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结核分枝杆菌Rv3084编码酯酶LipR的生物学特性和体内免疫调节功能

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四川大学学报（医学版） 2019年第3期50卷 291-297页

作者：张春曦罗涛马鹏娇王楚涵索靖翟小倩彭璇鲍朗四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室成都610041

目的探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Rv3084编码的酯酶LipR的生物学特性及其在体内的免疫调节功能。方法从MTB H37Rv标准毒力株扩增LipR基因,构建重组表达质粒;测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌,诱导LipR蛋白表达并... 详细信息

目的探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Rv3084编码的酯酶LipR的生物学特性及其在体内的免疫调节功能。方法从MTB H37Rv标准毒力株扩增LipR基因,构建重组表达质粒;测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌,诱导LipR蛋白表达并纯化,Western blot鉴定;进行LipR酯酶活性检测,分析影响LipR酶活性的因素;将重组质粒于小鼠胫前肌肉注射0.1 mL(含质粒DNA 100μg)3次(第1,8,15天),末次注射后7 d,处死小鼠,取肺、脾脏进行细胞因子检测。结果成功构建重组表达质粒,并发现LipR蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,蛋白相对分子质量约为33×10~3;在标准水解活性实验条件(40℃,pH7.5)下,其最适水解底物为4-硝基苯基乙酸酯(pNPA,C2);以4-硝基苯基丁酸酯(pNPB,C4)作为底物,测得LipR水解活性的最适pH值为8.5,最适反应温度为40℃,说明LipR是一种相对耐碱耐热的酯酶;而在不同的除垢剂或金属离子存在的环境下,LipR水解pNPB的活性受到一定程度地抑制。重组质粒注射小鼠后,发现LipR能抑制γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素(IL)-2的分泌,但IL-10分泌量增加。结论酯酶LipR可能参与帮助MTB协同抵抗宿主内苛刻的环境,并充当免疫调节剂,抑制促炎细胞因子分泌。

关键词：结核分枝杆菌 Lip家族 α/β水解酶脂酶/酯酶细胞因子

NDRG1在肿瘤侵袭转移相关分子机制中的研究进展

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中华病理学杂志 2018年第1期47卷 75-78页

作者：何易晓朱宇杨丽娟王芳昆明医科大学病理学教研室 650500 河南郑州应用技术职业学院

N-MYC 下游调节基因（N-MYC down-stream-regulated-gene,NDRG）1是 NDRG 家族成员,人源 NDRG 基因包括NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4[1].NDRG家族属于α/β水解酶超家族,但无水解酶催化位点.研究表明,NDRG1与细胞的生长[2]及凋亡[3]、肿瘤细胞增殖[4-5]、缺氧应激反应[6]、肿瘤细胞的药物反应和耐药性[7]、肿瘤侵袭和转移[8]等有关,还能被多种诱导分化剂诱导表达,

关键词：肿瘤侵袭转移 NDRG1 分子机制肿瘤细胞增殖 α/β水解酶调节基因家族成员 N-MYC

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人酯酶D的三维结构研究

生物物理学报 2009年第S1期25卷 87-88页

作者：武栋李扬宋高洁张荣光 Neil Shaw 刘志杰中国科学院生物物理研究所 100101

人酯酶D(EC3.***.1.1)是非特异性酯酶家族的一员,在人体脑、肝脏、肾等器官大量表达,它的功能主要是催化水解乙酰基团。

关键词：酯酶D 成视网膜细胞瘤 α/β水解酶结构

大肠杆菌烷基过氧化氢还原酶（AhpF-AhpC）的结构与功能研究和大肠杆菌YcjY蛋白的结构与功能研究

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大肠杆菌烷基过氧化氢还原酶（AhpF-AhpC）的结构与功能研究和大...

作者：陈超飞安徽大学

学位级别：硕士

烷基过氧化物还原酶(AhpR)系统还原细胞内各种过氧化物底物,具有解毒功能,因而在细菌中起重要作用。AhpR能够保护细胞抵抗氧化压力,是通过烷基过氧化氢还原酶的两个亚基实现-AhpF和AhpC。AhpC是一个典型的2-cys过氧化物还原酶(peroxired... 详细信息

烷基过氧化物还原酶(AhpR)系统还原细胞内各种过氧化物底物,具有解毒功能,因而在细菌中起重要作用。AhpR能够保护细胞抵抗氧化压力,是通过烷基过氧化氢还原酶的两个亚基实现-AhpF和AhpC。AhpC是一个典型的2-cys过氧化物还原酶(peroxiredoxin),它能够直接将过氧化物底物转化为水或相应的醇,从而起到解毒作用。AhpF是一个黄素蛋白,特异性催化AhpC蛋白,把NADH上的电子转移到AhpC上来再生AhpC。电子从最初的NADH转移到最终的AhpC上,AhpF上有三个催化中心参与电子转移过程：一个N-端氧化还原结构域(NTD),一个FAD结合结构域(FAD结构域)和一个NADH结合的氧化还原结构域(NAD结构域)。目前认为AhpF的调控机制和硫氧还蛋白还原酶-硫氧还蛋白系统(TrxR-Trx)类似。首先,电子在AhpF蛋白分子内部传递,结合在NAD结构域上的NADH把电子传递给FAD结构域的辅酶,辅酶FAD再传递给NAD结构域氧化还原中心Cys345-Cys348,随后电子传递给NTD结构域的Cysl29-Cysl32。最后,电子在AhpF与AhpC分子之间传递,电子从AhpF的结构域NTD (Cysl29-Cysl32)传递给二聚体AhpC的氧化还原中心Cys47-Cys166上。在上述电子传递过程,AhpF中NAD结构域Cys348作为亲核基团攻击NTD结构域Cys129,然后Cys129作为亲核基团攻击AhpC中的Cys166,完成氧化还原催化反应。AhpF蛋白在催化过程中经历剧烈的构象变化,一方面,NTD结构域的Cysl29-Cysl32和NAD结构域Cys345-Cys348需要相互接触接受来自NADH的电子;另一方面,NTD结构域Cysl29-Cysl32需要和AhpC接触。因此NTD结构域需要经历构象变化,以便将电子传递给AhpC蛋白。本论文中,我们纯化了E.coli的内源AhpF蛋白,获得了AhpF蛋白的晶体结构(分辨率为2.2A)。从整体结构来看,AhpF呈现为一个全新的开放构象,它的N-端结构域远离C-端结构域,这一构象和来自鼠伤寒沙门氏菌高度同源蛋白StAhpF和最近报道的大肠杆菌的EcAhpF构象均不相同。我们的实验结果表明,AhpF可能采用一个开放状态去更高效的催化十聚体的AhpC,完成过氧化物的解毒功能。我们在AhpF晶体结构中捕捉到开放的构象可能是AhpF进行分子间电子传递的中间态。肽聚糖是细菌细胞壁中重要和独特的组分,位于细胞质膜外,它的主要功能是通过抵抗高渗透压来保持的的完整性和保持细胞形态。在肽聚糖代谢过程中,PgrR是一个转录因子,它作为一个阻遏蛋白调控参与肽聚糖寡肽降解基因的表达,它可以直接结合到pgrR上游和反向ycjY-ymjD-ymjC-mpaA基因簇之间的操纵子上,调控ycjY-ymjD-ymjC-mpaA基因簇的表达。最近有报道说,过量表达ycjY-ymjD-ymjC-mpaA基因簇中的未知水解酶ycjY能够导致大肠杆菌细胞变长呈丝状表型,推测YcjY可能在大肠杆菌细胞生长和分裂过程中起作用。事实上,肽聚糖水解酶对细胞形状和生长状况有重大影响。本论文我们解析了大肠杆菌YcjY蛋白的晶体结构(分辨率2.0A)。YcjY的单体结构呈现出一个经典的α/β水解酶折叠,它可以分为两部分：一个核心催化结构域和一个插入(insertion)结构域。核心催化结构域有一个中心8β折叠,大部分是平行的p折叠,其中β2是反向平行的。中心p折叠两侧是a螺旋,一侧是α1,α111和α12,另一侧是α2,α3和α10。中心p折叠呈现出一个左手超螺旋扭转,β1和p10呈90℃。插入区域(insertion)位于中心p折叠的β6和β9之间的loop上。插入区域由一个小的反平行p-发夹(β7/β8)和6个a-螺旋(α4,α5,α6,α7,α8和α9)组成,它们共同组成一个位于核心催化结构之上的帽子结构。我们通过凝胶过滤层析研究了YcjY在溶液中的聚集状态,它表现出一个单一的峰,层析峰对应分子量大小为58.88 kDa,表明它在溶液中以二聚体形式存在(单体是33.7 kDa)。与其他a/p水解酶相比,我们确定了YcjY作为半胱氨酸水解酶的催化位点,通过细胞表型实验确定了这些位点的重要性。我们还发现,YcjY的功能可能受到在同一操纵子基因ymjD, ymjC和]mpaA的拮抗效应影响。综上所述,YcjY可能作为一个新的α/β水解酶,参与到肽聚糖寡肽水解和肽聚糖生物合成过程。

关键词：烷基过氧化氢还原酶构象变化 YcjY α/β水解酶催化二联体丝状表型

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ndrg家族研究进展

生命科学 2003年第4期15卷 203-206页

作者：张健刘新平张万会药立波第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室西安710032 第四军医大学基础部生理学教研室西安710032

ndrg家族包括ndrg1、ndrg2、ndrg3和ndrg4四个成员,其中ndrg4分为三个亚型:ndrg4-B、ndrg4-B^(var)和ndrg4-H。ndrg家族在正常组织和肿瘤组织中存在着差异表达,它在细胞的增殖、分化过程中发挥着重要作用。

关键词： ndrg N—myc 细胞分化差异表达 α/β水解酶

人ndrg家族成员cDNA的克隆、表达及抗体制备

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人ndrg家族成员cDNA的克隆、表达及抗体制备

作者：张健中国人民解放军第四军医大学

学位级别：硕士

人ndrg2基因(N-myc downstream-regulated gene 2)是本课题组于2000年从正常成人全脑cDNA文库中发现和获得的新序列。其全长为2,024bp，经BLAST相似性分析证明所得序列为一新基因(GenBank检索号：AF159092)。ndrg2基因含有16个外显子和1... 详细信息

人ndrg2基因(N-myc downstream-regulated gene 2)是本课题组于2000年从正常成人全脑cDNA文库中发现和获得的新序列。其全长为2,024bp，经BLAST相似性分析证明所得序列为一新基因(GenBank检索号：AF159092)。ndrg2基因含有16个外显子和15个内含子，定位于染色体14q11.2，编码一个含有357个氨基酸残基、分子量约为40kDa的蛋白质。初步研究显示，该基因可表达于多种组织中，并且是正常脑组织和胶质瘤的差异表达基第四军医大学硕士学位论文因。目前己报道该家族共有四个成员：ndrgl、ndrgZ、ndrg3禾 ndrg4，其中nd侣4又分为三个亚型：叫＊个B、n巾叶庄“『和叩r＊＊H。珐家族各成员厂的氨基酸残基序列同源性很高，但在各组织间的表达水平有明显差异。己知有多种因素可以影响 ndrg的表达水平，在施加同型半脐氨酸、致 DNA损伤性物质、地衣霉素hunicamycin＼应激刺激（缺氧、Niy等＼抑癌基因p53等因素的条件下，ndrgl 的表达上调;而雄激素、N－myc、C－myc 等因素可下调 ndrg 的表达。己有文献报道，在细胞的增箔分化、细胞氧化还原电势平衡的维持、阻抑肿瘤细胞扩散等过程中，ndrg和 ndrgZ发挥着重要作用［’””］。由于目前对于 ndrg家族的结构和功能性认识尚不全面，因此，克隆和表达n山g家族各成员并制备相应的特异性抗体则成为迫切而重要的基础性工作，有利于从总体上研究该家族各成员的生理功能。根据上述事实，本实验按如下方案展厂： 1．ndrg家族成员的cDNA克隆。提取人胎脑组织的总RNA，经反转录制备cDNA。依据GenBanLk登录的ndrg家族各成员序列分别合成了针对 ndfgl、ndrg3和 ndfg4B的引物，然后进行 PCR反应以扩增 DNA，回收和纯化PCR产物并将其插入到pMD 181载体中进行克隆后测序分析，用 BLAST 程序验证测序结果。 2．ndfg家族成员的原核表达。将测序下确的片段插入到pRSETA。 pGEX＊T、pPpoEX卫Tb等表达载体中，分别用 IPTG诱导表达，发现 pPROEX－HTbndygl所编码的NDRGI蛋白有高效可溶性表达。 3．NDRGI 蛋白的二级结构分析。融合表达的6HIS．NDRGI 蛋白经 NiNTA偶联的琼脂糖珠纯化后，进行圆h色性分析。发现在该分于中，几种蛋白质二级结构所占比列如下：。螺旋：23石9入p片层：18石％，转角： 25．7％，无规则卷曲：32刀％，这与计算机程序预测的结果相近。 4．抗人 NDRG家族的多克隆抗体制备。用可溶性的 6HIS－NDRG蛋白 4 第四军医大学硕士学位论文免疫家兔获得了高效价的兔抗人 NDRG多克隆抗血清，利用固定于硝酸纤维素膜上的NDRGI抗原进行亲和吸附，以纯化抗血清，提高了NDRGI多克隆抗体的特异性，并用此纯化的抗体进行了免疫组化和 Western捡测。出于＊＊＊G家族各成员间氨基酸组成有很高的同源性，此抗体在识别＊D＊GI。 NDRGZ、NDRG3和 NDRG4时存在交叉，表明己获得抗人NDRG家族的多芜隆抗体。 5．抗人NDRG家族寡肽的多克隆抗体制备。山于抗人NDRG家族的多是隆抗体不能很好地区分NDRG1、NDRGZ、NDRG3和NDRG4，按各亚型分于氦基酸残基序列中特异的肽段合成的寡肽作为半抗原，与KLH偶联后兔疫家兔，以制备特异性的抗寡肽抗体。B前免疫家兔的抗体滴度约为1：3 200，继续加强免疫，可望获得具有高度特异性的抗体，以特异地识别NDRGI。 NDRGZ、NDRG3和 NDRG4各亚型分子。

关键词： ndrg家族 N-myc 同源性反转录 PCR 克隆序列测定验证原核表达可溶性 Ni-NTA 亲和纯化圆二色性分析 α/β水解酶多克隆抗体制备抗血清特异性效价鉴定寡肽合成 KLH 载体蛋白转染

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NDRG2蛋白的初步研究

NDRG2蛋白的初步研究

作者：张文红第四军医大学

学位级别：硕士

人的ndrg2(N-myc downstream regulated gene 2)基因是本室于1999年从正常成人全脑cDNA文库中最先发现并克隆得到。其染色体定位于14q11.2，含有16个外显子，15个内含子;mRNA全长为2，024nt，编码含有357个氨基酸残基，分子量约40kD的... 详细信息

人的ndrg2(N-myc downstream regulated gene 2)基因是本室于1999年从正常成人全脑cDNA文库中最先发现并克隆得到。其染色体定位于14q11.2，含有16个外显子，15个内含子;mRNA全长为2，024nt，编码含有357个氨基酸残基，分子量约40kD的蛋白质。Ndrg基因家族中最早被发现的是Ndrg1，它是在研究N-myc下游调节基因时从小鼠胚胎中发现的一种新基因。目前己报道的该家族成员有4个：ndrg1，ndrg2、ndrg3和ndrg4，它们之间具有较高的同源性，但表达水平在组织发育阶段和分布上差异明显，具体功能还不清楚。 NDRG家族的表达受很多内外界因素的调节，上调NDRG1的有：第四军医大学硕士学位论文 hOIDOCystCin、tillllCmpCin、细胞氧化应激（缺氧、NP＋、各种还原试剂L 视黄酸、P53等;下调的有：nrgen、c－Illyc、ump等。综合己有的文献，推测NDRG家族可能参与细胞生长分化、维持细胞氧化还原电势平衡（氧化应激或生物转化）、阻止肿瘤细胞恶化等。因此，研究其在细胞中的具体功能以及可能的信号通路将具有非常重要的意义。深人研究NDRGZ在体内的组织细胞和亚细胞水平分布特点及其功能，需要高效价和高特异性的NDRGZ抗体。为制备高效价的NDRGZ 抗体，分别构建了 pRset－A雌、pGEX4T＊－d唾仓和 PGEX4Tl 七三种原核重组表达质粒，并在大肠杆菌中诱导表达出相应的融合蛋白;用全长GSTJqDRGZ 蛋白免疫兔，然后用 GST－NDRGZ人和GSTJqDRGZE片段加强免疫，经免疫得到了较高效价的兔抗人NDRZ多克隆抗血清，利用固定于硝酸纤维素膜上的 NDRGZ抗原亲和吸附纯化抗血清，提高了NDRGZ抗体的特异性;并对包涵体形式表达的6His－NDRGZ进行初步的分离纯化。为研究NDRGZ的结构与功能，构建了NDRGZ的酵母融合表达质粒，并在比赤酵母中得到可溶形式的表达;利用金属螫合亲合层析纯化出了6HIS融合的NDRGZ蛋白。由于NDRG家族在基因和氨基酸序列上不与任何已知功能的蛋白质同源。为从结构上得到与功能相关的信息，对助汐基因的调控区和 NDRGZ蛋白的二级结构进行了生物信息学分析。研究发现呷基因的调控区存在多种转录因子结合位点，功能主要涉及组织特异性表达调控，细胞生长发育相关基因的表达调控，刺激反应基因的表达调控等;NDRGZ蛋白在结构上属于 a小水解酶类折叠，折叠分类预测表明 ND RG 2与其中的的细菌环氧化物水解酶的二级结构极为相似，提示 NDRGZ蛋白具有一定酶活性，可能参与细胞抗氧化应激反应，维持细，An）armtBffIofBfochmIlsYn）MdAfblechmrBfobo 4 第四军医大学硕士学位论文胞内氧还电势平衡，参与内外源有毒物质的代谢等。这些信息为以后深入研究其功能提供了重要的线索。

关键词： NDRG2蛋白原核表达抗血清亲和纯化特异性生物信息学 α/β水解酶环氧化物水解酶氧化应激

用比较基因组学方法分析人NDRG2的生物学功能

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第四军医大学学报 2009年第18期30卷 1821-1824页

作者：江宁刘学武刘文超刘新平第四军医大学西京医院肿瘤科陕西西安710033 第四军医大学生物化学与分子生物学教研室陕西西安710033

目的:预测NDRG2的功能,为进一步进行实验研究提供线索.方法:用比较基因组学分析ndrg2的转录调控,搜索其同源蛋白以及理解NDRG2的空间结构.结果:人ndrg2有两个转录起始位点,长转录起始位点与牛ndrg2的转录起始点相似;短转录起始点与小鼠n... 详细信息

目的:预测NDRG2的功能,为进一步进行实验研究提供线索.方法:用比较基因组学分析ndrg2的转录调控,搜索其同源蛋白以及理解NDRG2的空间结构.结果:人ndrg2有两个转录起始位点,长转录起始位点与牛ndrg2的转录起始点相似;短转录起始点与小鼠ndrg2的转录起始点相似.发现了许多物种中NDRG2的同源蛋白,其中MESK2为NDRG2在果蝇中的同源蛋白.许多NDRG2的结构邻居被找到.NDRG2蛋白中水解酶的关键氨基酸已发生改变.结论:ndrg2在人中有两种不同的转录调节方式,两个转录起始点之间可能存在一个微小启动子;NDRG2同源蛋白只存在于后生生物层,在原核生物层中不存在,这些同源蛋白参与了细胞的分化;NDRG2在空间结构上属于α/β水解酶超家族,但由于关键氨基酸的缺失,其可能没有水解酶活性.

关键词： ndrg2基因 NDRG2蛋白比较基因组学生物信息学 α/β水解酶

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人酯酶D的三维结构研究

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