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乳铁蛋白—香菇多糖复合物抑制胰岛β细胞损伤作用与分子机制研究

乳铁蛋白—香菇多糖复合物抑制胰岛β细胞损伤作用与分子机制研究

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作者：刘承英辽宁大学

学位级别：硕士

Ⅱ型糖尿病的主要发病之一是胰岛β细胞损伤,利用天然活性分子抑制细胞损伤作用是保护胰岛β细胞的有效途径。牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin,BLF)具有抗炎、抗氧化、降糖等多种生物活性,具有潜在的胰岛β细胞保护作用,但其对生理环境... 详细信息

Ⅱ型糖尿病的主要发病之一是胰岛β细胞损伤,利用天然活性分子抑制细胞损伤作用是保护胰岛β细胞的有效途径。牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin,BLF)具有抗炎、抗氧化、降糖等多种生物活性,具有潜在的胰岛β细胞保护作用,但其对生理环境中理化性质的变化较为敏感,在体内生物利用度较低。香菇菌丝体多糖(Lentinus edodes mycelia polysaccharide,LMP)是一种本实验室前期鉴定的具有抗氧化作用的活性多糖,可以用来保持蛋白质分子的稳定性。因此,本研究利用实验室提供的牛乳铁蛋白和香菇菌丝体多糖制备乳铁蛋白-香菇多糖复合物。通过多光谱学对乳铁蛋白-香菇多糖复合物的相互作用机理进行探索。通过检测复合物对过氧化氢(hydrogen peroxide,HO)/高糖诱导的细胞损伤的抑制作用及抑制机制,为其在抑制胰岛β细胞损伤中的应用提供理论依据。为了研究乳铁蛋白-香菇多糖复合物的形成机理,利用荧光光谱实验探究香菇多糖对乳铁蛋白的猝灭机制,并根据热力学结果计算其相互作用的作用力类型。采用紫外光谱(Ultraviolet spectroscopy,UV-Vis)、三维荧光光谱(Three-dimensional fluorescence spectroscopy,3D spectra)、同步荧光光谱、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)和圆二色光谱(Circular dichroism spectroscopy,CD spectra)探究香菇多糖与乳铁蛋白的相互作用机理。然后通过体外消化模拟实验探究香菇多糖的加入是否有效抑制乳铁蛋白在胃部生理环境下的降解。为探索乳铁蛋白-香菇多糖复合物对胰岛β细胞的保护作用,本研究选用小鼠胰岛β(MIN6)细胞作为研究对象,通过噻唑蓝溴化四氮唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)比色法,确定乳铁蛋白和香菇多糖的安全浓度范围,选取适宜的HO和高糖损伤浓度,同时,检测复合物对HO/高糖诱导的细胞损伤的影响。活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平检测乳铁蛋白-香菇多糖复合物对HO/高糖暴露下细胞氧化应激水平的影响;Hoechst 33258染色实验检测复合物对细胞凋亡的影响。通过Western Blot法检测乳铁蛋白-香菇多糖复合物对HO/高糖诱导的氧化应激信号通路、炎症信号通路、细胞凋亡信号通路及细胞焦亡信号通路的影响。结果表明香菇多糖能够猝灭乳铁蛋白的内源性荧光(静态猝灭),两者通过静电作用力自发结合。同步荧光光谱和3D光谱显示,香菇多糖加入会改变乳铁蛋白氨基酸残基的微环境。FT-IR的结果表明,香菇多糖与乳铁蛋白结合后,蛋白质二级结构发生改变。体外消化模拟实验结果表明,香菇多糖的加入有效抑制了乳铁蛋白在胃部生理环境下的降解。生物学实验表明一定浓度的HO(400μM)和高糖(40 m M)能够降低细胞活力,诱导细胞凋亡。乳铁蛋白-香菇多糖复合物(0.0125、0.025和0.05 m M)能够有效提高细胞的存活率,且两者间存在剂量效应。相比于单体,乳铁蛋白-香菇多糖复合物更显著的抑制细胞凋亡。HO/高糖作用下,细胞内ROS水平上升,细胞内氧化应激水平上升。随着乳铁蛋白-香菇多糖复合物的加入,ROS含量降低,说明复合物能够有效抑制HO/高糖诱导的细胞氧化应激水平。Western Blot结果表明,复合物能显著抑制由HO/高糖诱导的Bax/Bcl-2比值上调,MAPK信号通路的激活,NF-κB的核转移以及NLRP3信号通路的激活。以上研究结果证明,乳铁蛋白-香菇多糖复合物能够有效抑制由氧化应激和炎症引起的MIN6细胞凋亡及细胞焦亡。综上所述,香菇多糖可以与乳铁蛋白相互作用形成复合物,并抑制乳铁蛋白的降解。乳铁蛋白-香菇多糖复合物通过调控氧化应激以及炎症信号通路缓解HO/高糖诱导的细胞凋亡和细胞焦亡。本研究阐明了乳铁蛋白-香菇多糖复合物相互作用机理,证明了乳铁蛋白-香菇多糖复合物抑制胰岛β细胞氧化应激和炎症的生物活性,为蛋白质-多糖复合物在抑制胰岛β细胞损伤中的应用提供了新的思路。

关键词：乳铁蛋白-香菇多糖复合物胰岛β细胞氧化应激炎症高糖损伤

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基于细胞代谢组学的降糖活性评价方法的建立及应用

基于细胞代谢组学的降糖活性评价方法的建立及应用

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作者：陈文雅兰州大学

学位级别：硕士

目的运用细胞代谢组学和模式识别方法,得到高糖诱导胰岛β细胞损伤状态下的生物标志物,建立基于细胞代谢组学的降糖活性物质评价方法,并将该方法应用于生物活性物质的降糖活性评价。方法1.高糖诱导胰岛β细胞损伤生物标志物的发现。选... 详细信息

目的运用细胞代谢组学和模式识别方法,得到高糖诱导胰岛β细胞损伤状态下的生物标志物,建立基于细胞代谢组学的降糖活性物质评价方法,并将该方法应用于生物活性物质的降糖活性评价。方法1.高糖诱导胰岛β细胞损伤生物标志物的发现。选用大鼠胰岛瘤(INS-1)细胞进行实验,通过MTT法筛选葡萄糖损伤浓度,建立高糖诱导的胰岛β细胞损伤模型,并用胰岛素分泌实验和活性氧(Reacive Oxygen Species,ROS)实验对模型进行验证。设立对照组和高糖损伤组,收集细胞代谢物,GC/MS和LC/MS分析后采用PCA和OPLS-DA模式识别方法分析数据,获取与高糖损伤相关的生物标志物,经质谱数据库和标准品确认生物标志物,进行生物标志物代谢通路分析。2.基于细胞代谢组学的降糖活性物质评价方法的建立及应用。通过MTT法考察标准物质(Met-HCl和Gld)和样品对INS-1细胞活力的影响。设立Met-HCl+高糖组和Gld+高糖组,收集细胞代谢物进行LC/MS分析。筛选Met-HCl具有调节作用的生物标志物,以筛选得到的生物标志物为变量,建立对照组与高糖组的OPLS-DA预测模型,分析Met-HCl+高糖组的得分散点分布并预测Y值,获得Met-HCl+高糖组降糖活性的定性及定量结果,建立Met-HCl浓度与Y预测值(YPred)的回归方程YPred-Ⅰ,把1μM Met-HCl的降糖活性作用定义为一个活性单位,进行拟合方程的逆运算,得到降糖活性值计算方程HA-Ⅰ。筛选Gld具有调节作用的生物标志物,得到降糖活性物质活性值计算方程HA-Ⅱ;设立样品+高糖组,收集代谢物进行LC/MS分析,分析样品+高糖组的得分散点分布并预测Y值,并应用方法评价样品的降糖活性。结果1.高糖诱导INS-1细胞损伤生物标志物的发现。(1)MTT结果发现,随着葡萄糖浓度的增加,细胞活力逐渐降低,33.3 m M葡萄糖组的细胞活力为88.09%±0.86%,因此,选择33.3 m M构建高糖诱导胰岛β细胞损伤模型。高糖组细胞内ROS水平明显上升且胰岛素分泌量增加,表明模型构建成功。(2)发现的差异变量经质谱数据库和标准品确认,最终得到39个与高糖诱导胰岛细胞损伤相关的生物标志物,扰动氨基酸、谷胱甘肽、柠檬酸等代谢通路。2.基于细胞代谢组学的降糖活性评价方法的建立与应用。(1)Met-HCl和Gld在0～40μM间对INS-1细胞活力无显著性影响;油橄榄叶提取物和鱼籽多肽浓度在0～400μg/m L间显著增加细胞活力,油橄榄果渣乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物浓度在0～400μg/m L间对细胞活力无显著性影响。为了便于样品间降糖活性值的比较,各提取物浓度保持一致,选取200μg/m L样品进行活性评价。(2)以Met-HCl具有调节作用的19个生物标志物为变量,建立对照组与高糖组的OPLS-DA预测模型,得到不同浓度Met-HCl组YPred,将Met-HCl浓度作为横坐标,YPred作为纵坐标进行二次拟合,拟合方程为YPred-Ⅰ=-1.5×10X+0.0692X+0.1059(0高糖组的OPLS-DA预测模型,得到不同浓度Gld组YPred,将Gld浓度作为横坐标,YPred作为纵坐标进行二次拟合,拟合方程为YPred-Ⅱ=-7×10X+0.0474X+0.1645(0高糖损伤条件下的生物标志物和13条与高糖损伤相关的代谢通路,筛选标准物质具有调节作用的生物标志物,建立了两种高通量的体外降糖活性评价方法,该评价方法拟合度和预测度均较高、灵敏度更高、可控性更强,弥补了现有体外降糖活性评价方法的不足。通过建立的新方法,对油橄榄叶的降糖活性成分进行跟踪筛选,进而阐明了油橄榄叶降糖活性的物质基础。

关键词：细胞代谢组学降糖活性评价高糖损伤 INS-1

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丹参—葛根对药改善糖尿病大鼠主动脉病变之作用与机制研究

丹参—葛根对药改善糖尿病大鼠主动脉病变之作用与机制研究

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作者：袁媛遵义医学院

学位级别：硕士

第一部分丹参-葛根对药改善糖尿病大鼠主动脉病变的作用与机制研究目的:探讨中药丹参-葛根对药水提物(DG)对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型主动脉病变的作用及其可能的作用机制。方法:丹参、葛根按1∶1重量比采用... 详细信息

第一部分丹参-葛根对药改善糖尿病大鼠主动脉病变的作用与机制研究目的:探讨中药丹参-葛根对药水提物(DG)对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型主动脉病变的作用及其可能的作用机制。方法:丹参、葛根按1∶1重量比采用水提法制备DG。SD大鼠腹腔注射STZ(50 mg/kg/day),连续两天,制备糖尿病大鼠模型。以STZ注射72 h后空腹血糖值≥11.1 mmol/L者视为糖尿病模型大鼠。实验大鼠随机分为四组:对照组、模型组、DG低剂量组(50 mg/kg),DG高剂量组(200 mg/kg)。对照组及模型组灌胃给予等体积生理盐水,每天一次,连续5～6周。每周测一次血糖和体重。制备离体主动脉环,测定动脉环对乙酰胆碱(Ach)的舒张反应;测定血浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase,SOD)、胰岛素(insulin,INS)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、细胞间粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)水平;HE染色法观察主动脉的病理学变化;免疫印迹方法检测主动脉中ICAM-1、VCAM-1、NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 2,NOX4)、蛋白激酶C-β(protein kinase C-β,PKC-β)蛋白的表达。结果:结果显示,大鼠连续2次给予STZ后,血糖明显升高,均值达到13.99 mmol/L,体重明显下降。DG给药5-6周后,两个剂量DG对空腹血糖均无影响,但能显著降低糖尿病大鼠血浆INS、NO、H2O2、MDA、ICAM-1和VCAM-1的水平,增加糖尿病大鼠血浆SOD水平。模型组胸主动脉环对Ach的舒张作用明显强于对照组(P高糖诱导人脐静脉内皮细胞粘附分子表达的作用及机制研究目的:本研究以体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为工具,探讨丹参-葛根对药水提物(DG)抑制高糖诱导HUVECs粘附分子表达的作用及其可能机制。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,给予不同浓度DG处理24h,显微镜观察形态学变化;MTT法测定DG对内皮细胞的毒性作用。细胞分为5组,分别为对照组(Con)(5.5 mmol/L葡萄糖)、模型组(Mod)(30 mmol/L葡萄糖)、DG低剂量组(DG-L)(DG 10μg/m L+30 mmol/L葡萄糖)、DG中剂量组(DG-M)(DG 25μg/m L+30 mmol/L葡萄糖)、DG高剂量组(DG-H)(DG 50μg/m L+30 mmol/L葡萄糖)。共同作用12 h后,荧光探针DCFH2-DA检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成。DAPI荧光标记的THP-1单核细胞,与内皮细胞共培养30 min后,用荧光显微镜观察DG对高糖诱导的单核-内皮粘附作用的影响。Western blot法检测ICAM-1、VCAM-1、NOX2、NOX4和PKC-β蛋白的表达。结果:DG处理内皮细胞后,形态无明显改变;MTT结果显示,DG处理内皮后轻度促进内皮细胞增殖;高糖诱导内皮细胞内ROS生成,这可被乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)所抑制,DG显著抑制高糖诱导内皮细胞的ROS生成;DG显著抑制高糖诱导的单核-内皮粘附作用。Western blot结果显示,高糖显著诱导内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、NOX2、NOX4和PKC-β蛋白的表达,DG可显著逆转高糖诱导的ICAM-1、VCAM-1、NOX2、NOX4和PKC-β蛋白的表达。结论:DG轻度促进内皮细胞增殖,显著抑制高糖诱导内皮细胞粘附损伤。其机制可能与抑制PKC-β激活,从而抑制NOX 2、

关键词：丹参-葛根对药糖尿病主动脉高糖损伤内皮细胞粘附分子

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