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作者：贠小芸广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:萜类化合物(Terpenoids)为主要存在于植物的根、茎、花、叶、花、果实中的天然产物。三萜及三萜皂苷是由6个异戊二烯单元组成的萜类化合物,化学结构复杂,药理活性多样。乌索烷型三萜皂苷是由α-香树脂醇(α-amyrin)衍生而来的五环... 详细信息

目的:萜类化合物(Terpenoids)为主要存在于植物的根、茎、花、叶、花、果实中的天然产物。三萜及三萜皂苷是由6个异戊二烯单元组成的萜类化合物,化学结构复杂,药理活性多样。乌索烷型三萜皂苷是由α-香树脂醇(α-amyrin)衍生而来的五环三萜类化合物。多种乌索烷型三萜,如熊果酸、18-去氢乌索酸等,具有抗菌消炎、抗血栓、保肝等生物学活性,有着较高的药物开发价值。可大多数植物所含的三萜及三萜皂苷组成成分复杂,含量不均,分离提纯提取困难,严重限制了它们的开发与利用。近年来,随着合成生物学的发展,异源生物合成使得大量获得有药用价值的天然活性成分成为了可能。因此,本论文根据合成生物学的原理,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WAT11为宿主,并结合酵母内源萜类合成通路相关关键酶基因的调控,构建高产α-amyrin的酵母菌株,为后期构建完整的三萜皂苷合成通路,并实现在酿酒酵母中持续、大量生产熊果酸、18-去氢乌索酸等乌索烷型三萜化合物奠定基础。方法:***11基因编辑靶点分析通过查阅文献,明确本实验室保存的酿酒酵母菌种WAT11的营养缺陷型。在NCBI上搜索各个缺陷基因在酿酒酵母S288c染色体的分布位置,提取基因组,PCR扩增各缺陷基因,测序,分析基因序列,了解WAT11营养缺陷基因的失活方式以及各个基因编码区的上下游序列,以营养缺陷基因位点作为基因编辑靶点。***11基因编辑根据靶位点的实际序列,用在线软件CHOPCHOP(http://***)设计gRNA序列,以带有trp1-gRNA序列的pRS42H-trp质粒为模板,用反向PCR(Inverse PCR,iPCR)方法扩增出含有目标靶位点gRNA序列的线性化片段,经T4连接酶环化后,构建各个靶位点的特定gRNA质粒。分别以酿酒酵母WAT11、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的基因组为模板,扩增MVA途径的关键基因,插入p426-GPD载体。设计带有相应靶位点同源臂的引物,扩增包含目的基因表达盒的供体片段,用CRISPR/Cas9技术实现目的基因的基因组整合或靶点的基因敲除,获得WAT11衍生菌株。***11衍生菌株代谢产物分析以相同条件培养WAT11衍生菌株,以角鲨烯为标示化合物评价衍生菌株的产量。用GC/MS测定三萜的共同中间体角鲨烯(经氧化、环合后可生成α-amyrin)含量,以WAT11为参照,筛选出角鲨烯产率最高的衍生菌株。进一步,将课题组前期构建的香树脂醇合酶基因IaAS1基因的表达质粒pEXPR-IaAS1转入该衍生菌株,获得带游离质粒的酵母菌株,与此同时用CRISPR/Cas9的技术构建将IaAS1基因表达盒整合进基因组的酵母菌株,比较带游离质粒菌株与整合基因组菌株的α-amyrin的产量,筛选出α-amyrin积累量较高的目标菌株。结果:1.确定了对WAT11基因编辑的靶点由文献可知,WAT11为trp1、ade2、can1、ura3、his3、leu2营养缺陷型菌株,且基因序列连续,不具内含子。此外,WAT11A萜类合成通路中二萜分支通路编码GGPPS的BTS1基因完整连续。故选定LEU2、TRP1、CAN1、URA3、ADE2、HIS3、BTS1这7个靶点作为基因编辑位点,进行后续实验。2.构建了10种WAT11衍生菌株针对萜类合成通路中tHMGR(记为t)、FPPS(f)、SS(s)、IPPI1(i1)、IPPI2(i2)、ACS(A),成功构建了WAT11t、WAT11f、WAT11s、WAT11i1、WAT11i2、WAT11ts、WAT11ti1、WAT11tf、WAT11tfA这9株基因敲入菌株,还构建了1株敲除二萜通路途径BTS1(g)基因的菌株WAT11Δg。在相同条件下培养72h,比较这10株酿酒酵母的角鲨烯产量,发现WAT11tfA菌株的角鲨烯产量比WAT11提高了近20倍。3.获得了高产α-amyrin的酿酒酵母工程菌将pEXPR-IaAS1表达质粒转入上述获得的WAT11tfA细胞,构建WAT11tfA/IaAS1菌株;用CRISPR/Cas9技术将IaAS1基因表达盒整合进WAT11tfA基因组的HIS3位点上,构建WAT11tfAX菌株。分别用SC-U/Gal和YPD培养基培养3 d,比较了2株菌株积累α-amyrin的情况。结果证明,与WAT11/IaAS1比较,WAT11tfA/IaAS1和WAT11tfAX菌株的α-amyrin产率均明显提高,WAT11tfA/IaAS1菌株的α-amyrin产量为4.67±0.21 mg/L,约是WAT11的21倍,WAT11tfAX菌株的α-amyrin产量为2.18±0.14mg/L,约是WAT11的10倍,WAT11t

关键词：酿酒酵母合成生物学 CRISPR/Cas9 α-香树脂醇代谢调控

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双波长薄层扫描法测定双降胶囊中a-香树脂醇的含量

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甘肃中医 1999年第5期12卷 59-60页

作者：杨扶德罗文蓉甘肃中医学院甘肃省中医院730050

采用双波长薄层扫描法测定双降胶囊中α香树脂醇的含量。本法测定准确，专属性强。平均回收率为１０１５０％，ＲＳＤ为３１７％（ｎ＝４）。

关键词：双降胶囊 α-香树脂醇薄层扫描法中药

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雷公藤中2,3-氧化鲨烯环化酶基因家族分析及功能表征

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药学学报 2021年第12期56卷 3370-3376页

作者：刘远屠李婵卢鋆夏梦高伟首都医科大学中医药学院北京100069 浙大城市学院医学院浙江杭州310015 首都医科大学北京世纪坛医院北京100038

雷公藤具有抗肿瘤、抗炎、免疫抑制等多种药理活性,是极具研究价值的药用植物。三萜类化合物是其发挥药理作用的主要活性成分之一,然而以雷公藤红素为主的三萜化合物在植物中含量低,化学合成困难,难以得到理想的产量。因此,解析雷公藤... 详细信息

雷公藤具有抗肿瘤、抗炎、免疫抑制等多种药理活性,是极具研究价值的药用植物。三萜类化合物是其发挥药理作用的主要活性成分之一,然而以雷公藤红素为主的三萜化合物在植物中含量低,化学合成困难,难以得到理想的产量。因此,解析雷公藤中三萜化合物生物合成途径,为异源合成这些化合物提供了行之有效的新思路。2,3-氧化鲨烯环化酶(OSC)是催化形成三萜母核多样性的关键酶基因,本研究基于雷公藤基因组和转录组数据,共挖掘出16条OSC基因,并对16条基因进行了生物信息学分析。系统进化树显示16条TwOSC蛋白主要聚为β-香树脂醇合酶、木栓酮合酶、多功能香树脂醇合酶和环阿屯醇合酶四支。成功克隆得到了TwOSC6,酵母表达和体外发酵结果显示TwOSC6可催化2,3-氧化鲨烯生成α-香树脂醇和β-香树脂醇,属于多功能香树脂醇合酶。以上研究为雷公藤三萜化合物的多样性提供了新的基因资源,为三萜化合物的生物合成提供了新的基因元件。

关键词：雷公藤 2 3-氧化鲨烯环化酶三萜 α-香树脂醇功能鉴定

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五环三萜酿酒酵母细胞工厂的构建

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食品与发酵工业 2021年第18期47卷 8-14页

作者：高惠芳邵明龙张显杨套伟徐美娟高晓冬饶志明工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

α-香树脂醇、羽扇豆醇和计曼尼醇作为重要的五环三萜化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种药理学功能。为构建五环三萜酿酒酵母细胞工厂,该研究运用CRISPR/Cas9技术,分别将编码长春花来源的α-香树脂醇合酶、洋甘草来源的羽扇豆醇合... 详细信息

α-香树脂醇、羽扇豆醇和计曼尼醇作为重要的五环三萜化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种药理学功能。为构建五环三萜酿酒酵母细胞工厂,该研究运用CRISPR/Cas9技术,分别将编码长春花来源的α-香树脂醇合酶、洋甘草来源的羽扇豆醇合酶和羊蹄甲来源的计曼尼醇合酶的基因整合至酿酒酵母基因组上,获得工程菌株S01、S02和S03。工程菌株在YPG培养基中发酵48 h,S01能生产50.7 mg/Lα-香树脂醇,S02羽扇豆醇产量达到45.8 mg/L,S03计曼尼醇产量为17.6 mg/L,表明五环三萜酿酒酵母细胞工厂构建成功。进一步在S01、S02和S03中过表达甲羟戊酸途径中的关键酶:鲨烯环氧酶,增加前体物质2,3-氧化鲨烯的供应,最终α-香树脂醇、羽扇豆醇和计曼尼醇产量分别达96.3、91.6和38.7 mg/L。该研究建立了三萜微生物合成平台,为构建五环三萜酸及其衍生物酿酒酵母细胞工厂奠定了理论和技术基础。

关键词： α-香树脂醇羽扇豆醇计曼尼醇五环三萜合成生物学酿酒酵母

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野菊花的化学成分研究

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中草药 2018年第22期49卷 5254-5258页

作者：刘磊磊肖卓炳吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室湖南张家界427000

目的研究野菊Chrysanthemum indicum花蕾的化学成分。方法采用薄层色谱、硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱及SephadexLH-20凝胶柱色谱等分离技术,对野菊花的化学成分进行分离研究,并运用NMR波谱技术鉴定化合物的结构。结果从野菊花的乙醇提取... 详细信息

目的研究野菊Chrysanthemum indicum花蕾的化学成分。方法采用薄层色谱、硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱及SephadexLH-20凝胶柱色谱等分离技术,对野菊花的化学成分进行分离研究,并运用NMR波谱技术鉴定化合物的结构。结果从野菊花的乙醇提取物中分离并鉴定了14个化合物,分别为豆甾-4-烯-3-酮(1)、棕榈酸金盏菊二醇(2)、棕榈酸16β,22α-二羟基假蒲公英甾醇(3)、α-香树脂醇(4)、乌苏-12-烯-3β,16β-二羟基(5)、12-烯-3β-羟基-乌苏-11-酮(6)、山金车二醇(7)、马尼拉二醇(8)、12-烯-3β-羟基-齐墩果-11-酮(9)、木犀草素(10)、芹菜素(11)、芹菜素-7,4′-二甲醚(12)、芫花素(13)、1-亚油酸甘油酸酯(14)。结论化合物1～6、10～12和14为首次从野菊花中分离得到。

关键词：野菊花棕榈酸16β,22α-二羟基假蒲公英甾醇 α-香树脂醇木犀草素芹菜素

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大果榕根的化学成分研究

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中草药 2013年第22期44卷 3127-3130页

作者：祁翠翠陈光英陈文豪宋小平韩长日海南师范大学化学与化工学院热带药用植物化学教育部重点实验室海南海口571127

目的对大果榕Ficus auriculata根的化学成分进行研究。方法采用正、反相硅胶色谱、凝胶色谱及重结晶等方法进行分离纯化,根据波谱数据及理化性质鉴定化合物结构。结果从大果榕根95%乙醇冷浸提取物的醋酸乙酯部位分离得到13个化合物,分... 详细信息

目的对大果榕Ficus auriculata根的化学成分进行研究。方法采用正、反相硅胶色谱、凝胶色谱及重结晶等方法进行分离纯化,根据波谱数据及理化性质鉴定化合物结构。结果从大果榕根95%乙醇冷浸提取物的醋酸乙酯部位分离得到13个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1)、α-香树脂醇(2)、6β-羟基-豆甾-4-烯-3-酮(3)、豆甾烷-3,6-二酮(4)、豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(5)、3-(1-羟乙基)-7-羟基异苯并呋喃酮(6)、(R)-(+)-de-O-methyllasiodiplodin(7)、前胡醇(8)、()-3,5-dimethyl-8-methoxy-3,4-dihydroisocoumarin(9)、(R)-()-mellein methyl ethe(r10)、5-formyl-8-hydroxy-3,4-dihydroisocoumarin(11)、(R)-()-5-methoxycarbonyl mellein(12)、β-胡萝卜苷(13)。结论除化合物1外,所有化合物均为首次从大果榕中分离得到,其中化合物4～12为首次从榕属植物中分离得到。

关键词：大果榕榕属 α-香树脂醇豆甾-7 22-二烯-3β 5α 6β-三醇前胡醇

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枫叶化学成分的研究

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中药材 2005年第4期28卷 294-295页

作者：蔡亚玲阮金兰华中科技大学同济医学院药学院武汉430030

目的:研究枫叶醇提物中的化学成分。方法:硅胶柱色谱及制备型HPLC色谱进行分离纯化,理化及光谱分析鉴定结构。结果:从枫叶的甲醇提取物中分得3个化合物,分别为:β-谷甾醇(β-sitosterol,Ⅰ)、α-香树脂醇(α- amyrin,Ⅱ)和齐墩果酮酸(ol... 详细信息

目的:研究枫叶醇提物中的化学成分。方法:硅胶柱色谱及制备型HPLC色谱进行分离纯化,理化及光谱分析鉴定结构。结果:从枫叶的甲醇提取物中分得3个化合物,分别为:β-谷甾醇(β-sitosterol,Ⅰ)、α-香树脂醇(α- amyrin,Ⅱ)和齐墩果酮酸(oleanonicacid,Ⅲ)。结论:以上化合物皆首次从枫叶中获得。

关键词：化学成分 HPLC色谱 α-香树脂醇硅胶柱色谱甲醇提取物齐墩果酮酸分离纯化分析鉴定 acid 化合物醇提物谷甾醇

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离舌橐吾干燥根中1个新的三萜皂苷

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中草药 2018年第18期49卷 4216-4219页

作者：刘坤贾艳菊槐雅萍河北经贸大学生物科学与工程学院河北石家庄050061 河北省人民医院河北石家庄050051

目的研究离舌橐吾Ligularia veitchiana干燥根的化学成分。方法采用溶剂法进行提取和萃取,采用硅胶柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱等方法进行分离纯化,根据波谱数据进行结构鉴定。结果从离舌橐吾干燥根中分离得到6个化合物,分别鉴定... 详细信息

目的研究离舌橐吾Ligularia veitchiana干燥根的化学成分。方法采用溶剂法进行提取和萃取,采用硅胶柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱等方法进行分离纯化,根据波谱数据进行结构鉴定。结果从离舌橐吾干燥根中分离得到6个化合物,分别鉴定为离舌橐吾苷B(1)、齐墩果酸(2)、β-谷甾醇(3)、α-香树脂醇(4)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香树脂醇苷(5)、β-胡萝卜苷(6)。结论化合物1为1个新化合物,化合物4和5为首次从该植物中分离得到。

关键词：离舌橐吾三萜离舌橐吾苷B α-香树脂醇 3-O-β-D-葡萄糖-α-香树脂醇苷

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泰山产天目琼花枝叶化学成分研究

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中草药 2017年第11期48卷 2177-2181页

作者：朱焰周俊飞张颖庞现红姚广民泰山医学院化学与制药工程学院山东泰安271016 华中科技大学同济医学院药学院湖北武汉430030 泰山医学院动脉粥样硬化研究所山东泰安271016

目的研究泰山产天目琼花Viburnum sargentii枝叶的化学成分。方法利用硅胶柱色谱、凝胶Sephadex LH-20柱色谱,中压反相硅胶柱色谱以及高效液相色谱等各种现代色谱方法进行分离纯化;通过ESI-MS、1D-NMR、2D-NMR等现代波谱技术,并与文献... 详细信息

目的研究泰山产天目琼花Viburnum sargentii枝叶的化学成分。方法利用硅胶柱色谱、凝胶Sephadex LH-20柱色谱,中压反相硅胶柱色谱以及高效液相色谱等各种现代色谱方法进行分离纯化;通过ESI-MS、1D-NMR、2D-NMR等现代波谱技术,并与文献数据对照鉴定化合物的结构。结果从天目琼花枝叶95%乙醇提取物中分离鉴定了13个化合物,包括7个三萜类化合物:α-香树脂醇(1)、熊果醇(2)、3α-乌苏酸(3)、11,12-去氢熊果酸内酯(4)、3-乙酰基齐墩果醛(5)、齐墩果酸(6)、白桦脂酸(7);5个木脂素类化合物:木兰脂素(8)、(+)-桉脂素(9)、(-)-表桉叶明(10)、vibsanol(11)、3,4′-dimethoxylvibsanol(12);1个苯丙素类化合物:α-细辛醚(13)。结论化合物12是1个新的天然产物,化合物1~11和13均为首次从天目琼花植物中分离得到。

关键词：天目琼花 α-香树脂醇熊果醇 3α-乌苏酸 11,12-去氢熊果酸内酯木兰脂素 α-细辛醚

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金沙绢毛菊的三萜成分

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中草药 2006年第3期37卷 349-350页

作者：吕建炜张承忠李冲陶保全兰州大学药学院天然药物化学实验室甘肃兰州730000

金沙绢毛菊Soroseris gillii（***）Stebb．为菊科绢毛苣属植物，主要分布在四川、青海等地。作为一种较常用藏药，其全草人药，具有清热解毒的功效，可解救食物中毒及其引起的发烧，还可治疗头疮和四肢黄水病等。本实验从金沙绢毛菊的... 详细信息

金沙绢毛菊Soroseris gillii（***）Stebb．为菊科绢毛苣属植物，主要分布在四川、青海等地。作为一种较常用藏药，其全草人药，具有清热解毒的功效，可解救食物中毒及其引起的发烧，还可治疗头疮和四肢黄水病等。本实验从金沙绢毛菊的乙醇提取液中分得6个三萜类化合物，经物理常数和光谱数据分析，它们分别为降香萜醇乙酸酯（Ⅰ）、α-香树脂醇（Ⅱ）、β-香树脂醇（Ⅲ）、羽扇豆醇（Ⅳ）、齐墩果酸（Ⅴ）和熊果酸（Ⅵ）。这些化合物为首次从绢毛菊属植物中分得。

关键词：三萜成分三萜类化合物降香萜醇乙酸酯光谱数据分析 α-香树脂醇 β-香树脂醇乙醇提取液清热解毒食物中毒物理常数

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