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食品研究与开发 2006年第1期27卷 136-137,154页

作者：段振华殷安齐贾巧利尚军海南大学海洋学院食品系海口570228

就海鱼鱼鳔的功能结构、营养与药用价值、食用和药用加工利用等现状进行了研究,并对海鱼鱼鳔资源的加工利用发展方向进行了探讨。

关键词：海鱼鱼鳔营养加工

鮟鱇鱼鱼鳔抗氧化肽的制备及其对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型的作用机制

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鮟鱇鱼鱼鳔抗氧化肽的制备及其对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细...

作者：王婉怡浙江海洋大学

学位级别：硕士

本文以鮟鱇鱼(Lophius litulon)鱼鳔为原材料,采用蛋白酶酶解工艺制备抗氧化肽酶解物,通过膜超滤、凝胶色谱、高效液相色谱等分离纯化技术制备抗氧化肽。并深入研究不同抗氧化肽(A1-A18)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型保护作用机... 详细信息

本文以鮟鱇鱼(Lophius litulon)鱼鳔为原材料,采用蛋白酶酶解工艺制备抗氧化肽酶解物,通过膜超滤、凝胶色谱、高效液相色谱等分离纯化技术制备抗氧化肽。并深入研究不同抗氧化肽(A1-A18)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型保护作用机理。研究内容及结果如下:(1)鮟鱇鱼鱼鳔抗氧化肽的制备:以DPPH自由基清除率为指标,对蛋白酶的种类及酶解条件进行工艺优化。先将鮟鱇鱼鱼鳔分别在胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,碱性蛋白酶和风味蛋白酶的最适宜条件下进行酶解,筛得木瓜蛋白酶酶解产物对DPPH自由基的清除率最高(43.09±1.69%);进而对木瓜蛋白酶酶解鱼鳔的最适条件进行优化,选取酶解时间、温度、pH、加酶量和料液比五个酶解条件进行单因素实验。根据结果,设计正交优化实验,得出木瓜蛋白酶最佳酶解条件为:温度65℃、时间5 h、pH 7.5和加酶量2.5%。在最优酶条件下,制备酶解液的DPPH自由基的清除率为47.13±1.15%;并取酶解液进行超滤,分子量鱼鳔抗氧化肽对NAFLD细胞模型脂质堆积的保护机理研究:采用游离脂肪酸(FFA)诱导人肝癌细胞(HepG2),建立细胞NAFLD模型,研究A1-A18对NAFLD细胞模型脂质堆积的保护作用。结果表明:在200μM浓度处理24 h后,A2、A8、A10、A13和A18对HepG2细胞显示出较强的保护能力。通过油红O染色观察显示A2、A8、A10、A13和A18均能显著减少FFA诱导的HepG2细胞内脂质堆积;且在50-200 μM浓度下能一定程度地减少TG和TC的含量,效果呈剂量依赖性。作用机制研究显示A2、A8、A10、A13和A18均能影响总调控因子AMPK磷酸化蛋白表达;抑制脂肪生成关键因子SREBP-lc的表达,同时上调PPAP-α和CPT-1的蛋白表达,促进脂肪酸β氧化。综上,A2、A8、A10、A13和A1

关键词：鮟鱇鱼(Lophius litulon) 鱼鳔抗氧化肽抗氧化活性降脂活性非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

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几种鱼鳔的营养成分分析与评价

食品研究与开发 2007年第10期28卷 62-65页

作者：段振华汪菊兰殷安齐尚军海南省热带生物资源教育部重点实验室海南海口570228 海南大学海洋学院食品系海南海口570228

分析比较了不同鱼鳔的营养成分和氨基酸的含量变化特点,并对鱼鳔的化学组成与功能的关系进行了探讨。结果表明,鱼鳔是一种高蛋白、低脂肪且含有较丰富矿物质的重要水产食品资源。鱼鳔中的营养成分含量因种类不同而变化,不同鱼鳔的脂肪... 详细信息

分析比较了不同鱼鳔的营养成分和氨基酸的含量变化特点,并对鱼鳔的化学组成与功能的关系进行了探讨。结果表明,鱼鳔是一种高蛋白、低脂肪且含有较丰富矿物质的重要水产食品资源。鱼鳔中的营养成分含量因种类不同而变化,不同鱼鳔的脂肪含量变化最大,蛋白质含量的变化最小。氨基酸分析结果为:甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和天冬氨酸等六种氨基酸构成了鱼鳔蛋白质的优势氨基酸。除了甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸四种氨基酸在不同鱼鳔中的含量差异较大外,大多数氨基酸的含量变化不大。

关键词：鱼鳔营养成分氨基酸评价

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鲟鱼鳔明胶理化特性及抗菌应用研究

鲟鱼鳔明胶理化特性及抗菌应用研究

作者：王肖肖江苏大学

学位级别：硕士

鲟鱼鳔为一种富含胶原蛋白的鱼类加工废弃物,作为食药材和滋补品长期以来在中国和东南亚国家倍受青睐;但随着鲟鱼养殖量的逐年增加,大量的鲟鱼鳔并未得到科学合理的利用。本研究以鲟鱼加工废弃物(鱼鳔)为原料,建立了无酸碱预处理的明胶... 详细信息

鲟鱼鳔为一种富含胶原蛋白的鱼类加工废弃物,作为食药材和滋补品长期以来在中国和东南亚国家倍受青睐;但随着鲟鱼养殖量的逐年增加,大量的鲟鱼鳔并未得到科学合理的利用。本研究以鲟鱼加工废弃物(鱼鳔)为原料,建立了无酸碱预处理的明胶高效提取技术,明确了鲟鱼鳔明胶的理化功能特性;利用静电纺丝技术,制备了明胶/高良姜精油/β-环糊精(SG/GRO/β-CD-IC)复合纳米纤维膜,分析了其理化特性和抗菌活性。主要内容及结果如下:(1)在50℃、30 min和10 mL/g(L/S)的最优提取条件下,明胶得率为94.15%;该明胶具有与I型胶原蛋白相似的氨基酸组成和SDS-PAGE图谱。与商品化猪(PG)、牛(BG)和鱼皮明胶(FG)相比,该明胶表现出了较高的分子量(9.84 kDa)、乳化活性(171.76 m/g)、凝胶强度(853.23 g)、持水量(92.37%)、粘弹性(tanδ,0.03)和白度(ΔE,3.38),但其透射比(T=40.56%、T=59.07%)、乳化稳定性(30.09 min)、发泡性(203.00)及稳定性(26.92)、胶凝(16.88°C)和熔融温度(21.80°C)较低;pH接近中性(6.87),粘度适中(28.60 mPa·s)。该明胶还可被制成高质量的水凝胶和电纺纳米纤维。(2)利用GC-MS分析了GRO(galangal root oil)的主要成分:2-丙烯酸3-苯基乙酯(37.56%)、2-丙烯酸3-苯基甲酯(19.99%)、正十五烷(14.61%)、桉叶素(9.06%)、3-δ-烯(3.46%)、樟脑(3.24%)、乙酸异冰片酯(2.78%)、18-冠6-醚(2.48%)、L(-)-冰片(0.67%);通过静电纺丝技术制备了SG/GRO/β-CD-IC纳米纤维膜,其表现出较好的厚度(0.13 mm)、水溶性(5.06%)、接触角(89.55°)、水蒸气透过率(0.49 g·mm/(m·h·kPa))和控释作用(7 d,64.87%);SEM和FTIR显示GRO被成功包合,且成分无显著变化,包合物(GRO/β-CD-IC)成功结合于纳米纤维。该复合纳米纤维膜能够破坏大肠杆菌(O157:H7)细胞壁,促进细胞融溶溃烂,表现出显著的抗菌效果。

关键词：鱼鳔明胶制备纳米纤维抗菌

杜仲、蚕豆及其提取物对浅色黄姑鱼生长性能、抗氧化能力和鱼鳔胶原蛋白沉积的影响

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杜仲、蚕豆及其提取物对浅色黄姑鱼生长性能、抗氧化能力和鱼鳔胶...

作者：刘国权汕头大学

学位级别：硕士

鱼胶(鱼鳔的干制品)富含胶原蛋白,是我国传统药食两用的滋补品。浅色黄姑鱼是生产名贵鱼胶“白花胶”的重要经济鱼类。近年来,随着人们物质生活水平的提高及对鱼胶营养与保健价值的深入认识,市场上对优质鱼胶的需求日益旺盛。胶原蛋白... 详细信息

鱼胶(鱼鳔的干制品)富含胶原蛋白,是我国传统药食两用的滋补品。浅色黄姑鱼是生产名贵鱼胶“白花胶”的重要经济鱼类。近年来,随着人们物质生活水平的提高及对鱼胶营养与保健价值的深入认识,市场上对优质鱼胶的需求日益旺盛。胶原蛋白是鱼胶主要的营养成分,提高鱼鳔胶原蛋白的沉积有助于提高鱼胶产量和品质,具有重要的实践意义。研究表明,杜仲和蚕豆具有促进草鱼等肌肉胶原蛋白沉积的作用,然而杜仲、蚕豆及其提取物成分是否能够促进浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积目前仍不清楚。本项目通过饲料中添加杜仲叶粉(2%和4%)及杜仲绿原酸(200mg/kg和400mg/kg)、蚕豆醇提物(0.9%、1.8%和3.6%)及蚕豆水提物(1.25%、2.5%和5%)开展为期10周的养殖试验养殖实验,探讨其对浅色黄姑鱼生长性能、抗氧化能力及鱼鳔胶原蛋白沉积的影响,为提高浅色黄姑鱼鱼胶产量和品质的配合饲料添加剂开发提供科学依据。主要结果如下:1.杜仲叶粉和杜仲绿原酸对浅色黄姑鱼生长性能、抗氧化能力和鱼鳔胶原蛋白沉积的影响(1)在生长性能方面饲料中添加2%杜仲叶粉显著降低鱼体增重率和特定生长率,提高饲料系数,而添加4%杜仲粉对生长性能无显著影响,显著提高鳔重;饲料添加200mg/kg杜仲绿原酸显著增加鱼体增重率、特定生长率、鳔重并降低饲料系数,400mg/kg杜仲绿原酸组对生长性能影响不显著。(2)在抗氧化能力方面,饲料中添加2%、4%杜仲叶粉显著提高血清T-AOC、GSH-PX和肝脏SOD活力,降低肝脏中MDA含量;饲料添加2%杜仲叶粉显著提高血清MDA、CAT活力,与4%杜仲叶粉相反;饲料中添加200mg/kg杜仲绿原酸,能显著降低血清和肝脏中的MDA含量,提高血清GSH-PX、CAT活力;添加400mg/kg杜仲绿原酸显著降低血清和肝脏中MDA含量,提高血清T-AOC、GSH-PX、CAT以及肝脏中SOD、CAT活力。(3)在肠道消化酶方面,饲料中添加2%、4%杜仲叶粉和200mg/kg、400mg/kg杜仲绿原酸均显著提高脂肪酶活力,降低淀粉酶活力,与200mg/kg杜仲绿原酸和2%杜仲叶粉组结果相反。(4)在鱼鳔胶原蛋白方面,400mg/kg杜仲绿原酸组能显著提高鱼鳔中col1a1和col1a2基因表达水平和胶原蛋白含量,促进鱼鳔胶原蛋白沉积。2.蚕豆醇提物和蚕豆水提物对浅色黄姑鱼生长性能、抗氧化能力和鱼鳔胶原蛋白沉积的影响(1)在生长性能方面,饲料中添加蚕豆醇提物(1.8%和3.6%)显著降低鱼体增重率、特定生长率和鳔重,提高饲料系数。饲料中添加蚕豆水提物(1.25%、2.5%和5%)显著提高增重率、特定生长率和鳔重,降低饲料系数。(2)在抗氧化能力方面,饲料中添加0.9%、3.6%蚕豆醇提物显著降低血清MDA含量和SOD活性。0.9%蚕豆醇提物组,血清T-AOC、CAT活性有显著提高,0.9%、3.6%蚕豆醇提物显著提高肝脏MDA含量、SOD及CAT活性;饲料中添加蚕豆水提物(1.25%、2.5%和5%)显著降低血清MDA含量及SOD活性,1.25%蚕豆水提物添加显著提高血清T-AOC、GSH-PX、CAT以及肝脏中SOD、CAT活力。(3)在肠道消化酶方面,饲料中添加蚕豆醇提物(0.9%、1.8%、3.6%)和蚕豆水提物(1.25%、2.5%、5%)均显著提高脂肪酶活力、降低淀粉酶活力。添加显著降低。(4)在鱼鳔胶原蛋白方面,1.25%蚕豆水提物组鱼鳔col1a2基因表达水平和胶原蛋白含量显著提高,促进鱼鳔胶原蛋白沉积。

关键词：杜仲叶粉杜仲绿原酸蚕豆提取物浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白

基于天然鱼鳔胶原蛋白构建仿生多孔水凝胶支架用于肾组织再生研究

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基于天然鱼鳔胶原蛋白构建仿生多孔水凝胶支架用于肾组织再生研究

作者：吴恒南方医科大学

学位级别：硕士

背景慢性肾脏疾病(CKD)在全球具有较高的发病率和患病率,被认为是一个日益严重的公共健康问题,影响全球约8%～16%的人。尽管CKD的发病率不断上升,但其治疗方法仍然是有限的。透析通过清除血液中的某些代谢废物,可部分替代肾脏滤过功能,... 详细信息

背景慢性肾脏疾病(CKD)在全球具有较高的发病率和患病率,被认为是一个日益严重的公共健康问题,影响全球约8%～16%的人。尽管CKD的发病率不断上升,但其治疗方法仍然是有限的。透析通过清除血液中的某些代谢废物,可部分替代肾脏滤过功能,但透析患者的生活质量较差。当CKD发展为终末期肾病(ESRD)时,肾移植是唯一的治愈手段,但供体器官的短缺和长期接受免疫抑制剂的不良反应限制了其在临床上的广泛应用。原位再生策略通过提供一个诱导模板来引导受损组织的细胞行为、促进损伤区域再细胞化和器官功能恢复,可能是一种有前景的肾损伤修复方法。目的基于原位再生策略,在部分肾切除大鼠体内植入水凝胶支架,其作为功能性诱导模板,使肾切除区域再细胞化,促进肾损伤后修复。方法1.结合不同含量的硫酸软骨素(CS)和鱼鳔来源的Ⅰ型胶原(COL I),通过化学交联的方法制备仿生多孔水凝胶;对所制备的水凝胶进行表征及性能的检测。2.检测仿生水凝胶的生物相容性;通过F-actin染色、免疫荧光、Western blot等方法研究不同水凝胶对肾系膜细胞形态学及功能的影响。3.在4/6肾切除大鼠的左肾创面部位植入水凝胶支架,通过肾功能检测、H&E和Masson染色等方法探究不同水凝胶支架对肾损伤后修复的影响。结果1.制备的1COL/2CS组水凝胶具有高孔隙率、平均孔径约100 μm,孔隙分布均匀,并且具有良好的热稳定性、合适的溶胀性及力学性能。2.制备的1COL/2CS组水凝胶具有较高的生物相容性,该组细胞的纤维化相关蛋白fibronectin和α-SMA的表达水平比单纯COL组细胞的表达水平更低。3.植入4/6肾切除的大鼠模型时,与植入单纯的2COL或2CS水凝胶支架组大鼠相比,植入1COL/2CS水凝胶支架组的大鼠检测到更低水平的血肌酐、血尿素氮浓度(第4周和第8周),临近支架植入部位的肾损伤程度及纤维化程度也更低,而且在支架降解的部位观察到肾小管样结构的生成。结论在本研究中,我们利用糖胺聚糖硫酸软骨素和从草鱼鱼鳔中提取的Ⅰ型胶原,成功制备了一种仿细胞外基质的水凝胶。我们发现,1COL/2CS仿生水凝胶在体外具有良好的生物相容性,可降低系膜细胞内Fn和α-SMA的表达水平;在体内可以改善肾损伤大鼠的肾功能以及减轻肾纤维化程度,证实我们设计的功能性水凝胶支架具有诱导肾损伤后修复的潜力,为肾组织工程原位再生策略提供了实验基础。

关键词：鱼鳔 Ⅰ型胶原硫酸软骨素仿细胞外基质生物仿生水凝胶肾组织再生

结缔组织生长因子（CTGF）在浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白合成中的作用研究

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结缔组织生长因子（CTGF）在浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白合成中的作用...

作者：袁钰莹汕头大学

学位级别：硕士

浅色黄姑鱼鱼胶(鱼鳔干制品)是营养丰富的水产珍品。胶原蛋白是鱼胶重要的营养成分和品质评价指标,深入了解鱼鳔胶原蛋白合成的分子机制能够为提高鱼鳔品质的技术开发提供靶点和策略。然而,目前人们对鱼类胶原蛋白合成调控机制的了解仍... 详细信息

浅色黄姑鱼鱼胶(鱼鳔干制品)是营养丰富的水产珍品。胶原蛋白是鱼胶重要的营养成分和品质评价指标,深入了解鱼鳔胶原蛋白合成的分子机制能够为提高鱼鳔品质的技术开发提供靶点和策略。然而,目前人们对鱼类胶原蛋白合成调控机制的了解仍十分有限。哺乳动物中,结缔组织生长因子(CTGF)在胶原蛋白沉积相关的纤维化过程中发挥重要作用。然而,CTGF在鱼鳔胶原蛋白合成中的具体作用及其表达调控的机制尚无系统研究。本研究克隆了浅色黄姑鱼ctgf基因及其启动子序列,并对其组织表达、启动子活性及关键转录调控元件进行分析;进一步建立了浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系,在体外研究ctgf对鱼鳔细胞胶原蛋白合成的作用,主要结果如下:1)浅色黄姑ctgf基因ORF为1041 bp,编码346个氨基酸,分子量大小为38.29k Da,理论等电点(p I)值均为8.42,可能为分泌蛋白。通过结构分析发现ctgf基因含有5个外显子,4个内含子,与其他物种基因结构相似。氨基酸序列比对发现其与其他物种具有高度相似性(多刺棘光鳃鲷和半滑舌鳎的同源性分别为94.81%和92.22%)。q RT-PCR结果表明,ctgf基因在性腺、脾脏、鳃和鱼鳔中表达量最高,其次为肾脏、皮肤、心脏、脑、肌肉,在肝脏和肠中表达量最低。与I型胶原蛋白基因(col1a1、col1a2)在鱼鳔、鳃等组织中表达较高,在肠、肝脏、脑等组织中表达较低的模式相似。2)克隆出ctgf基因起始密码子上游序列3185 bp。根据生物信息学分析结果,对预测的启动子区(-1877～+166)进行PCR扩增构建5个截短体,分别为:D0(-378～+166)、D1(-785～+166)、D2(-1049～+166)、D3(-1544～+166)、D4(-1877～+166)。双荧光素酶活性实验分析发现D1具有最高的活性,可能是核心启动子区所在位置(-785～+166 bp),用浓度为10 ng/m L的TGF-β孵育可以显著上调D1的活性。对预测的顺式作用元件进行点突变并进行荧光素酶活性分析,结果显示Sp-1结合位点突变导致启动子活性上升,而Smad-3、NF-κB结合位点突变导致启动子活性下降,表明这些位点可能是ctgf启动子重要的转录调控元件。3)通过组织块贴壁法成功建立了浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系(NCSB),NCSB细胞呈纤维样,生长速度稳定,已连续传代50代以上。分别用浓度为5%、10%、15%和20%的血清配置DMEM完全培养基培养细胞,发现血清浓度越高,生长速度越快。通过脂质体法能成功将p EGFP-N1质粒转染到NCSB细胞中,并表达EGFP。4)在NCSB细胞中过表达ctgf,能够显著上调col1a1、col1a2基因表达及I型胶原蛋白(collagen I)含量(P鱼鳔细胞胶原蛋白合成。

关键词： CTGF 浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白点突变

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草鱼鱼鳔胶原的制备及应用研究

草鱼鱼鳔胶原的制备及应用研究

作者：张宝武汉工业学院

学位级别：硕士

为了充分利用鱼类废弃物,本文从草鱼鱼鳔中提取酸溶性胶原(ASC)和酶溶性胶原(PSC),对鱼鳔胶原的提取工艺条件优化和鱼鳔胶原的性质进行了研究,并对草鱼鱼鳔胶原海绵的制备工艺进行了研究。研究结果如下:在单因素实验的基础上,利用响应... 详细信息

为了充分利用鱼类废弃物,本文从草鱼鱼鳔中提取酸溶性胶原(ASC)和酶溶性胶原(PSC),对鱼鳔胶原的提取工艺条件优化和鱼鳔胶原的性质进行了研究,并对草鱼鱼鳔胶原海绵的制备工艺进行了研究。研究结果如下:在单因素实验的基础上,利用响应面分析法研究了液料比、HAC浓度和提取时间对草鱼鱼鳔酸溶性胶原(ASC)得率的影响,建立了各因子与ASC得率的数学回归模型。最后确定了ASC最佳的提取条件为:液料比为17.85,HAC浓度为0.54mol/L,提取时间为34.0h。在此最佳条件下,ASC得率为8.39%。研究了草鱼鱼鳔ASC和PSC的组成、结构及性质并对其进行了分析比较。ASC和PSC的紫外光谱与傅立叶变换红外光谱(FT-IR)分析表明,最大吸收峰都接近于230nm且都具有完整的三螺旋结构;氨基酸组成分析表明,ASC和PSC中羟脯氨酸和羟赖氨酸的总含量分别为16.87%和17.55%;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱和CM-Toyopearl650M型凝胶色谱分析图谱显示草鱼鳔胶原至少由两条不同的α链(α1和α2)组成,与猪皮I型胶原相似;蛋白酶K酶解实验表明,ASC比PSC容易酶解,说明ASC和PSC的结构不同;DSC差热分析表明,ASC比PSC热稳定性要好;ASC和PSC热变性温度(Td)分别为33.0℃、34.8℃,比猪皮胶原的热变性温度(37℃)低3-4℃。结果表明,草鱼鱼鳔胶原可能替代或作为补充陆生动物胶原广泛应用工业领域。研究了草鱼鱼鳔胶原海绵的制备工艺。通过研究胶原浓度、pH值、壳聚糖添加比例对胶原海绵的吸水性能和抗张强度的影响表明,胶原浓度在0.5%～3.0%内均匀薄膜,当胶原浓度为2%、pH值为6、胶原与壳聚糖的比例为6:4时,所制得胶原海绵的吸水性能和机械性能较好。

关键词：草鱼鱼鳔胶原性质胶原海绵

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组织工程学鱼鳔人工血管的应用研究

组织工程学鱼鳔人工血管的应用研究

作者：孙鹏郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的在血管外科转流术中,小于6毫米的人工血管的术后长期通畅率较低,有超过50%的膝下旁路术后病人在一年内即需要截肢。在半个多世纪以来广泛使用的涤纶和膨体聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管,其长期通畅性并不令人满意。由于自体血管... 详细信息

背景和目的在血管外科转流术中,小于6毫米的人工血管的术后长期通畅率较低,有超过50%的膝下旁路术后病人在一年内即需要截肢。在半个多世纪以来广泛使用的涤纶和膨体聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管,其长期通畅性并不令人满意。由于自体血管有较高的通畅率,因此其仍然是人工血管的首选。自体静脉虽然具有良好的长期通畅率,但临床中也存在问题,比如需要做搭桥手术的患者没有合适的自体静脉;或自体静脉和需要重建的血管之间的直径不匹配等问题。螺旋形或板片状静脉移植物可以解决管径不匹配的问题,但由于这种术式对施术者的吻合技术要求较高,所以在临床中并不常用。目前,已经开发出几种人工生物血管用于临床,包括冷冻异体人脐静脉人工血管和异体人工血管。异种组织可作为生物工程血管材料,有几种常用的来自猪或牛心包的异种脱细胞血管补片已经在临床中广泛应用。由于过去几十年生理学、细胞生物学和生物制造领域的快速发展,组织工程学进展迅速,从而使新的组织工程学人工血管不断涌现。脱细胞异体人工血管保留了细胞外基质,从而保证其结构的完整性。而且由于在脱细胞的过程中去除了细胞成分,因此免疫反应较少。从螃蟹和虾壳中提取的壳聚糖在临床中是一种应用广泛的、有研究前景的材料。据此我们推测,鱼的一些器官可以进行类似的加工,并制作成为临床中使用的人工血管材料。鱼鳔是鱼体内司升降沉浮的一种器官,主要由胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖组成。而且从鱼鳔中提取的胶原蛋白与哺乳动物胶原蛋白相似。每条700-800克的淡水鱼可以提供一个5-7厘米的鱼鳔,如能把鱼鳔制作成人工血管材料,将可变废为宝。方法1.鱼鳔脱细胞和表面涂层的处理:将鱼鳔在CHAPS缓冲液中处理12h,拿出清洗后再在十二烷基硫酸钠缓冲液(SDS)中处理24h,最后用PBS清洗以完全去除洗涤剂的方法使鱼鳔脱细胞。用PBS将脱细胞鱼鳔洗涤干净后,在鱼鳔表面涂覆透明质酸,将涂有透明质酸的样品浸入使用水溶性碳二亚胺溶液提前激活的雷帕霉素溶液(2mg/mL)中,并在37℃条件下孵育6h以达到对脱细胞鱼鳔表面进行雷帕霉素药物涂层。2.脱细胞鱼鳔作为补片状人工血管应用在大鼠腹主动脉和下腔静脉:将新鲜脱细胞的鱼鳔(对照组)和雷帕霉素药物涂层的鱼鳔都修剪成3×1mm的补片,均分别植入大鼠的腹主动脉和下腔静脉中,运用H&E,免疫组化,免疫荧光等方法来检测脱细胞鱼鳔是否能够应用于血管补片成形术中,且雷帕涂层能否对内膜增生产生抑制作用。3.脱细胞鱼鳔作为管状人工血管应用在大鼠腹主动脉和下腔静脉:将新鲜脱细胞的鱼鳔(对照组)和雷帕霉素药物涂层的鱼鳔都制作成直径合适的管状人工血管,均分别植入大鼠的腹主动脉和下腔静脉中,运用H&E,免疫组化,免疫荧光等方法来检测脱细胞鱼鳔是否能够应用于血管原位移植中以替代完整的动脉或静脉血管,且雷帕霉素涂层能否对内膜增生产生抑制作用。结果1.脱细胞的鱼鳔可以成功地涂上雷帕霉素而不失去其结构的完整性,并且适合在体内进行测试。扫描电子显微镜(SEM)显示,鱼鳔脱细胞前的表面光滑,而脱细胞后的表面粗糙;在进行雷帕霉素涂层后,表面又恢复光滑。水接触角(WCA)测量显示,在新鲜的鱼鳔中,WCA较小;脱细胞后,WCA变大,脱细胞的鱼鳔和雷帕霉素涂层的鱼鳔之间WCA没有明显差异。在新鲜、脱细胞和雷帕霉素涂层补片之间有相似的burst strength和suture retention,与脱细胞的大鼠胸主动脉(d-TA)相比,burst strength和suture retention有所增加。雷帕霉素涂层在体外的释放时间长达14天。2.雷帕霉素涂层能够抑制动脉和静脉中补片的新生内膜厚度。14天后,补片与动脉和静脉完全融合。无论在动脉还是静脉中,血管均通畅,并且也没有动脉瘤或其它的并发症出现。组织学染色显示,无论在动脉还是静脉中,和单纯脱细胞鱼鳔组相比,雷帕霉素涂层组补片的新生内膜和外膜厚度明显更薄,补片中的细胞数量更少。雷帕霉素涂层并没有抑制新生内膜的再内皮化。3.雷帕霉素涂层能够抑制动脉和静脉管状人工血管的新生内膜。14天后,所有的腹主动脉管状人工血管都是通畅的;对照组的三个下腔静脉管状人工血管都是闭塞的,而雷帕霉素涂层的下腔静脉管状人工血管都是通畅的。组织学染色显示,与对照组管状人工血管相比,腹主动脉和下腔静脉的雷帕霉素涂层管状人工血管腔表面的新生内膜明显更薄,人工血管中的细胞数量也明显减少。结论1.脱细胞鱼鳔既可以作为血管的补片,也可以作为管状人工血管,并且其能够支持内皮细胞在体内外的迁移和增殖。2.雷帕霉素涂层的脱细胞鱼鳔血管补片和管状人工血管可以有效的抑制内膜增生。3.脱细胞鱼鳔是一种有前途的基于胶原蛋白的人工血管材料,可进行表面涂层处理,具有潜在的临床应用可能性。

关键词：鱼鳔脱细胞透明质酸雷帕霉素补片管状人工血管

纳米氧化锌对斑马鱼鱼鳔发育毒性效应及其机理研究

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纳米氧化锌对斑马鱼鱼鳔发育毒性效应及其机理研究

作者：刘涛广东工业大学

学位级别：硕士

纳米氧化锌是近年来世界上使用最为广泛的人工纳米材料之一,然而其广泛的使用不可避免地增加了水环境中的生态风险。随着纳米氧化锌在水环境中的累积,对其产生生物性安全风险和毒性机制进行研究是非常必要的。本研究以斑马鱼胚胎作为受... 详细信息

纳米氧化锌是近年来世界上使用最为广泛的人工纳米材料之一,然而其广泛的使用不可避免地增加了水环境中的生态风险。随着纳米氧化锌在水环境中的累积,对其产生生物性安全风险和毒性机制进行研究是非常必要的。本研究以斑马鱼胚胎作为受试生物,以纳米氧化锌为研究对象,研究不同浓度的纳米氧化锌对斑马鱼的毒性效应和鱼鳔生长发育的影响。根据纳米氧化锌的Zn析出浓度设置了相应浓度的实验组。本研究还根据鱼鳔生长发育的5个不同阶段,从受精后0小时(0 hours post fertilization,0 hpf)开始对5个发育阶段(0 hpf～孵化前、0～120 hpf、0～168 hpf、孵化后～120 hpf、120～168 hpf)的斑马鱼进行纳米氧化锌暴露实验。此外,本研究还利用QPCR等分子生物学技术探讨了纳米氧化锌的毒性作用机理。本研究得出以下主要结论:(1)纳米氧化锌悬浮液的稳定性极差,随着浓度升高,其沉降率会增大,Zeta电位绝对值会降低。(2)纳米氧化锌可以引起168 hpf斑马鱼出现鱼鳔缺损和脊椎弯曲等畸形特征,并在高浓度下对斑马鱼造成较高的死亡率,然而纳米氧化锌悬浮液中溶解的Zn不是导致斑马鱼鱼鳔缺损、脊椎弯曲和死亡的唯一或主要原因。(3)纳米氧化锌的浓度越高,斑马鱼鱼鳔缺损率、脊椎弯曲率和死亡率越高,存在剂量-效应关系。15 mg/L纳米氧化锌可引起90%的斑马鱼出现鱼鳔缺损、脊椎弯曲和死亡,10 mg/L纳米氧化锌可导致部分斑马鱼鱼鳔面积缩小70%。(4)阶段性暴露实验结果表明斑马鱼鱼鳔早期发育阶段(0～168 hpf)对于纳米氧化锌敏感度大小为:出芽阶段(0 hpf～孵化前)>充气阶段(孵化后～120 hpf)>充气完成阶段(120～168 hpf)。斑马鱼鱼鳔的发育面积和发育时间,还有斑马鱼的体长也受纳米氧化锌的影响而发生变化。(5)QPCR的结果显示,纳米氧化锌暴露作用下,72 hpf斑马鱼的骨骼发育相关基因Bone Morphogenetic protein-2(bmp-2)、Bone Morphogenetic protein-4(bmp-4)和鱼鳔发育相关基因Sonic Hedgehog(shha)、Indian Hedgehog(ihha)的m RNA的转录水平均出现下降,纳米氧化锌可以抑制bmp-2、bmp-4的表达从而导致斑马鱼骨骼发育的缺失,纳米氧化锌打断了Hh信号通路,抑制了ihha、shha的表达,导致了鱼鳔上皮、间质层的缺失和外间皮组织的破坏。(6)斑马鱼死亡率和鱼鳔缺损率(鱼鳔发育)之间存在相关性(r=0.978,p鱼鳔发育相关基因的表达有极大可能是造成斑马鱼胚胎死亡的主要原因之一,但纳米氧化锌对斑马鱼鱼鳔是否造成了物理损伤,尤其是对鱼鳔出芽阶段和充气阶段的致毒机理需要进一步研究。

关键词：纳米氧化锌斑马鱼鱼鳔基因表达毒性效应