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郑麦366α-醇溶蛋白基因的克隆及生物信息学分析

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河南农业科学 2017年第1期46卷 13-18,25页

作者：李文旭常阳杨攀王美芳何盛莲吴政卿雷振生晁岳恩河南省农业科学院小麦研究所河南郑州450002

为研究优质强筋小麦品种郑麦366α-醇溶蛋白的组成,应用简并引物进行PCR扩增,从郑麦366中扩增得到13条核苷酸序列,其中9条序列推导的氨基酸序列具有完整的开放阅读框。进一步分析显示,克隆的9个基因(分别命名为ZM366-1—ZM366-9)编码的... 详细信息

为研究优质强筋小麦品种郑麦366α-醇溶蛋白的组成,应用简并引物进行PCR扩增,从郑麦366中扩增得到13条核苷酸序列,其中9条序列推导的氨基酸序列具有完整的开放阅读框。进一步分析显示,克隆的9个基因(分别命名为ZM366-1—ZM366-9)编码的蛋白质均具有α-醇溶蛋白的典型结构特征,根据T-细胞毒性抗原表位数目和多聚谷氨酰胺区特征分别将ZM366-1、ZM366-2定位到6A染色体,ZM366-3、ZM366-4定位到6D染色体,ZM366-5—ZM366-9定位到6B染色体。蛋白质二级结构预测显示,克隆的9个α-醇溶蛋白都仅含有α-螺旋结构,其中B基因组α-醇溶蛋白的α-螺旋含量明显高于其他基因组。同源系统进化树分析表明,克隆的9个α-醇溶蛋白具有明显的基因组特异性。

关键词：小麦 α-醇溶蛋白克隆生物信息学

一年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定

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作物学报 2014年第8期40卷 1340-1349页

作者：杨帆陈其皎高翔赵万春强琴琴吴丹孟敏西北农林科技大学农学院陕西杨凌712100 陕西省小麦新品种培育工程研究中心陕西杨凌712100

醇溶蛋白是面筋的主要成分之一,对小麦品质具有重要影响。根据数据库中全长α-醇溶蛋白基因设计了1对通用引物,从5份一年生簇毛麦（Dasypyrum villosum）品系中共得到52条序列,长度在816～873 bp之间（GenBank登录号为 KJ004676～KJ004... 详细信息

醇溶蛋白是面筋的主要成分之一,对小麦品质具有重要影响。根据数据库中全长α-醇溶蛋白基因设计了1对通用引物,从5份一年生簇毛麦（Dasypyrum villosum）品系中共得到52条序列,长度在816～873 bp之间（GenBank登录号为 KJ004676～KJ004727）。核酸序列分析表明,其中有8条假基因,有1条（KJ004680）缺失终止密码子。推导氨基酸序列显示, KJ004677、KJ004686、KJ004714和KJ004696含有1个额外的Cys,其中,前3条序列由于Tyr→Cys所致,而KJ004696则由于Ser→Cys突变。序列间的差异主要出现在N-端重复区和多聚谷氨酰胺I区,根据N端重复区多肽序列的差异将一年生簇毛麦α-醇溶蛋白分为5种类型。为了分析具有额外Cys的α-醇溶蛋白所具有的品质效应,选取KJ004708（具有典型的6个Cys）和KJ004714（具有1个额外的Cys）分别构建表达载体, IPTG诱导后均得到分子量约30 kD的蛋白,与理论值相符；目的条带经切胶串联质谱鉴定证明,这2个α-醇溶蛋白基因在大肠杆菌中正确表达。对表达的蛋白亚基进行纯化、复性和低温冷冻干燥,经4 g粉质仪分析表明, KJ004708和KJ004714均能改善面团的加工品质,其中具有1个额外Cys的KJ004714亚基对面粉品质的改善更为显著。

关键词：一年生簇毛麦 α-醇溶蛋白原核表达品质分析蛋白质串联质谱鉴定

Opaque2转录因子对玉米α-醇溶蛋白基因家族成员表达的影响

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江苏农业学报 2015年第6期31卷 1224-1231页

作者：李国锋葛敏吕远大江苏省农业科学院六合基地江苏南京210014 江苏省农业科学院农业生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室江苏南京210014

醇溶蛋白是玉米主要的储存蛋白,其中α-醇溶蛋白含量最为丰富,对玉米籽粒品质有重要影响。本研究利用全基因组数据鉴定α-醇溶蛋白基因家族,并从基因保守motif、玉米籽粒不同发育时期基因的表达谱以及转录因子Opaque2对该家族成员表达... 详细信息

醇溶蛋白是玉米主要的储存蛋白,其中α-醇溶蛋白含量最为丰富,对玉米籽粒品质有重要影响。本研究利用全基因组数据鉴定α-醇溶蛋白基因家族,并从基因保守motif、玉米籽粒不同发育时期基因的表达谱以及转录因子Opaque2对该家族成员表达的影响3个方面分析玉米α-醇溶蛋白基因家族。结果显示,玉米参考基因组中存在39个α-醇溶蛋白基因,其中z1A、z1B、z1C和z1D 4个亚族成员分别为12个、8个、14个和5个。基因保守motif分析发现该家族基因序列高度保守。表达谱分析结果显示该家族表达模式差异较大,其中z1A亚族在籽粒发育时期表达量最高。利用RNA-seq数据剖析在种子发育阶段Opaque 2(O2)野生型和突变体编码该家族成员的表达差异,结果显示O2突变体中z1C亚族成员表达显著下调,z1A亚族表达略有下调,z1B和z1D亚族成员表达量没有显著的变化。本研究在重新注释α-醇溶蛋白家族成员信息的基础上,对该家族的表达谱进行了分析,为今后玉米籽粒品质育种提供了必要遗传信息。

关键词：玉米 α-醇溶蛋白基因家族表达谱 Opaque 2

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小麦α-醇溶蛋白的克隆、表达和免疫性评估

小麦α-醇溶蛋白的克隆、表达和免疫性评估

作者：李章发福州大学

学位级别：硕士

小麦作为主要的粮食作物之一越来越受到关注,小麦种子贮藏蛋白主要包括麦谷蛋白以及麦醇溶蛋白,是小麦面筋蛋白的主要组成部分,它们的含量和比例决定着小麦面筋蛋白的质量。麦醇溶蛋白对面团的延展性有重要影响,可分为四种类型,即α,β... 详细信息

小麦作为主要的粮食作物之一越来越受到关注,小麦种子贮藏蛋白主要包括麦谷蛋白以及麦醇溶蛋白,是小麦面筋蛋白的主要组成部分,它们的含量和比例决定着小麦面筋蛋白的质量。麦醇溶蛋白对面团的延展性有重要影响,可分为四种类型,即α,β,γ和ω-醇溶蛋白,其中α-醇溶蛋白约占到总麦醇溶蛋白的25%,是引起乳糜泻的主要蛋白质。本研究以pUC57-α-gliadin重组质粒为对象进行同源性分析,设计不扩增信号肽的表达引物扩增目的基因片段,经过限制性双酶切、凝胶回收纯化后,α-gliadin目的片段与表达载体进行酶连接反应构建重组表达质粒,利用E.coli体外诱导表达α-醇溶蛋白,70%乙醇溶液提纯α-醇溶蛋白,利用柠檬酸对α-醇溶蛋白进行脱酰胺改性,表征改性后α-醇溶蛋白的结构变化及其对面条质地的影响。采用生物信息学方法对α-醇溶蛋白基因进行抗原表位预测,结果如下:1.经原位PCR、双酶切鉴定以及测序鉴定,结果表明成功构建了表达载体pET-22b-α-gliadin。2.将表达载体pET-22b-α-gliadin成功转化到受体菌E.coli BL21（DE3）中,利用1 mMIPTG,37 ℃诱导18h表达α-醇溶蛋白,70%乙醇溶液提纯,SDS-PAGE结果表明α-醇溶蛋白成功表达。对α-醇溶蛋白进行柠檬酸脱酰胺改性后发现α-醇溶蛋白的α-螺旋结构减少,β-折叠结构增加,α-螺旋/β-折叠比值降低,说明柠檬酸脱酰胺改性后,α-醇溶蛋白的分子柔韧性增加。α-醇溶蛋的内源性荧光扫描显示λmax发生红移,说明α-醇溶蛋白的内部结构发生了一定的伸展使内部的色氨酸暴露出来。SEM进行扫描发现α-醇溶蛋白表面呈现光滑均匀的块状,将其加入面条中进行TPA实验,发现脱酰胺改性的α-醇溶蛋白使面条硬度降低,粘着性提高。3.利用生物信息学方法对α-醇溶蛋白二级结构和B细胞线性表位进行预测,结果显示α-醇溶蛋白B细胞线性表位优势区域是28～41、52～75、85～132、160～170、184～188、202～256区域,系统进化树分析表明本实验所用α-醇溶蛋白与乌拉尔图小麦的亲缘关系比较接近。

关键词： α-醇溶蛋白体外表达脱酰胺改性面条质地表位预测

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郑丰5号α-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

华北农学报 2013年第4期28卷 46-52页

作者：李玉阁邢冉冉崔一飞李锁平河南大学生命科学学院河南开封475004

α-醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白的重要组分,其组成与含量对小麦加工品质具有重要影响。利用PCR从郑丰5号基因组中克隆α-醇溶蛋白基因,并对其序列进行分析。经克隆共获得32个α-醇溶蛋白新基因(ZF5A-1～ZF5A-32,GenBank注册序列号为JX82... 详细信息

α-醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白的重要组分,其组成与含量对小麦加工品质具有重要影响。利用PCR从郑丰5号基因组中克隆α-醇溶蛋白基因,并对其序列进行分析。经克隆共获得32个α-醇溶蛋白新基因(ZF5A-1～ZF5A-32,GenBank注册序列号为JX828280～JX828311),其中15个为假基因,17个(ZF5A-1～ZF5A-17)具有完整开放阅读框。17个α-醇溶蛋白新基因中,除ZF5A-1、ZF5A-3、ZF5A-6、ZF5A-9、ZF5A-10、ZF5A-11、ZF5A-15编码的蛋白在特征Ⅱ区含有1个额外的半胱氨酸(C)外,其他10个基因编码的蛋白均具有α-醇溶蛋白的典型结构。根据推断氨基酸序列中4种主要T细胞优势多肽的分布及多聚谷氨酰胺区的长度,推测ZF5A-7和ZF5A-12可能定位于6A染色体,ZF5A-4、ZF5A-13、ZF5A-14和ZF5A-17可能定位于6B染色体,而ZF5A-1～ZF5A-3、ZF5A-5、ZF5A-6、ZF5A-8～ZF5A-11、ZF5A-15和ZF5A-16可能定位于6D染色体。17个新克隆α-醇溶蛋白基因及4个已知α-醇溶蛋白基因编码的蛋白的二级结构预测结果表明:α-螺旋、β-折叠的位置和核心序列是相对保守的,但不同蛋白α-螺旋和β-折叠的数量以及参与形成同一保守区域α-螺旋和β-折叠的氨基酸残基数却并不相同。克隆的17个α-醇溶蛋白基因中,除ZF5A-17编码的蛋白缺少α-螺旋(H2)、ZF5A-2、ZF5A-8编码的蛋白在特征区Ⅰ均存在1个额外的α-螺旋(HE1)、GQ891685和ZF5A-15编码的蛋白在多聚谷氨酰胺Ⅱ区存在1个额外的α-螺旋(HE2)外,5个保守的α-螺旋(H1～H5)恒定出现在其他基因的2个谷氨酰胺重复区和特征区中;此外,在C-末端特征区大部分基因(61.11%)还形成1个β-折叠结构(E)。郑丰5号中具有较多额外半胱氨酸、α-螺旋和β-折叠的α-醇溶蛋白基因,可能与其良好的加工品质密切相关。

关键词： α-醇溶蛋白郑丰5号克隆序列分析

野生二粒小麦与普通小麦杂种高世代α-,γ-醇溶蛋白基因的分子鉴定

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野生二粒小麦与普通小麦杂种高世代α-,γ-醇溶蛋白基因的分子鉴定

作者：陈厚霖四川农业大学

学位级别：硕士

麦谷蛋白和麦醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白中的主要成分,二者是小麦面筋组成的两大成分,二者的种类和数量及其比例决定着小麦面粉的加工品质,从而影响着面筋的质量。在小麦籽粒中,麦醇溶蛋白占贮藏蛋白的40%-50%,赋予了面筋可塑性、黏性... 详细信息

麦谷蛋白和麦醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白中的主要成分,二者是小麦面筋组成的两大成分,二者的种类和数量及其比例决定着小麦面粉的加工品质,从而影响着面筋的质量。在小麦籽粒中,麦醇溶蛋白占贮藏蛋白的40%-50%,赋予了面筋可塑性、黏性、延展性,同时醇溶蛋白中还含有诱发乳糜泻（celiac disease,CD）的主要外在因子。因此,筛选优质的醇溶蛋白基因改良普通小麦的加工品质以及降低乳糜泻的发病率,对小麦遗传育种具有重要意义。野生二粒小麦是栽培四倍体硬粒小麦和六倍体普通小麦的祖先种,具有很多优良的性状以及普通小麦所缺乏的独特的遗传变异,是进行普通小麦遗传改良的适宜供体。本研究通过对野生二粒小麦D97、普通小麦川农16（CN16）及其二者杂种高世代（＞F11,2n=6x=42）的四份材料BAd7-209、BAd7-210、BAd7-212、BAd7-213,进行α-,γ-醇溶蛋白基因的分子克隆,利用GenBank中已有的基因序列资源,同克隆测序后的基因序列进行比对分析、氨基酸序列分析并构建系统进化树,揭示野生二粒小麦改良普通小麦醇溶蛋白的优异遗传基础,进而为野生二粒小麦在普通小麦品质改良和CD预防中的利用,提供参考。主要取得以下结果：（1）一共克隆了248个α-醇溶蛋白基因序列,85个Y-醇溶蛋白基因序列,其中α-,γ-醇溶蛋白基因具有完整编码框的基因序列分别为129个、68个,其余的由于在编码区存在着提前终止子,推测为假基因。（2）进一步分析表明,得到的所有基因序列推导的氨基酸序列都具有a-醇溶蛋白或γ-醇溶蛋白典型的结构。在α-醇溶蛋白基因序列中,亲本川农16和4个杂种高代材料都得到了含有7个半胱氨酸的序列,都是在C-末端特征区Ⅱ,因密码子TCC颠换为TGC使丝氨酸（S）突变为半胱氨酸（C）。同时,在BAd 7-210、BAd 7-212、BAd 7-213中克隆到了缺少1个保守半胱氨酸的序列。其中,7-212-α1-13中第1个半胱氨酸（C）因TGC转换为TAC而突变成了酪氨酸（Y）;7-210-α1-2、7-212-α1-19和7-213-α1-1均因密码子TGT转换为CGT使第3个半胱氨酸（C）突变成了精氨酸（R）;7-210-α2-13和7-213-α2-7中,由于TGC转换为CGC,而使第4个半胱氨酸（C）突变成了精氨酸（R）;此外,7-212-a1-12中由于TGC转换为CGC,使第5个半胱氨酸（C）突变成了精氨酸（R）。在γ-醇溶蛋白基因序列中,除BAd7-213外,得到了含有7个或9个半胱氨酸的序列。例如,D97-γ-3与CN16-γ-4由于密码子TAT转换为TGT,使位于C-末端区非重复区V的酩氨酸（Y）突变为半胱氨酸（C）;在D97-γ-1、D97-γ-4、D97-,γ-5、D97-γ-6、D97-γ-7、D97-γ-12、D97-γ-14、CN16-γ-9、CN16-γ-10、CN16-γ-11、7-209-γ-2、7-209-γ-3、7-210-γ-9、7-212-γ-5、7-212-γ-7等在N-末端重复区Ⅱ,由于密码子TAC转换为TGC,致使酪氨酸（Y）突变成为半胱氨酸（C）。而7-209-γ-13在非重复区Ⅲ,由于密码子TGT颠换为GGT,而使半胱氨酸（C）突变为甘氨酸（G）,导致基因缺少了1个保守的半胱氨酸;类似地,7-212-γ-2与7-212-γ-8在非重复区Ⅲ,由于密码子TGT转换为CGT,致使半胱氨酸（C）突变为精氨酸（R）。系统进化分析表明,在C-末端特征区Ⅱ具有额外半胱氨酸的α-醇溶蛋白基因,大多数来源于D基因组。而在N-末端重复区Ⅱ具有额外半胱氨酸的γ-醇溶蛋白基因,大多来源于B基因组。在野生二粒小麦D97得到了较普通小麦川农16更多的额外半胱氨酸的醇溶蛋白基因,据此认为,有望通过野生二粒小麦改良普通小麦的加工品质。（3）从克隆到的基因序列中对T细胞免疫肽进行了识别分析,表明野生二粒小麦D97和川农16以及四个杂种高代材料都具有足够的潜力诱发CD。但是进一步分析发现,在D97所克隆得到的序列中,D97-α2-14和D97-α1-22被定位在6B染色体上,它们的多聚谷氨酰胺含量比较特殊,其多聚谷氨酰胺Ⅱ区的多聚谷氨酰胺含量反而比多聚谷氨酰胺Ⅰ区的含量少很多或者数量接近。D97-α2-6、D97-α2-13、D97-Ⅱ2-16这三个基因仅含有Glia-a20,并被定位在6A染色体。而在杂种后代BAd7-209中,发现了类似的基因7-209-α1-19。表明在D97中存在一定的变异类型,有望从中筛选出含有较少T细胞免疫优势多肽的优异种质资源。

关键词：普通小麦野生二粒小麦 α-醇溶蛋白 γ-醇溶蛋白序列分析

栽培一粒小麦α-醇溶蛋白新基因的克隆与序列分析

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麦类作物学报 2012年第3期32卷 387-392页

作者：李玉阁邢冉冉李锁平河南大学生命科学学院河南开封475004

α-醇溶蛋白是人们生活中消费最多的蛋白,由于含有引起乳糜泻(CD)的主要毒性肽成分,也是引起CD的最活跃的蛋白。为了解一粒小麦在小麦品质育种中的潜力,利用1对α-醇溶蛋白的特异引物,采用基因组PCR法从栽培一粒小麦中克隆α-醇溶蛋白... 详细信息

α-醇溶蛋白是人们生活中消费最多的蛋白,由于含有引起乳糜泻(CD)的主要毒性肽成分,也是引起CD的最活跃的蛋白。为了解一粒小麦在小麦品质育种中的潜力,利用1对α-醇溶蛋白的特异引物,采用基因组PCR法从栽培一粒小麦中克隆α-醇溶蛋白新基因,共获得片段大小为856～882bp的4个基因序列,分别命名为AA-6、AA-8、AA-9和AA-21(GenBank登录号为JN831382～JN831385)。其中,AA-8、AA-9和AA-21均在102位因C→T替换而导致TAG终止子出现成为假基因;AA-6由882个核苷酸构成,可编码293个氨基酸,与已知基因的最高同源性为99%,推断氨基酸序列具有α-醇溶蛋白的典型结构,是α-醇溶蛋白家族的新成员。AA-6的CD毒性肽分析表明,除不含A基因组所没有的glia-α和glia-α2毒性肽外,其他已知的7种毒性肽均有分布。AA-6和86个来源于小麦及其祖先供体种的α-醇溶蛋白的同源性分析表明,α-醇溶蛋白基因存在基因组来源的差异性,其中,A、D基因组来源的α-醇溶蛋白基因的相似性较高。

关键词：栽培一粒小麦 α-醇溶蛋白基因克隆乳糜泻系统进化

小麦三个贮藏蛋白基因的克隆、原核表达及品质效应鉴定

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小麦三个贮藏蛋白基因的克隆、原核表达及品质效应鉴定

作者：李万西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦贮藏蛋白分两种:麦谷蛋白(Glutenin)和醇溶蛋白(Gliadin),麦谷蛋白也分两种:高分子量谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(low molecular weight glutenin subunit,LMW-GS)。小麦贮藏蛋白是小麦面粉加工品质的决定性因素,其含量超过小麦籽粒蛋白总量的80%。本研究以课题组自主选育的优质小麦新品种“西农538”和“西农558”的基因组DNA为模板,根据GenBank中收录的HMW-GS、LMW-GS和α-gliadin的基因序列,设计特异性引物,通过PCR扩增、克隆测序等实验技术,分别从这两个小麦品种中得到了三种蛋白的基因编码序列各一条,并进一步进行了序列比对及进化树分析,同时以“西农538”中获得的三条基因序列为目标序列,诱导其在大肠杆菌表达系统中表达,然后通过蛋白纯化和微量掺粉实验研究比较这三个表达蛋白各自对小麦面粉的品质效应。实验结果如下:1.利用设计的特异性引物,共得到了6条具有单一完整开放阅读框的基因序列。其中从“西农538”中克隆得到的HMW-GS、LMW-GS和α-gliadin基因序列的GenBank登录号分别为KX452083、KX452081、KX452085,编码区长度分别为1812 bp、915 bp和897 bp;从“西农558”中克隆得到的这三种蛋白的基因序列的登录号分别为KX452084、KX452082、KX452086,编码区长度分别为1977 bp、915 bp和879 bp。2.通过氨基酸序列对比发现:KX452083和KX452084主要由信号肽、N-端保守区、中间重复区和C-末端四个部分构成,都有7个半胱氨酸(Cys)残基,中间重复区有六肽和九肽重复单元,但没有三肽重复单元,由此推测这两个基因序列可能属于y型亚基,同时经过blastp比对和进化树分析得知,两条序列分别与1Dy10和1Dy12亚基有极高的相似度。KX452081和KX452082主要由信号肽、N-端保守区、中间重复区(该区域是谷氨酰胺(Q)和脯氨酸(P)的富集区)、C-端保守区Ⅰ(含有5个Cys残基)、C-端保守区Ⅱ(该区域含有丰富的谷氨酰胺(Q)和1个Cys残基)和C-端保守区Ⅲ(含有1个Cys残基)这六部分组成,通过序列比对、N/C端氨基酸组成(METRCIPG······VGTGVGAY)、Cys残基的位置和进化树分析发现,得到的这两条LMW-GS序列属于Glu-D3位点、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS。KX452085和KX452086主要由6部分组成:信号肽、N-端重复区、多聚谷氨酰胺区Ⅰ、特征区Ⅰ、多聚谷氨酰胺区Ⅱ和特征区Ⅱ,其中KX452085含有6个Cys残基,可形成3对分子内二硫键;KX452086含有7个Cys残基,不仅可以形成3对分子内二硫键,多余的一个Cys残基可能形成一个分子间二硫键。3.依据本实验的研究目的和前人的研究成果,以“西农538”中克隆得到的三条序列(KX452083、KX452081和KX452085)为研究对象,经IPTG诱导,使它们在宿主菌Escherichia coli Trans B(DE3)中进行体外表达,通过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot检测鉴定,结果表明这三个蛋白均成功表达。4.对三个蛋白进行大量的体外表达,经回收纯化、低温冷冻干燥和微量掺粉实验(以中国春面粉为基础面粉),得到了一系列相关参数。分析这些参数发现,KX452083(HMW-GS)与面粉筋力正相关,但对面团弹性产生了负效应,并且不利于面团的延伸;KX452081(LMW-GS)对面粉筋力的影响比较复杂,尚难确定相关性,但其对面粉弹性有增强作用,而对面团的延伸不利;KX452085(α-gliadin)对面粉筋力有负效应,但使面团更易流变,且对面团的延伸和弹性有显著的改善。此外,粉质质量指数(Farinograph quality number,FQN)是一种被用来评价面粉质量的常用指标,以FQN为衡量标准分析比较这三个蛋白的品质效应,结果为:HMW-GS>α-gliadin>LMW-GS。

关键词：普通小麦高分子量谷蛋白低分子量谷蛋白 α-醇溶蛋白面粉品质

西尔斯山羊草(Aegilops searsii)α-醇溶蛋白编码基因的克隆及原核表达

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山东农业大学学报（自然科学版） 2015年第3期46卷 321-325页

作者：刘国娟马信尹华燕孙鑫杜旭烨王宏伟李安飞陈呈涛孔令让山东农业大学农学院/作物生物学国家重点实验室山东泰安271018 山东省新泰市天宝镇农业技术推广站山东新泰271200

醇溶蛋白是小麦加工品质的重要影响因素,主要决定面团的粘性和延展性。根据酸性条件下迁移率的不同,可将醇溶蛋白分为α-,β-,γ-,ω-醇溶蛋白。α-醇溶蛋白占贮藏蛋白的15%～30%,是含量最丰富的一类贮藏蛋白,同时,α-醇溶蛋白中含有一... 详细信息

醇溶蛋白是小麦加工品质的重要影响因素,主要决定面团的粘性和延展性。根据酸性条件下迁移率的不同,可将醇溶蛋白分为α-,β-,γ-,ω-醇溶蛋白。α-醇溶蛋白占贮藏蛋白的15%～30%,是含量最丰富的一类贮藏蛋白,同时,α-醇溶蛋白中含有一些致敏性的毒性多肽。克隆西尔斯山羊草α-醇溶蛋白基因,并进行序列分析,通过构建原核表达载体,使其在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,并通过切胶纯化法,获得纯度较高的目的蛋白。根据α-醇溶蛋白基因编码区保守序列设计引物,通过PCR扩增克隆得到α-醇溶蛋白基因并进行序列分析。将目的基因KC421089连到表达载体p EASY-E1上,在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,获得表达的融合蛋白。通过切胶纯化法,获得纯度较高的目的蛋白。从小麦近缘植物西尔斯山羊草（Aegilops searsii）中首次克隆了7个α-醇溶蛋白编码基因,它们的编码区长度分布在849～954 bp之间,可编码282～317个氨基酸。通过与已发表的其它物种的α-醇溶蛋白氨基酸序列进行多重比对分析,发现这些基因都具有α-醇溶蛋白编码基因典型的结构特点,同时还存在着碱基的缺失、插入以及SNPs。在克隆目的基因的基础上,本研究还通过大肠杆菌体外表达和切胶纯化方法,获得了纯度较高的目的蛋白,实现了该基因的表达。克隆了7个α-醇溶蛋白基因序列,登录号为KC421089的基因可在原核系统中成功表达,并通过切胶纯化法获得目的蛋白,为进一步利用西尔斯山羊草改良小麦加工品质奠定了基础。

关键词： α-醇溶蛋白西尔斯山羊草序列分析原核表达