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作者：罗雪丹中国医科大学

学位级别：硕士

前言阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)亦名老年性痴呆(seniledementia),是中枢神经系统一种常见的进行性神经退行性疾病.主要病理特征是在大脑皮层和海马区域出现老年斑、神经原纤维缠结和血管壁淀粉样变并伴随神经元丧失,而Aβ... 详细信息

前言阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)亦名老年性痴呆(seniledementia),是中枢神经系统一种常见的进行性神经退行性疾病.主要病理特征是在大脑皮层和海马区域出现老年斑、神经原纤维缠结和血管壁淀粉样变并伴随神经元丧失,而Aβ是AD脑内异常释放与沉积的蛋白质性物质,在神经元的凋亡过程中发挥了重要作用,细胞凋亡活动过盛可能是AD渐进性神经退变的重要原因之一。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)或称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有干细胞特性,有多向分化的潜能,同时MSCs取材容易,在体外容易培养和增殖,又避免了神经干细胞移植的免疫排斥反应,骨髓间质干细胞在体内外都可向神经系统分化,弥补了神经干细胞来源困难的问题因而骨髓间质干细胞作为神经细胞的另一来源,用于中枢神经系统疾病及其损伤修复的细胞学治疗基础,具有更广阔的应用前景,并成为生命科学的一个新的研究热点。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞,其所含的受体及递质与胆碱能神经元相似,能与原代培养的神经细胞说明一致的问题,所以Aβ制备的PC12细胞模型常作为研究AD的细胞模型。胆碱能神经元的保护作用考虑与其能分泌的细胞因子有关。本实验采用体外培养、纯化MSCs并收集其条件培养液,通过评价MSCs分泌物对Aβ诱导的PC12细胞活力和凋亡的影响,初步探讨MSCs分泌物对Aβ诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。实验方法 1、原代骨髓基质细胞培养液的收集和浓缩 2、BMSCs细胞表面分子测定(流式细胞仪检测) 3、PC12细胞培养和药物处理实验分组为:①正常PC12细胞培养组(空白对照组):在细胞培养体系中不加入任何药物和上清液;②MSCs上清液组:细胞接种后24h在细胞培养体系中加入MSCs上清液30μl、60μl、120μl,并用5%FBS/RPMll64O将终体积补足至300ul,使MSCS上清液体积分数分别为10%、20%、40%。③Aβ损伤组:以10μg/ml Aβ刺激PC12细胞,终浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml;换用1640培养24小时后,收集受损PC12上清培养液;④MSCs上清液与Aβ共培养组(联合组):以10μg/ml Aβ刺激PC12细胞过夜(AD细胞模型),除去培养上清,换用1640培养24小时后,收集受损PC12上清作为条件培养液,分别给予MSCs上清液30μl,60μl,120μl各组细胞给药后24h和48h进行下列指标的检测。 4、细胞活力测定(M T T法) 5、透射电镜观察PC12细胞凋 6、PI染色流式细胞仪(FCM)检测PC12细胞凋亡 7、MSCs上清液对Aβ损伤PC12细胞凋亡的影响 8、统计学处理:采用SPSS 11·5 for Windows软件进行检验。所有资料以X±SD表示,两组间比较用t检验,P＜0.05为有统计学差异,P＜0.01认为具有显著性差异。结果 1、MSCs可在体外分离扩增,MSCs表面抗原鉴定通过免疫荧光检测显示CD44阳性而CD45阴性 2、MSCs上清液可以抵抗Aβ刺激PC12细胞的细胞毒作用,提高细胞生存率 (1)Aβ能降低PC12细胞活力并且PC12细胞活力的变化与Aβ浓度和时间有关。Aβ浓度越大,对细胞的毒性作用越大。处在同一浓度的Aβ中的PC12细胞作用时间越长,损害越多。 (2)MSCs上清液加Aβ处理组表明MSCs上清液可以有效保护Aβ对PC12细胞的毒性损伤,并且浓度越高MSCs上清液的保护作用越好。且相邻剂量间比较有显著性差异(P＜0.05);3、透射电镜能观察到Aβ所致PC12细胞凋亡 4、MSCs上清液可以减轻Aβ诱导的PC12细胞凋亡从而对细胞产生保护作用 (1)不同浓度Aβ对PC12细胞凋亡的影响为浓度越高细胞的凋亡率越增加;(2)MSCs上清液对Aβ诱导PC12细胞凋亡的影响结果提示MSCs上清液可明显减轻Aβ对PC12细胞的凋亡诱导作用;随着MSCs上清液浓度的增加,其减轻Aβ对PC12细胞的凋亡作用在增加。结论 MSCs可在体外分离扩增,MSCs能分泌多种对退变胆碱能神经元有保护作用的神经营养因子,Aβ能诱导PC12细胞凋亡,MSCs对Aβ诱导的PC12细胞凋亡有保护作用,这种保护作用的强弱与其上清液浓度有关。因此本研究为MSCs治疗老年性痴呆提供了一定的实验基础。

关键词：骨髓间质干细胞 Aβ1-40 凋亡 PC12细胞阿尔茨海默病神经细胞因子胆碱能神经元

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骨髓间质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙在脊柱融合中的应用研究

骨髓间质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙在脊柱融合中的应用研究

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作者：王健苏州大学

学位级别：硕士

干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞由于伦理、宗教、道德等方面的原因,其研究应用受到诸多限制。近年来成体干细胞成为研究和关注的重点。骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs... 详细信息

干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞由于伦理、宗教、道德等方面的原因,其研究应用受到诸多限制。近年来成体干细胞成为研究和关注的重点。骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源较广,容易获得,具备向多种中胚层及神经外胚层来源的组织细胞分化能力,包括向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、胰岛细胞、肌肉、韧带、骨髓基质甚至肝细胞、神经细胞等多种细胞与组织分化,是目前组织工程主要的细胞来源。羟基磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP)是目前应用较为广泛的支架材料。本实验应用BMSCs作为种子细胞,与HA/TCP复合后应用于脊柱融合,为脊柱融合的临床应用提供新的依据和技术方法。第一部分骨髓间质干细胞—支架材料复合体的体外实验研究目的建立体外分离培养BMSCs的方法,观察BMSCs的形态和掌握其生长规律,检测BMSCs与HA/TCP的生物相容性。方法(1)抽取兔的长骨骨髓,利用全骨髓培养法培养兔的骨髓间质干细胞,分别进行原代和传代培养,观察各代细胞生长特性和生长曲线,探讨BMSCs作为种子细胞的可行性。(2)通过细胞的多向分化能力鉴定BMSCs。(3)对体外培养的兔BMSCs和HA/TCP复合材料进行形态学观察,采用倒置显微镜、荧光显微镜和扫描电镜检测,以及细胞增殖的测定。结果(1)用全骨髓培养法分离骨髓间质干细胞是可行的,获得的BMSCs体外培养显示,兔BMSCs体外培养稳定,增殖速度快,扩增能力强。(2)培养扩增的BMSCs能分别诱导成成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。(3)BMSCs和HA/TCP有很好的生物相容性,经扫描电镜、荧光显微镜观察BMSCs在HA/TCP上粘附良好,并大量增殖。HA/TCP对BMSCs的体外增殖无明显抑制作用。结论骨髓间质干细胞可作为骨组织工程的种子细胞。羟基磷灰石/磷酸三钙是良好的骨组织工程的载体材料,利于种子细胞的粘附生长。第二部分富集自体骨髓间质干细胞复合HA/TCP脊柱融合术中的临床应用目的探索以自体骨髓富集的BMSCs复合HA/TCP作为植骨材料进行脊柱融合的新方法。方法(1)观察对象:选择2005年1月至2006年2月建湖县人民医院骨科收治的胸腰椎骨折、均采用后路椎弓根钉系统复位及固定患者48例。(2)根据植骨融合材料不同随机分为2组:骨髓间质干细胞+复合材料组24例,男13例,女11例,年龄25～49岁;自体髂骨移植组24例,男15例,女9例,年龄26～50岁。(3)实验干预:采集自体骨髓通过密度梯度离心得到富集的BMSCs悬液与HA/TCP复合2h后作为植骨材料。骨髓间质干细胞+复合材料组采用BMSCs复合HA/TCP移植;自体髂骨移植组采用患者自体髂骨移植。(4)实验评估:对所有患者脊柱融合情况、临床疗效、伤椎复位后高度丢失等进行比较分析,评定脊柱融合效果。结果术后随访12个月,48例患者全部进入结果分析。(1)骨髓富集的有效性:富集前后骨髓间质细胞浓度达到8倍。(2)临床疗效:骨髓间质干细胞+复合材料组所有病例取髓处疼痛术后1周消失,均未发生感染。自体髂骨移植组术后3个月取骨处仍有疼痛。所有病例无感染和内固定松动断裂等并发症。两组术后12个月LBOS评分优良率骨髓间质干细胞+复合材料组为71%(17/24),自体髂骨移植组为79%(19/24)。(3)脊柱融合情况:术后随访6个月以上的患者X射线、CT检查均示有良好的脊柱融合,两组在术后3个月移植物密度降低并可见双侧薄层融合块,术后6个月双侧可见整块新生骨或单侧大块新生骨。按Lenke字母分级法融合分级,两组均无C、D级融合。(4)Cobb角测量结果:伤椎复位后高度丢失在骨髓间质干细胞+复合材料组平均为2.38°,在自体髂骨移植组平均为2.42°。结论通过自体骨髓富集的间质干细胞复合羟基磷灰石磷酸三钙应用于胸腰椎骨折后外侧融合可取得与自体髂骨移植同等的临床疗效,是一种安全可靠,简便有效的植骨替代材料。

关键词：脊柱融合术骨髓间质干细胞羟基磷灰石类磷酸钙类骨组织工程

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骨髓间质干细胞在股骨头缺血性坏死修复中的研究及应用进展

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中国矫形外科杂志 2008年第13期16卷 1006-1008页

作者：田少奇孙康青岛大学医学院附属医院关节外科青岛266003

股骨头缺血性坏死(avaacular necrosis of the femoral head, ANFH)为进展性的髋关节病变,严重影响了患者的生活质量.目前临床上多采用手术治疗,但手术创伤大、费用高,常造成治疗的障碍,因此新型、有效、微创的治疗方法是今后的趋势.

关键词：股骨头缺血性坏死骨髓间质干细胞坏死修复多向分化潜能手术治疗髋关节病变 cells 生活质量

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骨髓间质干细胞的分离培养、生物学特性及应用

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黑龙江畜牧兽医 2007年第11期 25-26页

作者：陈莉娜王颖张艳艳关伟军中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100094 山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

骨髓间质干细胞（Marrow stromal cells，MSCs）来源于中胚层间质，形成于发育中的骨髓腔，是骨髓内除造血干细胞（hematopoieti stem cells，HSCs）之外的另一类干细胞。于1968年由Friedenstein首次从骨髓中分离出来，称为成纤维集落... 详细信息

骨髓间质干细胞（Marrow stromal cells，MSCs）来源于中胚层间质，形成于发育中的骨髓腔，是骨髓内除造血干细胞（hematopoieti stem cells，HSCs）之外的另一类干细胞。于1968年由Friedenstein首次从骨髓中分离出来，称为成纤维集落生成细胞（Colony-forming units-fibroblastic，CFUF），能分化为类似骨和软骨聚集物样集落。目前，人、猪、大鼠、小鼠、兔和狗等动物的MSCs已被成功地分离培养。

关键词：骨髓间质干细胞分离培养生物学特性应用造血干细胞生成细胞 MSCs

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骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

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郑州大学学报（医学版） 2006年第1期41卷 119-121页

作者：贾敏曾秋棠王永奎韩雪飞刘瑞敏魏经汉华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科武汉430022 郑州大学基础医学院郑州450052 郑州大学第一附属医院心内科郑州450052

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料。方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达... 详细信息

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料。方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达。结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达。结论:MSCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞。

关键词：骨髓间质干细胞培养转化心肌细胞

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骨髓间质干细胞对血管性痴呆大鼠长时程增强的影响

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中国临床康复 2003年第16期7卷 2268-2269页

作者：高唱王景周陈曼娥解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经内科重庆市400042

目的采用神经电生理方法观察静脉注射骨髓间质干细胞(marrowstromalcell,MSC)对血管性痴呆(vasculardementia,VD)大鼠脑长时程增强(long-termpotentiation,LTP)的影响。方法体外分离培养、扩增成年大鼠MSC。利用结扎双侧颈总动脉方法制... 详细信息

目的采用神经电生理方法观察静脉注射骨髓间质干细胞(marrowstromalcell,MSC)对血管性痴呆(vasculardementia,VD)大鼠脑长时程增强(long-termpotentiation,LTP)的影响。方法体外分离培养、扩增成年大鼠MSC。利用结扎双侧颈总动脉方法制备慢性前脑缺血动物模型,检测注射MSC后30,60d海马齿状回LTP变化。结果造模30和60d后,VD大鼠LTP诱导率(25%,38%)、群体电位(PS)平均振幅犤(0.91±0.13),(1.02±0.11)mV犦与正常对照组犤88%,(1.31±0.12),(1.36±0.14)mV犦相比差异有显著性意义(χ2=4.2～16.25,P<0.01)。静脉注射MSC后30和60d,VD大鼠LTP诱导率(50%,63%)、LTP振幅犤(1.21±0.11),(1.32±0.18)mV犦较模型组有显著改善(P<0.01)。高频刺激后60min时各组间产生LTP的PS潜伏期分别为:正常组(4.8±1.0)ms,模型组(5.2±1.3)ms,MSC组(4.9±1.8)ms。模型组的潜伏期较正常组显著延长(P<0.05),MSC组潜伏期较模型组缩短(P<0.05)。结论静脉注射MSC可显著易化VD大鼠海马齿状回LTP。

关键词：骨髓间质干细胞血管性痴呆大鼠长时程增强动物模型神经电生理慢性脑缺血

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骨髓间质干细胞贴壁筛选法的提纯

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中风与神经疾病杂志 2014年第3期31卷 200-202页

作者：任瑞芳黄良国黄名璐蒋国红白洁遵义医学院附属医院神经内科贵州遵义563000

目的体外分离贴壁筛选大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymaIstemcells，MSCs），并对MSCs的表面标志进行测定。方法分离4周龄的大鼠股骨、胫骨骨髓进行体外贴壁培养、筛选，取第1～10代的MSCs观察形态，并用流式细胞仪检测其表面标志。结果... 详细信息

目的体外分离贴壁筛选大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymaIstemcells，MSCs），并对MSCs的表面标志进行测定。方法分离4周龄的大鼠股骨、胫骨骨髓进行体外贴壁培养、筛选，取第1～10代的MSCs观察形态，并用流式细胞仪检测其表面标志。结果大鼠MSCs细胞形态呈长梭形，培养筛选至第3—6代时流式细胞术检测：CD29、CD90阳性率均在90％以上，CIM5阳性率在10％以下。结论本方法分离纯化出的是MSCs，第3～6代时纯度最高。

关键词：骨髓间质干细胞贴壁筛选流式细胞术

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骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

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神经解剖学杂志 2005年第3期21卷 295-298页

作者：王桂房何慧华冷水龙董晓先广州医学院病理生理学教研室广州510182 广州医学院解剖学教研室广州510182

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志... 详细信息

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。

关键词：骨髓间质干细胞定向分化神经元样细胞脑心舒神经系统退行性疾病

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骨髓间质干细胞体外转化为心肌细胞的实验研究

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上海第二医科大学学报 2002年第5期22卷 391-395页

作者：朱洪生连锋朱伟钟竑郑林朱平上海第二医科大学仁济医院心胸外科上海200001 江苏大学医学技术学院临检教研室新华医院心胸外科新华医院病理教研室新华医院细胞生物学实验室

目的采用骨髓间质干细胞体外转化为心肌细胞 ,为心衰的干细胞移植治疗提供新的细胞材料。　方法抽取贵州香猪骨髓液 3ml,按照Wakitani的方法培养出骨髓间质干细胞 ,经 5 -氮胞苷刺激 2 4h后 ,进行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙... 详细信息

目的采用骨髓间质干细胞体外转化为心肌细胞 ,为心衰的干细胞移植治疗提供新的细胞材料。　方法抽取贵州香猪骨髓液 3ml,按照Wakitani的方法培养出骨髓间质干细胞 ,经 5 -氮胞苷刺激 2 4h后 ,进行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ、连接蛋白 - 4 3免疫组化 ,电镜鉴定。　结果骨髓间质干细胞经 5 -氮胞苷刺激后 ,部分细胞呈梭形 ,结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ、连接蛋白 - 4 3免疫组化阳性 ,电镜示梭形细胞有明显的肌丝 ,细胞核呈单椭圆形 ,位于细胞中央。　结论骨髓间质干细胞可在体外的环境下向心肌细胞转化。

关键词：骨髓间质干细胞体外转化心肌细胞实验研究肌球蛋白重链心肌特异性肌钙蛋白I 连接蛋白-43

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骨髓间质干细胞静脉移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

骨髓间质干细胞静脉移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

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作者：朱志勇郑州大学

学位级别：硕士

随着危重疾病生存率的提高和人们生存年龄的增加,冠心病已成为人类死亡与致残的重要原因。世界卫生组织预测,不久的将来冠心病将变成世界性问题。研究表明,心肌梗死后成体干细胞可以在损伤组织释放的细胞因子作用下趋化到心肌梗死区域,... 详细信息

随着危重疾病生存率的提高和人们生存年龄的增加,冠心病已成为人类死亡与致残的重要原因。世界卫生组织预测,不久的将来冠心病将变成世界性问题。研究表明,心肌梗死后成体干细胞可以在损伤组织释放的细胞因子作用下趋化到心肌梗死区域,在心肌微环境作用下分化为正常心肌细胞,但这种自然修复过程作用微弱,不能阻止心肌重构的发生和心衰的演变进程。针对心肌梗死发展过程,目前治疗方法有两种:(1) 药物恢复血液供应、介入手术(有广泛弥漫病变的心血管患者不能利用上述方法)与冠状动脉旁路移植术;(2) 利用药物(ACEI和β受体阻制剂)逆转左心室重塑。尽管这两种方法仍有不断改进的可能,但理想的治疗方法应该是(1) 减少心肌细胞死亡,逆转顿抑、冬眠心肌为正常心肌;(2) 增加血管数量,改善缺血区血液供应;(3) 促进细胞分裂增殖取代坏死心肌减小疤痕面积、改善心肌的收缩和舒张功能。细胞移植是一种将外源性细胞移植到受损部位替代损伤心肌细胞,恢复心脏功能的治疗方法,它有很大的针对性和治疗潜力。目前用于移植的细胞种类有:骨骼肌细胞、心肌细胞和骨髓来源的细胞。骨髓来源的骨髓间质干细胞,有较强自我复制能力,并能横向分化成不同组织(成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经细胞)。骨髓间质干细胞有许多特点和优势(如:来源广泛、取材方便、损害小)。本实验的目的:旨在验证骨髓间质干细胞体外培养与扩增的可行性;移植的间质干细胞能否经静脉途径到达心肌梗死部位;到达梗死区域的干细胞在局部微环境作用下能否分化为心肌细胞,分化后的细胞能否表达心肌特异性蛋白;多次静脉移植方法联合抗炎能否有效的改善梗死大鼠的心功能,它与心外膜移植途径相比效果有无显著差异。

关键词：骨髓间质干细胞细胞移植心肌梗死地塞米松细胞培养

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