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中国预防兽医学报 2010年第1期32卷 9-13页

作者：刘爱玲刘长军张艳萍闫福海张锋中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

针对马立克病毒(MDV)毒力逐渐上升的现状,本研究对国内MDV流行强毒株进行了致弱研究。本实验采用近年来从东北、四川2地区免疫发病鸡场中分离的4株MDV流行强毒株(L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY),经噬斑纯化后,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养... 详细信息

针对马立克病毒(MDV)毒力逐渐上升的现状,本研究对国内MDV流行强毒株进行了致弱研究。本实验采用近年来从东北、四川2地区免疫发病鸡场中分离的4株MDV流行强毒株(L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY),经噬斑纯化后,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养至75代～85代,获得了4株高代次细胞毒株(L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C)。并分析了L-SYp85C和L-MSp75C毒株的体外、体内生长特性和对SPF鸡的致病力。结果表明,L-SYp85C和L-MSp75C株在CEF适应性显著提高;以10倍感染剂量感染的SPF鸡,在12周内均未发生MD肿瘤,体重平均值与对照组体重平均值差异不显著;检测7d～45d羽髓中病毒载量,均低于106copies/106cell,显著低于亲本毒株。同时,4株传代毒株132bpr基因拷贝数显著增加。上述结果为MDV强毒株的致弱研究以及进一步筛选MDV弱毒疫苗株提供了实验依据。

关键词：马立克病毒鸡胚成纤维细胞高代次细胞毒株病毒载量增殖能力

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马立克病毒流行毒株致弱及主要致瘤相关基因变异分析

马立克病毒流行毒株致弱及主要致瘤相关基因变异分析

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作者：刘爱玲中国农业科学院

学位级别：硕士

马立克氏病(Marek's Disease,MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴细胞增生性疾病。其致病因子为血清1型的马立克氏病毒(Marek's Disease Virus,MDV)。MD的控制以疫苗免疫为主。近年来由于MDV毒力的增强,疫苗免疫失败的现象越来越多,因此,新... 详细信息

马立克氏病(Marek's Disease,MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴细胞增生性疾病。其致病因子为血清1型的马立克氏病毒(Marek's Disease Virus,MDV)。MD的控制以疫苗免疫为主。近年来由于MDV毒力的增强,疫苗免疫失败的现象越来越多,因此,新型有效的MD疫苗的研究成为重点。传代致弱获得新型MD疫苗仍是一种重要方法,传代过程中MDV基因组中一些基因片段的改变与病毒毒力变化存在一定关系,这些基因的变异研究有助于毒株的毒力分析及疫苗株的筛选。本研究选用国内2006-2007年从东北、四川两地区免疫发病鸡群中分离的4株MDV流行强毒株,分别命名为L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY,经克隆纯化后,在鸡胚成纤维细胞(Chicken EmbryoFibroblast,CEF)传代培养至75-85代,获得了4株MDV高代次细胞毒株,即L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C。在此基础上,研究了L-SYp85C、L-MSp75C毒株的体外生长特性、对SPF鸡的致病性和在羽髓中病毒载量的动态变化规律。同时对4株高代次细胞毒株的Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因进行了变异分析。意在研究传代致弱对强毒株生物学特性及基因变异特性的影响,为新型而有效MD疫苗的研究提供理论依据。研究结果表明:1.L-SYp85C、L-MSp75C毒株在CEF上的适应性明显提升,表现为细胞病变面积增大,细胞之间有融合现象,细胞病变的形成时间缩短。L-SYp85C和L-MSp75C毒株以亲本毒株10倍剂量感染SPF鸡,感染12周后,无肿瘤形成;体重均值与对照组比较分析,差异不显著;AGP试验检测感染鸡只羽髓中抗原,结果均为阴性;TaqMan探针双重荧光定量PCR(fluorescentquantitative polymerase-chain reaction,FQ-PCR)方法检测感染鸡只羽髓中病毒载量均低于10～6 copies/10～6 cell,显著低于亲本毒株感染鸡羽髓中的病毒载量。说明这两个毒株经传代培养后毒株毒力已经弱化。2.4个高代次细胞毒株的Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因等与毒株毒力相关基因序列的变异分析发现,L-CZp75C株Meq基因第625位有碱基C插入突变,使Meq基因在内的3个重叠基因(Meq、RLORF6和23KD)发生移码突变;L-ZYp75C株Meq基因第529位存在碱基C插入,且602位缺失碱基T,从而使Meq基因推导的氨基酸在177-200位发生移码突变;L-SYp85C株RLORF4基因215-265位存在51bp缺失,其推导氨基酸缺失17个;RLORF12基因序列分析发现,L-MSp75C株第67位有碱基T缺失和814疫苗株18-86位69个碱基的缺失,缺失位置位于复制原点(Origin of replication,Ori)内,而L-ZYp75C毒株在ORF的168-174位具有独特的“TGTTGGG”缺失;4个细胞高代次毒株132bpr的扩增结果表明,其在基因组中的拷贝数明显增加,可达到10个拷贝以上。研究表明,4株MDV流行强毒株经传代培养后,Meq、RLORF4、RLORF12和132bpr基因发生了不同程度的缺失或插入突变。本实验传代获得了4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株,对其弱化特性及与弱化相关的基因片段进行了系统研究,为MDV1的致病机制、流行变异、诊断和MD新疫苗的研制和筛选提供了实验和理论依据。

关键词：马立克病毒高代次细胞毒株 Meq RLORF4 RLORF12 132bpr 变异分析

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