糖,提高黄酮类化合物的水溶性和生物活性,在食品、医药等领域具有重要的应用价值。目前α-l-鼠李糖苷酶在工业... 详细信息

α-l-鼠李糖苷酶(α-l-rhamnosidase)作为一种糖苷水解酶,可以专一性水解黄酮类化合物中与鼠李糖相连的糖苷键,从而切除鼠李糖,提高黄酮类化合物的水溶性和生物活性,在食品、医药等领域具有重要的应用价值。目前α-l-鼠李糖苷酶在工业化生产中尚存在产量低、成本高、酶活不稳定的瓶颈。针对上述问题,本论文开展相关基础与应用研究。简单而言,首先以前期实验室构建获得的一株产α-l-鼠李糖苷酶的基因工程菌G5为出发菌株,对其产酶历程进行了研究。在获得初步数据的基础上,分别通过单因素和响应曲面实验优化了G5发酵产酶的培养基。为降低工业化生产成本,寻找符合生产实践的培养基,对原高价值的培养基进行了替代实验,寻找价格低廉适合G5发酵产酶的培养基组合,并以新培养基进行小试规模发酵罐研究。在发酵所得酶液基础上,利用不同工艺制备出酶液和酶粉两种酶制剂剂型。为解决上述游离酶制剂存在的酶活稳定差的问题,进一步研究了α-l-鼠李糖苷酶的固定化工艺,并评价了固定化酶的保存及应用特性。具体而言:1、对G5菌株的发酵历程进行研究,确定最佳的发酵产酶时间为96 h。通过G5菌株发酵产酶培养基的单因素试验,确定培养基中各组分的含量:酵母浸粉含量为1.2 g/100m l,蛋白胨含量为1.0 g/100m l,YNB含量为8.0 m l/100m l,生物素含量为200μl/100m l。通过Box-Behnken设计了五因素响应曲面优化实验,确定当发酵培养基中酵母浸粉含量为1.40 g/100m l,蛋白胨含量为1.16g/100m l,YNB含量为7.53 m l/100m l,生物素含量为292.85μl/100m l,p H为6.17时,理论上最大酶活力可以达到1723.47 U/m l,通过实验验证的实际酶活力为1749 U/m l,比优化前提高了35%。2、通过对十组工业化培养基组合进行筛选,确定了最优组合为麦芽汁+玉米浆,并对玉米浆干粉的添加量进行单因素试验,确定了玉米浆干粉添加量为1%。对新培养基的培养条件进行单因素试验,确定最佳的接种量为4%,最佳p H为6.0,最佳甲醇浓度为0.5%。通过对原培养基和新培养基的发酵产酶的对比,原培养基摇瓶培养条件下酶活力为1749 U/m l,原培养基发酵罐培养条件下酶活力2905 U/m l;新培养基摇瓶培养条件下酶活力为1237 U/m l,新培养基发酵罐培养条件下酶活力2567 U/m l。通过成本核算,原培养基发酵罐培养条件下每单位酶活力的成本为7.81×10元。新培养基发酵罐培养条件下每单位酶活力的成本为2.5×10元。原培养基的酶活单位成本是新培养基的31.24倍,因此虽然原培养基的酶活力比新培养基高,但新培养基的单位酶活成本比原培养基低,使用新培养基可以大大降低成本。3、为对不同剂型的酶制剂进行评价,将G5发酵液经离心微滤后,再超滤浓缩。以浓缩液为基础,通过缓冲液稀释制成液体酶制剂,通过真空低温干燥制备成热干燥酶粉,通过真空冷冻干燥制备成冷冻干燥酶粉。比较了上述三种工艺对酶活的损失,及所得酶制剂的储存稳定性。结果表明干燥过程会造成酶变性失活,其中热干燥对酶活损失最大(下降28%),冷冻干燥对酶活损失较小(下降10%),而通过缓冲液稀释操作对酶活的影响最小。在储存时间稳定性上,固体酶粉制剂显著高于液体酶,液体酶在室温下20 d左右就已经开始发霉变质。在储存温度稳定性上,固体酶均高于液体酶,其中冷冻干燥酶又略高于热干燥酶。4、以聚丙烯酰胺-海藻酸钠作为包埋材料制作凝胶小球,确定了聚丙烯酰胺-海藻酸钠最佳浓度配比为6%聚丙烯酰胺、3%海藻酸钠,交联剂戊二醛的最佳浓度为2%,最佳活化时间为3 h,最佳交联时间为12 h。探究固定化α-l-鼠李糖苷酶的底物特异性,确定了固定化α-l-鼠李糖苷酶可以水解芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷,不水解淫羊藿苷。对固定化α-l-鼠李糖苷酶对不同底物的水解能力进行探究,确定了固定化α-l-鼠李糖苷酶对不同底物的水解能力为:新橙皮苷>芦丁>柚皮苷>橙皮苷。5、探究固定化α-l-鼠李糖苷酶与游离酶的酶学性质,确定了两者的最适温度均为50℃,在温度耐受性方面,固定化α-l-鼠李糖苷酶在低温下更稳定。确定了两者的最适p H均为5,固定化操作可以提高酶的p H稳定性。固定化α-l-鼠李糖苷酶在四次重复利用后相对酶活仍有76%,探究固定化α-l-鼠李糖苷酶与游离酶的储存稳定性,固定化α-l-鼠李糖苷酶在储存90 d后相对酶活力为73%,游离酶第30 d的相对酶活力为75%。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶毕赤酵母培养基优化酶固定化

磁性金属有机框架材料固定α-l-鼠李糖苷酶及其类黄酮生物转化应用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

磁性金属有机框架材料固定α-L-鼠李糖苷酶及其类黄酮生物转化应用

作者：方艺华南理工大学

学位级别：硕士

α-l-鼠李糖苷酶（EC 3.***.1.40,α-l-rhamnosidase,α-RHAs）是一类特异性水解天然黄酮类化合物末端l-鼠李糖基的水解酶。黄酮类化合物脱去一分子鼠李糖后其生物利用度和生物活性有所提高,因此α-l-鼠李糖苷酶被广泛应用于制药、化妆品... 详细信息

α-l-鼠李糖苷酶（EC 3.***.1.40,α-l-rhamnosidase,α-RHAs）是一类特异性水解天然黄酮类化合物末端l-鼠李糖基的水解酶。黄酮类化合物脱去一分子鼠李糖后其生物利用度和生物活性有所提高,因此α-l-鼠李糖苷酶被广泛应用于制药、化妆品和食品行业。然而游离酶稳定性低、无法重复利用、酶分离困难等问题限制了其大规模工业化应用。与游离酶相比,固定化酶具有分离方便、总反应成本低等优点,可增强酶的稳定性和可重复使用性,使酶更好的应用于工业生产。金属有机框架材料（Metal-Organic Frameworks,MOFs）是一种金属离子和有机配体之间通过自组装形成的具有二维或三维晶体结构的延伸多孔网络材料,它具有结晶度高、比表面积大、以及结构可设计性和孔径的可控性等优点,可作为一种良好的新型固定化酶材料。在MOFs中引入磁性粒子可以克服材料回收的限制,扩大MOFs的应用范围。基于此,本工作制备了新型磁性金属有机框架材料,用于固定化α-l-鼠李糖苷酶以提高酶的稳定性和重复使用性,且利用金属配位增加橙皮苷、芦丁的水溶性,将固定化酶应用于黄酮-铜络合物改善其生物利用度和生物学活性,为解决生物转化黄酮过程中底物难溶的问题提供新方向。主要研究内容及结论如下:1、以FeO纳米颗粒为磁芯,经过包硅、氨基化改性和MIl-100（Fe）包覆后成功制备FeO@Si O@MIl-100（Fe）材料,通过红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）和震动样品磁强计（VSM）验证了材料的性能,结果表明,FeO@Si O@MIl-100（Fe）材料为表面光滑且颗粒之间分散较好的球形颗粒,由FeO@Si O-NH核和MIl-100（Fe）壳组成,具有优异的磁响应性和再分散性。对FeO@Si O@MIl-100（Fe）固定α-l-鼠李糖苷酶的条件进行优化,确定最适固定化条件为:酶浓度为3 mg/m l,缓冲液p H为7.0,固定时间为2 h,在此条件下得到的载体的蛋白负载量为51.61 mg/g,固定化酶的比酶活力为4.10 U/g。另外,探究了FeO@Si O@MIl-100（Fe）材料固定α-l-鼠李糖苷酶的机制,结果表明吸附固定过程更符合langmuir吸附模型和拟二级动力学模型,表明该吸附固定过程属于单分子层吸附,主要由化学吸附机制控制,如共价结合,并且吸附固定过程是自发进行的、吸热的。2、以对硝基苯基-α-l-吡喃鼠李糖苷（p NPR）为催化底物研究游离α-l-鼠李糖苷酶和固定化酶(FeO@Si O@MIl-100（Fe）@Rha)的酶学性质。分析发现,固定化酶的最适温度和最适p H分别是60℃和7.0,与游离酶相比,固定化酶具有更好的热稳定性,在p H 5.0～8.0范围内维持较好的p H稳定性。动力学参数结果表明,固定化酶的米氏常数K(1.72 mmol·l)略高于游离酶K(1.39 mmol·l),说明固定化酶与底物的亲和力有所下降。重复使用5次后具有60%以上的残余酶活力,表明该固定化酶具有良好的重复利用性。Ca、Fe、Zn和Mn可以促进α-l-鼠李糖苷酶的酶活力,Cu和Fe对酶活性有一定程度的抑制作用。底物特异性结果表明,固定化酶水解黄酮类化合物的能力大小依次为:p NPR、橙皮苷、芦丁、柚皮苷、新橙皮苷,并且酶倾向于水解α-1-糖苷键,其次是α-1,6-糖苷键,最后为α-1,2-糖苷键。3、用固相配合法合成橙皮苷-铜络合物和芦丁-铜络合物,根据紫外可见分光光度计（UV-Vis）和FTIR分析得出,橙皮苷和芦丁通过5位羟基和4位羰基与Cu（Ⅱ）螯合。用FeO@Si O@MIl-100（Fe）@Rha转化橙皮苷-铜配合物和芦丁-铜配合物,通过单因素实验得到固定化酶水解橙皮苷-铜配合物和芦丁-铜配合物的最佳条件:反应温度分别50℃和60℃,酶解体系p H均为6.0,酶添加量分别为8 mg和10 mg,酶解时间分别为120min和80 min。然后,通过EDTA解配位分离提纯酶解产物,通过UV-Vis、电喷雾源高分辨质谱（ESI-MS）分析确认产物为橙皮素-7-O-葡萄糖苷和异槲皮素。进一步通过分子对接软件分析可知,橙皮苷-铜配合物和芦丁-铜配合物与α-l-鼠李糖苷酶蛋白的结合自由能分别为-2.26 kcal/mol和-4.53 kcal/mol,表明配体与酶蛋白具有较好的亲和力。橙皮苷-铜配合物和芦丁铜配合物通过黄酮上的羟基与α-l-鼠李糖苷酶蛋白活性位点的氨基酸残基相互作用形成氢键。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶磁性金属有机框架材料固定化酶配位增溶

α-l-鼠李糖苷酶对柑橘类黄酮二糖苷底物选择性的快速评价与分子改造

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

α-L-鼠李糖苷酶对柑橘类黄酮二糖苷底物选择性的快速评价与分子...

作者：侯雪婷山西大学

学位级别：硕士

α-l-鼠李糖苷酶属于糖苷水解酶,可特异性催化如芦丁、橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷等天然糖苷末端的α-l-鼠李糖基。作为一类重要的生物催化剂,其广泛存在于自然界,在食品、医药、美容、化工等行业具有极高的应用价值。然而,目前缺乏高效... 详细信息

α-l-鼠李糖苷酶属于糖苷水解酶,可特异性催化如芦丁、橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷等天然糖苷末端的α-l-鼠李糖基。作为一类重要的生物催化剂,其广泛存在于自然界,在食品、医药、美容、化工等行业具有极高的应用价值。然而,目前缺乏高效、特异性的、针对α-l-鼠李糖苷酶催化活性的评价方法,且缺少稳定性好,催化活性高的α-l-鼠李糖苷酶。急需开发高效的建库策略以快速获得性能优良的α-l-鼠李糖苷酶,从而促进其在工业生产中的发展与应用。本研究首先对4种柑橘类黄酮二糖苷橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷及其对应苷元橙皮素与柚皮素在酸性、碱性和甲醇三种条件下进行250 nm-550 nm波长扫描。结果显示柑橘类黄酮二糖苷与其对应苷元在碱性条件下具有光谱差异性,即苷元在碱性条件下于320 nm处有特征峰。因此,可通过α-l-鼠李糖苷酶对柑橘类黄酮二糖苷脱鼠李糖基将其转化为黄酮葡萄糖苷,偶联β-D-葡萄糖苷酶催化黄酮葡萄糖苷生成对应苷元。利用紫外-可见分光光度法测定320 nm处吸收值对苷元进行定量,从而实现对α-l-鼠李糖苷酶催化柑橘类黄酮二糖苷活性的评价。基于以上研究,本课题选取了一系列肠道细菌源α-l-鼠李糖苷酶HFM-RhaA、HFM-RhaC、HFM-Rha78、BtRha78A、BtRha78D联合嗜热、高活性β-D-葡萄糖苷酶Tn Bgl1A-DM,通过紫外-可见分光光度法快速评价其对4种柑橘类黄酮二糖苷的底物选择性。研究结果表明:HFM-RhaA、HFM-Rha78和BtRha78D对新橙皮苷和柚皮苷的催化活性较高(偏好水解α-1,2糖苷键),BtRha78A可特异性水解橙皮苷和芸香柚皮苷(α-1,6糖苷键),而对新橙皮苷和柚皮苷无水解活性。HFM-RhaC对4种柑橘类黄酮二糖苷均可水解,其中,催化橙皮苷和芸香柚皮苷的能力较强(偏好水解α-1,6糖苷键)。随后,固定酶浓度与反应时间,通过高效液相色谱法检测以上5个α-l-鼠李糖苷酶对4种柑橘类黄酮二糖苷的催化活性,色谱峰图显示结果与上述一致,证实了紫外-可见分光光度法的可行性。其次利用新型半理性分子改造策略—六密码子组合突变(Six Codons Combinatorial Mutagenesis,SCCM)对来源于多形拟杆菌的α-l-鼠李糖苷酶BtRha78A进行分子改造,以提高其对橙皮苷的催化活性。基于BtRha78A三级结构、同源序列比对等相关信息的分析,确定底物结合口袋入口处的三个突变靶标基序。利用全质粒PCR构建六密码子组合突变体文库、紫外可见-分光光度法初筛、高效液相色谱法终筛,经测序获得4个水解能力高于野生型的优秀突变体,分别是TM1-6-F5、TM1-6-H6、TM1-7-G1、TM1-8-F9。高效液相色谱法检测野生型和突变体对橙皮苷的生物转化率与反应时间的关系。其中,TM1-6-F5催化橙皮苷的活性最高,当反应时间为20 min时,转化率已达50.67%,而野生型在反应时间为60 min时,对橙皮苷的生物转化率仅有53.97%。最后,对优秀突变体的酶动力学常数、热稳定性、底物选择性等参数进行测定。结果显示,突变体的各项动力学常数均大于野生型、TM1-6-F5的催化效率最高,k/K是野生型的1.4倍。4个突变体的热稳定性相对野生型有所下降,其中,TM1-6-F5、TM1-8-F9在37℃下的热稳定性较好,保温240 min仍具有95%以上的酶活。此外,通过底物选择性的测定发现,4个突变体对目标底物橙皮苷、芦丁、pNPR的催化活性相较于野生型均有不同程度的变化。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶柑橘类黄酮二糖苷底物选择性紫外-可见分光光度法六密码子组合突变

固定化α-l-鼠李糖苷酶和双相连续转化体系制备淫羊藿苷的工艺及性能研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

固定化α-L-鼠李糖苷酶和双相连续转化体系制备淫羊藿苷的工艺及...

作者：张宇航陕西理工大学

学位级别：硕士

淫羊藿(Epimedium)是我国传统中药材,在陕西、四川、贵州等省份山区均有分布。2020版《中国药典》收录的淫羊藿品种有淫羊藿(E.brevicornum Maxim.)、柔毛淫羊藿(E.pubescens Maxim.)、箭叶淫羊藿(E.sagittatum Maxim.)、朝鲜淫羊藿(E.k... 详细信息

淫羊藿(Epimedium)是我国传统中药材,在陕西、四川、贵州等省份山区均有分布。2020版《中国药典》收录的淫羊藿品种有淫羊藿(E.brevicornum Maxim.)、柔毛淫羊藿(E.pubescens Maxim.)、箭叶淫羊藿(E.sagittatum Maxim.)、朝鲜淫羊藿(E.koreanum Nakai)和巫山淫羊藿(E.wushanense T.S.Ying)5个品种。巫山淫羊藿为2010年新增加品种,其特点为活性成分朝藿定C含量较高可达4～7%,而淫羊藿苷含量常低于0.5%甚至检测不出。淫羊藿苷是其提取物及下游制剂的标志性成分,其结构与朝藿定C相比仅在C-3位上少一个鼠李糖基,但经典活性和原料药市场价格却远高于朝藿定C。研究中多通过酸水解、微生物发酵和酶催化等技术切除C-3位末端鼠李糖基将朝藿定C转化为淫羊藿苷,但存在环境污染、副产物多及酶不能重复利用等问题。本课题以巴山区域主产的巫山淫羊藿为材料,开发基于固定化酶及双相连续转化体系制备淫羊藿苷的新工艺,为淫羊藿苷生产提供支持。论文主要实验及结果如下:(1)巫山淫羊藿药材中朝藿定C的快速制备工艺。静态吸附与解吸实验筛选确定HPD-5000型大孔吸附树脂对朝藿定C的吸附与解吸性能最佳,分别为51.73 mg/g和96.07%;动态实验优化确定上柱液样品浓度为3.5 mg/m l、体积流量为6.0 BV/h、最大上样体积为11.3 BV,经9.0 BV/h的5.0 BV 10%乙醇除杂和70%乙醇洗脱,洗脱段浓缩产物朝藿定C纯度为55.27%,收率为81.78%;粗品经动态轴向压缩柱色谱(DAC-HB50)精制,最佳分离条件为乙腈∶水(24∶76)、检测波长270 nm、流速100m l/min、进样量5 m l,样品浓度100 g/l,精制后朝藿定C纯度为98.91%,收率为80.36%,产物结构经核磁和质谱确定。(2)酶的筛选及水解条件优化。以朝藿定C转化率和淫羊藿苷得率为指标,先对4种不同的水解酶进行筛选,再对酶水解条件进行优化。结果表明α-l-鼠李糖苷酶为最佳水解酶,游离酶水解的最适条件为:温度50℃、p H为4.5的磷酸盐缓冲液、底物/酶质量比为1∶10,水解96 h,朝藿定C水解效率达97.36%,主要产物结构经核磁和质谱确定为淫羊藿苷,淫羊藿苷得率为95.77%。(3)α-l-鼠李糖苷酶固定化条件优化及应用。采用共价键偶联法,优化获得最佳的固定化条件为:第一步以介孔二氧化硅SBA-15为载体,先以硅烷化试剂(APTES)对其进行氨基化修饰获得氨基化SBA-15(SBA-15-NH);第二步在35℃下加入7%戊二醛(GA)为偶联剂与氨基发生席夫碱反应4 h,引入醛基获得醛基化SBA-15(SBA-15-CHO);第三步在35℃、p H为3.5的磷酸盐缓冲液体系中,加入50 mg载体SBA-15-CHO与α-l-鼠李糖苷酶制剂16 mg进行席夫碱反应4 h,以共价键结合的方式获得固定化α-l-鼠李糖苷酶(SBA-15-ENZ)。固定化α-l-鼠李糖苷酶的载酶率、酶活回收率及酶活力依次为80.75%、66.25%、3.3125 U/g。在温度50℃、底物浓度200μg/m l的p H为4.5磷酸盐缓冲液中,加入固定化酶50 mg,水解32 h,重复利用4次后,转化率仍达到64.21%;经表征数据FI-IR和N吸附与脱附表明SBA-15载体已完成了基团的功能化修饰及酶的固定化;XRD和SEM数据表明经修饰和酶固定化后载体SBA-15原有的六方介孔及棒状结构保持不变。结果表明经SBA-15载体固定化的α-l-鼠李糖苷酶稳定性良好。(4)双相体系水解朝藿定C制备淫羊藿苷的工艺研究。确定乙酸丁酯为最佳有机溶剂;在缓冲液与乙酸丁酯体积比为1∶3、底物/酶质量比1∶30、底物浓度2 mg/m l、搅拌水解12 h,酶液循环使用4次,朝藿定C转化率分别为97.12%、95.09%、88.41%、75.24%,产物淫羊藿苷有机相转移率达到90.42%;将优化工艺应用到巫山淫羊藿提取液中水解并进行体积放大500倍,朝藿定C转化率及产物淫羊藿苷有机相转移率均未明显下降,并实现与提取液中朝藿定A、朝藿定B等强极性化合物高效分离,淫羊藿苷纯度达到80%以上。该工艺实现了弱极性淫羊藿苷的生成及有机相转移一体化,降低了酶解反应过程的产物抑制,稳定性良好,设备要求低,具有放大生产应用前景。

关键词：巫山淫羊藿朝藿定C 淫羊藿苷 α-l-鼠李糖苷酶生物转化

碳源及阻遏蛋白CreA对黑曲霉产α-l-鼠李糖苷酶的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国食品学报 2016年第1期16卷 54-60页

作者：张霞李利君倪辉肖安风陈峰苏文金集美大学食品与生物工程学院福建厦门361021 福建省食品微生物与酶工程重点实验室福建厦门361021 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心福建厦门361021 美国克莱姆森大学食品科学、营养与包装科学系美国南卡罗琳娜州29634

【目的】研究碳源对黑曲霉JMU-TS528发酵α-l-鼠李糖苷酶的影响,并探讨葡萄糖阻遏黑曲霉合成α-l-鼠李糖苷酶的分子机制。【方法】分别用5种单一碳源进行摇瓶发酵,高效液相色谱法测定经黑曲霉发酵后产物中的α-l-鼠李糖苷酶活性;通过在... 详细信息

【目的】研究碳源对黑曲霉JMU-TS528发酵α-l-鼠李糖苷酶的影响,并探讨葡萄糖阻遏黑曲霉合成α-l-鼠李糖苷酶的分子机制。【方法】分别用5种单一碳源进行摇瓶发酵,高效液相色谱法测定经黑曲霉发酵后产物中的α-l-鼠李糖苷酶活性;通过在培养基中添加葡萄糖进行液态发酵,研究葡萄糖对黑曲霉JMU-TS528产α-l-鼠李糖苷酶的影响,并用实时定量PCR技术检测α-l-鼠李糖苷酶基因rha和葡萄糖抑制基因Cre A的相对表达量。【结果】黑曲霉JMU-TS528在以柚皮苷、橘皮苷、芸香苷和鼠李糖为唯一碳源时可分泌α-l-鼠李糖苷酶,以葡萄糖为唯一碳源时不能合成α-l-鼠李糖苷酶;培养基中添加葡萄糖后,黑曲霉发酵产物中α-l-鼠李糖苷酶活性降低,黑曲霉α-l-鼠李糖苷酶基因rha表达量降低,而葡萄糖抑制基因Cre A表达量上升。【结论】黑曲霉JMU-TS528菌株液态发酵条件下合成α-l-鼠李糖苷酶需要诱导物作为碳源,该菌株合成α-l-鼠李糖苷酶的能力受到葡萄糖的调节作用,此调控过程可能通过一个依赖阻遏蛋白Cre A的机制实现。

关键词： α-l-鼠李糖苷酶葡萄糖抑制基因CreA 实时定量多聚核苷酸链式反应黑曲霉