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黄原胶寡糖的酶法制备及其性能

大连工业大学学报 2022年第5期41卷 326-331页

作者：谷金芸李宪臻杨帆大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

对大肠杆菌BL21(DE3)的胞内酶液进行提取,并对其酶学性质进行表征,发现BL21(DE3)胞内酶液同时具有较高的黄原胶内切酶和裂解酶活力,分别为(104.00±1.36)U/g和(1.28±0.62)U/mg。对黄原胶酶解条件进行优化,最终确定该酶解体系中最适粗... 详细信息

对大肠杆菌BL21(DE3)的胞内酶液进行提取,并对其酶学性质进行表征,发现BL21(DE3)胞内酶液同时具有较高的黄原胶内切酶和裂解酶活力,分别为(104.00±1.36)U/g和(1.28±0.62)U/mg。对黄原胶酶解条件进行优化,最终确定该酶解体系中最适粗酶质量浓度为1.0 mg/mL,底物质量浓度为2.0 mg/mL,酶反应温度为45℃,pH为8.0,反应时间为2 min。实验证实了BL21(DE3)胞内酶液能够有效地切割黄原胶,得到不同聚合度大小的黄原胶寡糖(DE=3.7%)。与酸碱法相比,酶法制备的黄原胶寡糖还具有良好的DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性、还原力和过氧化氢清除活性。

关键词：黄原胶寡糖大肠杆菌胞内酶液生理活性

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黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性

黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性

作者：刘晗中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）

学位级别：硕士

寡糖及糖缀合物广泛的存在于生命体内,是重要的信息物质,参与多种生命活动。寡糖由于结合位置和结合类型的不同,种类繁多,有着多种重要的生物活性。黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖,而关于其降... 详细信息

寡糖及糖缀合物广泛的存在于生命体内,是重要的信息物质,参与多种生命活动。寡糖由于结合位置和结合类型的不同,种类繁多,有着多种重要的生物活性。黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖,而关于其降解产物——黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性,至今少见报道。首先,本文对一株从野外筛选到的分泌黄原胶酶的菌株进行了鉴定,根据该菌株形态特征、生理生化特征,对照《伯杰细菌鉴定手册》,初步确定它属于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)。16S rRNA序列测定结果也支持这一结论。该菌已保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC NO.1421)。其次,通过对Sphingomonas sp. XT-11发酵条件的研究,筛选出有利于产酶的各实验因子的适宜水平。结果表明,酶形成的适宜温度为30℃,培养基适宜起始pH值为7.0,培养基适宜底物浓度为1%,摇瓶发酵用250mL三角瓶装液30mL酶活力较高。适宜种龄为16～24h,接种量对发酵影响不大。再次,对黄原胶寡糖在抗氧化、抑制皮肤浅部真菌、植物诱抗、抑制ACE方面的生物学活性进行了探索,发现粗酶液降解得到的粗黄原胶寡糖拥有较强的抗氧化能力,而对ACE则没有抑制作用;黄原胶寡糖还拥有了较强的抗皮肤浅部真菌活性以及一定的植物诱抗活性。最后,对鞘氨醇单胞菌XT-11红细胞凝集活性进行了研究。发现该菌悬液能凝集2种血红细胞。菌悬液对兔红细胞的凝集可以被肝素所抑制。其凝集活性不依赖于Ca;在pH为6.0～10.0范围内较稳定;它的凝集活性在60℃时完全丧失。

关键词：黄原胶寡糖鞘氨醇单胞菌发酵参数生物学活性

内切β-1,4-葡聚糖酶的异源表达及其水解制备黄原胶寡糖

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内切β-1,4-葡聚糖酶的异源表达及其水解制备黄原胶寡糖

作者：许颖江南大学

学位级别：硕士

黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)生产的一种复杂胞外多糖。自1968年获得“公认安全”(GRAS)批准以来,由于其独特的流变性能以及良好的稳定和增稠效果,黄原胶作为食品添加剂的应用越来越广泛。通过水解黄原胶制备的黄... 详细信息

黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)生产的一种复杂胞外多糖。自1968年获得“公认安全”(GRAS)批准以来,由于其独特的流变性能以及良好的稳定和增稠效果,黄原胶作为食品添加剂的应用越来越广泛。通过水解黄原胶制备的黄原胶寡糖(XGOS)具有抗氧化、抗凋亡、益生等特殊生物活性,具有很高的附加值和广阔的应用前景。酶法水解黄原胶具有反应条件温和、过程可控等优点,但特异性酶较难获取,且黄原胶的大分子特性导致其酶解效率较低。针对以上问题,本研究将骆驼瘤胃元基因组来源的内切β-1,4-葡聚糖酶(Persi Cel4)在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中表达,并与野油菜黄单胞菌(*** CCTCC M2015714)建立耦合发酵体系一步法制备XGOS。最后对XGOS进行分离提取、结构表征及生物活性研究。主要研究成果如下:(1)通过异源表达骆驼瘤胃元基因组来源的Persi Cel4,构建了重组毕赤酵母GS115-p PIC9K-persi Cel4,随后对其发酵条件进行优化,并研究了Persi Cel4酶学性质。结果显示,重组毕赤酵母摇瓶水平的最佳发酵条件为p H 6.0、28℃、装液量20%、甲醇添加量1.5%,在7 L发酵罐中Persi Cel4活力达到17.97 U·m L。Persi Cel4的最适催化条件为p H 7.0、75℃,能直接水解商品黄原胶得到重均分子量为1536 Da的XGOS-1,其在水解产物中占比48.17%。此外,通过在野油菜黄单胞菌发酵过程中流加Persi Cel4酶液,建立了一种新型XGOS生产策略,最终获得重均分子量为1808 Da的XGOS-2,占水解产物的51.50%。(2)建立了重组毕赤酵母与野油菜黄单胞菌的耦合发酵体系,毕赤酵母分泌的Persi Cel4直接水解野油菜黄单胞菌生产的黄原胶来一步法制备XGOS。进一步对耦合发酵条件进行优化,最佳发酵条件为:野油菜黄单胞菌单独发酵36 h后,将4倍(v·v)接种量的毕赤酵母接入发酵体系,控制此阶段p H为7.0,每24 h添加发酵液体积0.75%的甲醇至发酵结束。摇瓶水平中耦合发酵体系的总糖最高为11.40 g·L,产物中重均分子量为2500 Da的XGOS-3占比93.79%;在7 L发酵罐中,耦合发酵体系的总糖最高达到17.85 g·L,其中低分子量黄原胶(52 030 Da)占96.64%。(3)对上述三种方法(常规水解、流加酶液和耦合发酵)制备得到的XGOS-1、XGOS-2和XGOS-3进行提取纯化,通过单糖组成分析、MALDI-TOF MS分析、FT-IR光谱及NMR光谱对其结构进行解析,确定了XGOS-1的聚合度为8和9,XGOS-2的聚合度为5和10,XGOS-3的聚合度为14。三种XGOS均具有较高的抗氧化活性,当XGOS-1浓度为5 g·L时,DPPH自由基清除率达到76.47%,当XGOS-3浓度为5 g·L时,羟自由基清除率达到89.74%。体外益生菌发酵实验表明XGOS可有效促进某些肠道益生菌的生长,并且生成有益肠道健康的短链脂肪酸和乳酸。

关键词：内切β-1,4-葡聚糖酶毕赤酵母耦合发酵黄原胶寡糖生物活性

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离子液体辅助黄原胶酸水解制备黄原胶寡糖

离子液体辅助黄原胶酸水解制备黄原胶寡糖

作者：孙大禹大连工业大学

学位级别：硕士

黄原胶寡糖是一种由黄原胶降解而成的寡糖,其具有良好的抗氧化能力和抑菌功能,在化妆品、农药以及医疗保健等方面有着非常好的应用前景。然而,由于分子量大、结构异常复杂,黄原胶难以被降解为寡糖分子,阻碍了黄原胶寡糖工业化生产的进... 详细信息

黄原胶寡糖是一种由黄原胶降解而成的寡糖,其具有良好的抗氧化能力和抑菌功能,在化妆品、农药以及医疗保健等方面有着非常好的应用前景。然而,由于分子量大、结构异常复杂,黄原胶难以被降解为寡糖分子,阻碍了黄原胶寡糖工业化生产的进程。离子液体是一种新兴的化学催化溶剂,研究表明,离子液体可以辅助酸降解纤维素。黄原胶主链结构与纤维素有着高度相似性,因此,本工作利用离子液体辅助酸降解黄原胶主链制备黄原胶寡糖,并对黄原胶寡糖进行生理活性与结构表征。本工作首先利用不同化学方法水解黄原胶制备寡糖,包括:酸氧化法、离子液体辅助酸水解法、碱氧化法、离子液体辅助碱水解法。随后比较了不同方法制备寡糖的生理活性,研究结果表明,离子液体辅助黄原胶酸水解法较之其他方法能够有效高水平的制备黄原胶寡糖。该方法制备的黄原胶寡糖的还原糖含量为1.1 mg/m L,较之酸氧化法、碱氧化法分别提高了1.7倍和6.1倍。离子液体辅助酸氧化法产生寡糖的羟基自由基清除率为17.5%,较之碱氧化法与酸氧化法分别提高了1.2倍和16.5倍。本工作随后对离子液体辅助黄原胶酸水解法进行了离子液体浓度、酸浓度、过氧化氢浓度、反应时间、反应温度的单因素分析。结果表明,当离子液体浓度为10 mg/m L,酸浓度为0.4 mol/L,HO的质量浓度为0.75%,温度为80℃的体系中反应4 d获得的黄原寡糖得率最高。黄原胶寡糖的产率为19.6%,2 mg/m L的黄原胶寡糖即可清除90%的羟基自由基。最后,本工作对离子液体辅助黄原胶酸水解制备的寡糖进行了生理活性以及结构的表征。凝胶渗透色谱分析结果表明,黄原胶寡糖的分子量分别在1500 Da与6000 Da左右;红外光谱以及核磁的结果表明分析结果表明,黄原价寡糖的链长变短且其侧链基团被去除;X射线衍射结果表明,黄原胶寡糖的结构相比于原始的黄原胶更致密。生理活性分析结果表明,寡糖有着很好的抗氧化活性与抑菌能力。1 mg/m L的寡糖对DPPH与羟基自由基的清除率分别为12%与46%。黄原胶寡糖其对野油菜黄单胞菌的半抑制浓度为9.2 mg/m L,有较好的抑菌能力。本工作的研究结果为今后制备新型黄原胶寡糖以及寡糖的功能开发提供了新思路。

关键词：黄原胶降解黄原胶寡糖离子液体寡糖的生理活性

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利用大肠杆菌降解黄原胶制备寡糖方法的初探

利用大肠杆菌降解黄原胶制备寡糖方法的初探

作者：谷金芸大连工业大学

学位级别：硕士

黄原胶寡糖是一种新型功能性寡糖,具有良好的生理活性,如:抗氧化活性、清除自由基活性、DPPH清除活性和抑菌活性等。到目前为止黄原胶寡糖主要通过化学法进行制备,相对于化学法制备黄原胶寡糖,酶法降解黄原胶是一种可靠的替代方法。但... 详细信息

黄原胶寡糖是一种新型功能性寡糖,具有良好的生理活性,如:抗氧化活性、清除自由基活性、DPPH清除活性和抑菌活性等。到目前为止黄原胶寡糖主要通过化学法进行制备,相对于化学法制备黄原胶寡糖,酶法降解黄原胶是一种可靠的替代方法。但是至今为止还没有开发出高效降解黄原胶的酶制剂,也没有关于利用酶法制备黄原胶寡糖的报道,因此需要开发高效的黄原胶降解酶系从而达到黄原胶寡糖工业化生产的目的。大肠杆菌是自然界中广泛存在的细菌,也是常用的基因工程菌。基因注释信息证实大肠杆菌细胞内含有大量的内源性糖苷水解酶,这其中可能包括潜在的黄原胶酶,因此本实验拟利用大肠杆菌粗酶液对黄原胶进行水解,同时对其水解条件进行优化,并对最终获得的寡糖产品进行表征。首先,本工作对大肠杆菌BL21(DE3)胞内酶液的活性进行了测定,确定了其具备黄原胶内切酶和裂解酶活性,比酶活力分别为(104.00±1.36)U/g、(1.28±0.62)U/mg,与文献中报道的相比酶活处于较高水平。同时对黄原胶的酶解条件进行了优化,得到了该反应的最优酶解条件为p H 8.0的缓冲体系中将1 g/L BL21(DE3)胞内酶液与2 g/L黄原胶底物混合,在45 C孵育6 d。在此条件下制备出黄原胶寡糖的DE值为11.75%,是已知报道化学法制备得到黄原胶寡糖DE值的1.6倍。接下来对制备得到的黄原胶寡糖进行了结构和生理活性的表征,确定了黄原胶酶解产物两个主要组分的相对分子量大小分别为2619 k Da和941 Da。通过离子色谱对其组分进一步分析,确定了聚合度为2～4、12～15、15～18的三组寡糖。利用X射线衍射仪鉴定出其结构为松散的无定形结构,经红外光谱的分析发现其保留下了如羟基、-CH、缩醛以及丙酮酸活性基团等特征峰。通过测定黄原胶寡糖的DPPH自由基的清除活性、羟自由基的清除、HO的清除活性、二价铁螯合活性,得到IC值分别为3.46、1.03、2.995、2.95 g/L,测得其还原力在寡糖浓度为3.0 g/L时吸光值为0.065。因此可以确定通过酶法制备得到的黄原胶寡糖具有良好的抗氧化活性。本工作为酶法降解黄原胶提供了一种新酶体系,并实现了高效降解黄原胶制备黄原胶寡糖的目的,为黄原胶寡糖的工业化制备奠定了基础。

关键词：大肠杆菌黄原胶酶黄原胶寡糖抗氧化活性

黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻

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黄原胶的降解、产物寡糖结构的初步分析及生物活性探寻

作者：黄成栋中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）

学位级别：硕士

寡糖因其独特的生物学活性而引起了国际上众多研究者的极大兴趣。黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖,而关于其降解产物——黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性,至今未见报道。本文通过酶解方法成... 详细信息

寡糖因其独特的生物学活性而引起了国际上众多研究者的极大兴趣。黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖,而关于其降解产物——黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性,至今未见报道。本文通过酶解方法成功地制备了黄原胶寡糖,并应用HPAEC-PAD 以及MALDI-TOF-MS 对酶解产物的组成、结构进行了初步分析,此外,还第一次对黄原胶寡糖的生物学活性进行了探索。本文从野外筛选到了一株能够分泌黄原胶降解酶的菌株,并对该菌株进行了初步鉴定,确定为Cellulomonas 属中的一个新种;初步分离纯化了黄原胶降解酶,并对该酶的酶学性质进行了研究;通过HPAEC-PAD以及MALDI-TOF-MS对黄原胶酶解的产物进行了组成、结构分析,确定了酶解的主要产物为五糖单元,并确定了酶解位点。对黄原胶寡糖在抑菌、抗病毒、植物诱抗、抗氧化方面的生物学活性进行了探索,发现黄原胶寡糖拥有较强的抑制真菌生长的能力,而对细菌则没有抑制作用;黄原胶寡糖还拥有了很强的抗病毒活性,一定的植物诱抗活性以及较强的抗氧化活性。

关键词：黄原胶寡糖制备结构组成生物学活性

天然生物质材料的制备、性质与应用(Ⅹ)——高黏稳定的水溶性微生物多糖:黄原胶

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日用化学工业（中英文） 2024年第10期54卷 1172-1180页

作者：吕妮雅张燕爽韩桂梅范金石青岛科技大学生物工程学院山东青岛266042 青岛科技大学省部共建生态化工国家重点实验室培育基地山东青岛266042

黄原胶是由黄单胞菌属产生的胞外多糖,是由一系列五糖重复单元链接形成的高分子杂多糖聚合物。黄原胶及其衍生物以其优异的稳定性、增稠性、乳化性、悬浮性、流变性、耐酸碱性、耐温性,耐盐性等性能,广泛应用于日用化学品、食品、医药... 详细信息

黄原胶是由黄单胞菌属产生的胞外多糖,是由一系列五糖重复单元链接形成的高分子杂多糖聚合物。黄原胶及其衍生物以其优异的稳定性、增稠性、乳化性、悬浮性、流变性、耐酸碱性、耐温性,耐盐性等性能,广泛应用于日用化学品、食品、医药、水处理、石油开采等多个行业领域。本文介绍了黄原胶的结构、性质、生产方法和改性技术,以及黄原胶寡糖的性质、制备和分离纯化方法,并概述了黄原胶及其改性产物的应用情况,提及了当前黄原胶生产中的问题及今后的发展前景。

关键词：黄原胶黄原胶糖黄原胶寡糖提取性质应用

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黄原胶琥珀酸衍生物的抗氧化活性

食品与生物技术学报 2014年第12期33卷 1272-1277页

作者：孙涛周可鹏谢晶熊小英上海海洋大学食品学院上海201306

黄原胶寡糖与琥珀酸酐反应,得到3种衍生物XGOSSA-1、XGOSSA-2和XGOSSA-3,对产物进行FT-IR表征,GPC法测定其相对分子质量分别为7 560、6 400和7 430,3种衍生物的丙酮酸质量分数分别为4.6%、4.9%和4.9%,还原糖质量分数分别为20.5%、19.4%... 详细信息

黄原胶寡糖与琥珀酸酐反应,得到3种衍生物XGOSSA-1、XGOSSA-2和XGOSSA-3,对产物进行FT-IR表征,GPC法测定其相对分子质量分别为7 560、6 400和7 430,3种衍生物的丙酮酸质量分数分别为4.6%、4.9%和4.9%,还原糖质量分数分别为20.5%、19.4%和19.0%,取代度分别为0.18、0.32和0.43。考察3种衍生物对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基和过氧化氢的清除活性以及还原能力。3种衍生物的抗氧化强弱顺序为:XGOSSA-1>XGOSSA-2>XGOSSA-3。即当相对分子质量,还原糖和丙酮酸质量分数相近时,随着取代度的升高,抗氧化能力下降。造成这种现象的原因可能是随着取代度增大,活性羟基数目减少,导致抗氧化性能降低。

关键词：黄原胶寡糖黄原胶琥珀酸衍生物抗氧化活性

纤维素外切酶CelC7的异源表达及降解黄原胶性能

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大连工业大学学报 2023年第3期42卷 163-168页

作者：高媛郝淼闻李宪臻杨帆大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034 大连工业大学学报编辑部辽宁大连116034

为开发新型黄原胶外切酶、获得聚合度高度集中的黄原胶活性寡糖,对来自牛瘤胃真菌的纤维素酶CelC7的编码基因进行全基因合成,并在大肠杆菌中进行异源表达。该基因大小为1032 bp,编码344个氨基酸残基,表达蛋白产物理论分子质量为40 ku,... 详细信息

为开发新型黄原胶外切酶、获得聚合度高度集中的黄原胶活性寡糖,对来自牛瘤胃真菌的纤维素酶CelC7的编码基因进行全基因合成,并在大肠杆菌中进行异源表达。该基因大小为1032 bp,编码344个氨基酸残基,表达蛋白产物理论分子质量为40 ku,属于糖苷水解酶GH7家族。该酶在大肠杆菌中高效可溶性表达,经过Ni-NTA亲和层析纯化后,可得到纯度达90%的纯酶。酶学性质分析结果表明,该酶最适反应温度为50℃,最适pH为6.0。CelC7能够有效地对黄原胶主链进行特异性切割,将其水解为低分子质量寡糖。亚铁离子螯合活性实验结果显示,该低分子质量寡糖对亚铁离子螯合活性的半清除活性IC50为3.60 mg/mL,表明成功制备黄原胶活性寡糖。

关键词：黄原胶寡糖纤维素外切酶亚铁离子螯合活性

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