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军事医学 2013年第4期37卷 274-278页

作者：徐艳余硕姬泓巍董铭心王孝花吴巧玲戴秋云中国海洋大学化学化工学院山东青岛266100 军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的研究α-芋螺多肽Eb1.6的制备工艺,为其临床前实验奠定基础。方法采用Fmoc保护氨基酸,以Rink树脂为固相载体,N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)为缩合剂,手工固相法规模合成目标肽。线性肽折叠采用空气氧化法,将线... 详细信息

目的研究α-芋螺多肽Eb1.6的制备工艺,为其临床前实验奠定基础。方法采用Fmoc保护氨基酸,以Rink树脂为固相载体,N,N-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)为缩合剂,手工固相法规模合成目标肽。线性肽折叠采用空气氧化法,将线性肽按0.2 mg/ml的浓度溶于0.1 mol/L NH4HCO3缓冲液中,室温下搅拌16～24 h。折叠结束后,加入Amberlite XAD16大孔吸附树脂富集,树脂用乙醇浸洗,旋转蒸发浓缩得折叠后粗品,然后进行反相纯化。结果 Eb1.6线性肽的粗产率为94.6%,Eb1.6折叠肽粗品的回收率为82.3%,粗品经C18反相纯化后纯度高于98.5%。结论以DIC/HOBt为缩合剂合成Eb1.6的纯度及产率均较高,Eb1.6折叠后用吸附树脂富集,乙醇浸泡再释放多肽,可实现缓冲体系及树脂的反复循环,降低了成本。

关键词： α-芋螺多肽 Eb1 6 固相合成折叠纯化

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几种新型α-芋螺多肽的作用靶点及构效关系研究

几种新型α-芋螺多肽的作用靶点及构效关系研究

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作者：丁融南华大学

学位级别：硕士

目的以及意义：本研究旨在测定本实验室前期获得的新型α-芋螺多肽对神经元nAChR的作用靶点，并对α-芋螺多肽Vc1.1突变体的构效关系进行研究，为新型α-芋螺多肽进一步的药理学功能研究及应用开发奠定基础。方法：应用Fmoc-固相法在ABI... 详细信息

目的以及意义：本研究旨在测定本实验室前期获得的新型α-芋螺多肽对神经元nAChR的作用靶点，并对α-芋螺多肽Vc1.1突变体的构效关系进行研究，为新型α-芋螺多肽进一步的药理学功能研究及应用开发奠定基础。方法：应用Fmoc-固相法在ABI433A合成仪上合成线性多肽，通过氧化折叠、富集（或吸附）、纯化等步骤获得实验所需的α-芋螺多肽。通过提质粒、酶切线性化、纯化、去RNA酶以及体外转录等一系列生物学实验获得实验所需的cRNA。应用双电极电压钳技术，测定α-芋螺多肽对表达在爪蟾卵母细胞上的神经元nAChR各亚型的结合活性。结果：1、合成了5种用于实验的α-芋螺多肽纯品，分别为Mr1.8、Di1.1、Vc1.1[N9R,D11R]、Benzoyl-Vc1.1[N9R]、Vc1.1[D11A]，并测定了新克隆的Di1.1的二硫键连接方式为以“C1-C4，C2-C3”为主。2、获得了电压钳实验所需的神经元型nAChRs亚基(α2、α3、α4、α6α3、α7、α9、α10、β2、β3、β4)质粒、去RNA酶的线性化片段以及cRNA。3、筛选了12种新型α-芋螺多肽，发现了对神经元nAChR的α3β2亚型有特异靶向作用的Vi1.6，IC50为913.9nM(700.8～1192nM)，其对α3β4、α4β2、α7和α9α10等亚型活性都很弱，浓度为10μM时，抑制率分别为（21.92±2.04）%、（10.19±2.47）%、（13.68±4.33）%、（24.22±4.66）%。4、发现α-芋螺多肽Mr1.8对nAChR α3β2亚型有选择性抑制作用，IC50为447.3nM(401.6～498.2nM)，其对α9α10也有部分抑制作用， IC50为3524nM(2383～5209nM)。但Mr1.8对α3β4、α4β2以及α7等亚型活性都很弱，浓度为10μM时，抑制率分别为（33.59±3.70）%、（9.56±3.66）%和（9.46±4.58）%。5、研究了Vc1.1一系列突变体（Vc1.1[N9R]、 Vc1.1[Y10V]、Vc1.1[N9R,D11N]、Benzoyl-Vc1.1[N9R]、AC-Vc1.1[N9R]、Vc1.1[N9D]）对nAChRα9α10亚型的抑制作用，结果表明Benzoyl-Vc1.1[N9R]和Vc1.1[N9D]对α9α10的抑制效果比较好，IC50分别为875.6nM(511～1500nM)和1108nM (938.7～1308nM)，但比Vc1.1（IC50=28.29nM(20.79～38.48nM)）弱。6、α-芋螺多肽Di1.1对神经元nAChR α3β4、α4β2、α7、α3β2和α9α10等亚型结合活性都很弱，浓度为10μM时，抑制率都在30%以下。结论：1、α-芋螺多肽Mr1.8，对nAChR α3β2亚型有选择性抑制作用，IC50为447.3nM(401.6～498.2nM)，其对α9α10也有部分抑制作用（数μ摩尔浓度级），但对α3β4、α4β2以及α7等亚型活性都很弱。2、Vi1.6对α3β2亚型有较好的抑制作用，IC50为913.9nM(700.8～1192nM)，其对α3β4、α4β2、α7和α9α10等亚型活性都很弱。3、Vc1.1突变体的活性顺序为：Benzoyl-Vc1.1[N9R]>Vc1.1[N9D]>AC-Vc1.1[N9R]>Vc1.1[N9R]>Vc1.1[Y10V]>Vc1.1[N9R,D11N]， Asn9在其与α9α10的结合中起关键作用，苯酰基和乙酰基能增强其活性。

关键词： α-芋螺多肽神经元 nAChR 亚型合成靶点

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α-芋螺多肽Eb1.6药理活性研究及几种芋螺多肽合成

α-芋螺多肽Eb1.6药理活性研究及几种芋螺多肽合成

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作者：代琴南华大学

学位级别：硕士

目的：采用多种动物模型深入研究Eb1.6的镇痛活性及副作用。为研究Eb1.6及Vt1.27的结构性能关系，合成该二肽数个突变体。方法：（1）用大鼠坐骨神经半结扎（PNL）、坐骨神经结扎（CCI）及糖尿病神经源性疼痛（DNP）等慢性疼痛模型，测... 详细信息

目的：采用多种动物模型深入研究Eb1.6的镇痛活性及副作用。为研究Eb1.6及Vt1.27的结构性能关系，合成该二肽数个突变体。方法：（1）用大鼠坐骨神经半结扎（PNL）、坐骨神经结扎（CCI）及糖尿病神经源性疼痛（DNP）等慢性疼痛模型，测定Eb1.6的慢性镇痛活性;（2）用小鼠醋酸扭体、烫尾及热板等急性疼痛模型，测定Eb1.6的急性镇痛活性;（3）用小鼠急性毒性试验、运动功能障碍试验及纳洛酮戒断的成瘾性试验，检测Eb1.6的毒副作用;（4）用固相合成及空气氧化折叠法，合成了4个Eb1.6及7个Vt1.27突变体多肽。结果：（1）Eb1.6在大鼠PNL、CCI及DNP慢性疼痛模型中显示很强的镇痛活性。在PNL模型中肌肉注射24.9μg/kg Eb1.6，4h后镇痛效果最为显著，大鼠的痛阈提高率（55.6±36.7）%显著高于目前疗效较好的慢性镇痛药（吗啡5mg/Kg+加巴喷丁100mg/Kg）（28.6±18.1）%，静脉注射也得到类似的效果。CCI模型效果与PNL模型类似，2h后镇痛效果最为显著，Eb1.6镇痛作用比吗啡+加巴喷丁联合用药持久。DNP模型给予Eb1.64h后镇痛效果最强（肌肉或静脉），显著高于2h吗啡+加巴喷丁联合用药效果（2h后镇痛效果最显著），且作用持久。（2）Eb1.6在急性疼痛中显示出较强的镇痛活性。小鼠醋酸扭体法中，Eb1.6在166.3μg/kg剂量下能明显减少小鼠的扭体次数。烫尾法及热板法中，Eb1.6的镇痛活性高于同等剂量（41.8μg/kg）的阳性对照Vc1.1。（3）Eb1.6毒副作用低。急性毒性实验中，在高于有效剂量500倍下，小鼠无明显不良反应。给予166.3μg/kg（高于有效剂量数10倍）Eb1.6不影响小鼠的运动功能。连续给药8天（共14次，第一天和第八天各一次，第二天至第七天每天两次），分别给予三个剂量24.90μg/kg、249μg/kg、2490μg/kg（高于有效剂量100倍）后，小鼠均无吗啡样成瘾性作用。（4）合成了Eb1.6突变体Eb1.6[K11A]、Eb1.6[L10A]、Eb1.6[M9A]、Eb1.6[M9R]及Vt1.27突变体Vt1.27[H6A]、Vt1.27[P9A]、Vt1.27[D11A]、Vt1.27[Y12A]、Vt1.27[R14A]、Vt1.27[F15A]、Vt1.27[H6P、P9A]。结论：（1）α-芋螺多肽Eb1.6肌肉注射或静脉注射均有效，对慢性疼痛具很强的镇痛活性，且镇痛作用持久。（2）Eb1.6对急性疼痛镇痛作用不如慢性疼痛好，但也对其具有较强的镇痛活性。（3）Eb1.6具很低的毒副作用，在高于活性剂量10-500倍的剂量下未引起显著毒性、运动功能障碍及吗啡样成瘾性等副作用。（4）合成了4个Eb1.6及7个Vt1.27理化性质各异的突变体。

关键词： α-芋螺多肽神经元烟碱型乙酰胆碱受体镇痛活性多肽合成

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新型-N型钙离子通道抑制剂的发现、优化及作用机制研究

新型-N型钙离子通道抑制剂的发现、优化及作用机制研究

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作者：余硕中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

芋螺属软体动物(芋螺,Conus),广泛分布于热带海域,全世界约有750种。在我国南海及台湾海峡,已发现70余种。根据食性,可将芋螺分为食鱼类(Piscivorous)、食虫类(Vermivorous)及食软体动物类(Molluscivorous)。芋螺毒素(Conotoxins,或芋... 详细信息

芋螺属软体动物(芋螺,Conus),广泛分布于热带海域,全世界约有750种。在我国南海及台湾海峡,已发现70余种。根据食性,可将芋螺分为食鱼类(Piscivorous)、食虫类(Vermivorous)及食软体动物类(Molluscivorous)。芋螺毒素(Conotoxins,或芋螺多肽(Conopeptides))由芋螺毒腺及毒腺管分泌,组成复杂,每种芋螺的毒液可存在超过100种不同的芋螺多肽。目前已发现芋螺多肽对多种重要的分子靶标具有高结合活性及选择性,包括钠、钾、钙等离子通道,烟碱型乙酰胆碱受体,谷氨酸能受体等多种神经递质受体,G蛋白偶联受体等。由于上述特性,芋螺多肽可以作为神经生物学的研究工具,也可直接发展成药物。钙离子通道广泛存在于哺乳动物的可兴奋细胞中,调节Ca2+电流,参与许多重要的生理过程,如肌肉的兴奋-收缩偶联过程、激素的分泌与调控、神经递质的释放、伤害性疼痛传导等。N-型电压门控钙离子通道(Neural Voltage-gated Calcium Channel,N-VGCC,CaV2.2)属于高压激活钙离子通道,主要分布在中枢和外周神经系统的突触前神经末梢,在神经递质(如:谷氨酸、P物质、CGRP等)的释放过程中起关键作用,是治疗病理性慢性疼痛、炎症疼痛的重要靶点。目前已发现一系列ω-芋螺多肽可抑制CaV2.2活性。ω-MVIIA(Ziconotide)已于2004年由美国FDA批准上市,适用于顽固性非癌症疼、癌症疼及艾滋病相关疼,该药治疗窗狭窄,仅能鞘内给药,且存在较严重的副作用。之后发现的ω-CVID(Leconotide)比ω-MVIIA的副作用小,静脉给药ω-CVID可缓解痛觉增敏,但未见后续临床试验报导。ω-CVIE和ω-CVIF是最近发现的CaV2.2抑制剂,能可逆地抑制初级传入神经到脊髓背角浅层神经元的兴奋性突触传递。本实验室发现的ω-芋螺多肽SO-3对CaV2.2有很强的抑制活性和选择性,镇痛作用与ω-MVIIA相当,但毒副作用较低,目前已完成临床前试验。?-芋螺多肽是目前已知的最小的一类芋螺多肽,通常仅含有12-19个氨基酸残基,其中包括两对二硫键,二硫键的连接方式通常是Cys1-Cys3,Cys2-Cys4。大部分?-芋螺多肽作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR),最近发现一类?-芋螺多肽,如AuIB、RgIA、Vc1.1、Pe IA,也具有CaV2.2抑制活性。此类芋螺多肽可在胞外与γ-氨基丁酸B型受体(GABABR)结合,使GABABR的胞内部分释放G蛋白G?γ亚基。G?γ亚基可与CaV2.2的α1亚基相互作用,减弱CaV2.2的激活电流及去活化电流。此类芋螺多肽中,Vc1.1在动物模型中表现出良好的镇痛作用,但在临床II期试验中发现对人的亲和力较差,由于药效不佳而中止临床试验。环化的Vc1.1可以口服给药,且仍有镇痛效果。该类多肽因序列短、易合成、毒性低、给药方式简便,具有很高的药用前景。本课题组前期除发现特异作用于cav2.2的ω-芋螺多肽so-3外,还开展了?-芋螺多肽的发现、合成、靶点鉴定及药物发展研究。应用基因克隆方法,获得了一系列新?-芋螺多肽序列。在中国南海芋螺黑星芋螺(conusebraeus)、小牛芋螺(conusvitulinus)中发现的eb1.6及vt1.27,分别含16及17个氨基酸,均含两对二硫键。前期澳大利亚合作实验室的靶点研究表明,该两种芋螺多肽对cav2.2的ica均有一定抑制效果,这是首次发现?-芋螺多肽可直接作用于cav2.2。本论文在前期初步工作基础上,开展该两个芋螺多肽cav2.2的结构-活性关系研究,并将ω-芋螺多肽so-3、mviia的关键作用区域引入eb1.6及vt1.27,设计合成嵌合肽,以探索获得新的cav2.2抑制剂,为研发序列短、活性高、毒性低的新型cav2.2抑制剂奠定基础。本论文的主要研究结果如下:(1)成功建立了全细胞膜片钳测定cav2.2的技术平台。扩增了cav2.2及其辅助亚基的质粒,成功的在hek293细胞中功能表达cav2.2通道,完成了全细胞膜片钳设备的调试及cav2.2通道抑制活性测定方法的建立。(2)芋螺多肽eb1.6及突变体对cav2.2抑制活性较低。10μm浓度的eb1.6对cav2.2的抑制活性为28.96±8.84%。参照vt1.27对pro13、asn14进行改造后,10μm浓度的突变体抑制活性下降。pro13被asn或gln取代后,eb1.6[p13n]及eb.16[p13q]的抑制活性分别为10.87±2.37%及13.32±3.16%。asn14突变为带负电荷的asp或glu,eb1.6[n14d]及eb1.6[n14e]的抑制活性分别为3.37±2.61%及5.80±1.89%。asn14被疏水性氨基酸phe或leu替代后活性亦下降,eb1.6[n14f]及eb1.6[n14l]

关键词： α-芋螺多肽 N-型电压门控钙离子通道抑制剂结构活性关系嵌合肽

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