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BMP2基因多态性与冠脉钙化相关性研究

BMP2基因多态性与冠脉钙化相关性研究

作者：陆涛重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病,其病因和发病机制复杂多样,既往研究主要集中于吸烟、饮酒、炎症反应、高血压、高脂血症等,而与遗传相关因素的研究相对较少。冠脉钙化(coronary artery calcium,CAC)是预测冠心病严重程度的... 详细信息

目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病,其病因和发病机制复杂多样,既往研究主要集中于吸烟、饮酒、炎症反应、高血压、高脂血症等,而与遗传相关因素的研究相对较少。冠脉钙化(coronary artery calcium,CAC)是预测冠心病严重程度的重要指标,本研究拟探讨骨代谢相关基因BMP2,OPG,S100A12多态性在重庆汉族人群中分布,以及上述基因多态性与CAC的相关性。方法:采集2019年3月至2019年5月重庆医科大学附属第一医院心内科进行冠状动脉造影(coronary angiography,CAG)患者临床资料及血液样本,根据CAG结果分为CAC组和对照组,用ABI测序仪检测患者BMP2 rs961253、rs235768、rs1049007,OPG rs2073617、rs2073618,S100A12 rs2916191基因,并应用ELISA方法检测血清BMP2、OPG、S100A12水平。结果:CAC组167例、年龄67.13±9.64岁,对照组93例、年龄60.46±9.89岁。CAC组患者年龄、男性发病率明显高于对照组,肥胖患者、有高血压病史、糖尿病史患者更容易发生CAC(p蛋白A1、C反应蛋白、白细胞数、血清BMP2、S100A12、OPG水平也明显高于对照组(p2rs961253、rs235768、rs1049007存在TT、TC、CC三种基因型,其中最常见的为TT型,TC型次之,CC型最少见,等位基因以T等位基因多见。BMP2 rs961253、rs235768、rs1049007基因型频率与等位基因频率分布在男女之间无显著差别(p>0.05),BMP2 rs961253基因型频率及等位基因频率分布在CAC组和对照组之间有显著差别(p2 rs235768、rs1049007基因型频率及等位基因频率分布在CAC组和对照组之间无显著差别(p>0.05)。OPG rs2073617基因型频率和等位基因频率分布不符合哈迪-温伯格定律。OPG rs2073618基因型及等位基因频率在男女之间无显著差别(p>0.05),该位点存在AA、AG、GG三种基因型,等位基因以A等位基因多见。OPG rs2073618基因型频率与等位基因频率分布在CAC组和对照组之间无显著差别(p>0.05)。S100A12 rs2916191基因型与等位基因频率分布在男女之间无显著差别(p>0.05),该位点存在AA、AG、GG三种基因型,等位基因以G等位基因多见,其基因型频率和等位基因频率分布在CAC组和对照组无显著差别(p>0.05)。钙化组中,BMP2 TT基因型血清BMP2水平明显高于非TT型,有统计学意义(p0.05)。经校正年龄、性别、高血压、吸烟史、体重指数、血脂、C反应蛋白等影响因素后,多因素回归分析发现BMP2 rs961253 TT基因型的钙化风险是其他基因型的3.45倍。结论:血清BMP2水平可作为预测CAC的指标之一。BMP2 rs961253基因多态性与CAC显著相关,BMP2 rs961253 T等位基因或TT基因型是CAC的高危因素。

关键词：冠脉钙化骨形成蛋白2 S100钙结合蛋白骨保护素基因多态性

rhBMP-2和Delta-1对人牙髓干细胞分化影响的实验研究

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rhBMP-2和Delta-1对人牙髓干细胞分化影响的实验研究

作者：于娜第三军医大学

学位级别：硕士

牙髓干细胞是存在于牙髓组织中具有干细胞性质的未分化间充质细胞,具有多向分化潜能,可形成功能性成牙本质细胞和牙本质。 Notch受体、配体在牙齿发育早期有表达,在正常牙髓组织中Notch受体不表达,而当成年牙髓损伤后早期其配体Delta-1... 详细信息

牙髓干细胞是存在于牙髓组织中具有干细胞性质的未分化间充质细胞,具有多向分化潜能,可形成功能性成牙本质细胞和牙本质。 Notch受体、配体在牙齿发育早期有表达,在正常牙髓组织中Notch受体不表达,而当成年牙髓损伤后早期其配体Delta-1表达上调,揭示Notch信号参与了牙髓损伤修复过程,并且Delta-1在牙髓干细胞分化中也起重要作用。BMPs属于TGF-β超家族成员,有多种BMPs参与了牙齿的发育。其中BMP-2主要存在于未分化的造牙本质细胞中,并且参与了牙齿形态的早期形成,并在成牙本质细胞的分化形成中起重要的调控作用,其基因的转录在早期的牙胚上皮和后来的成牙本质细胞中都有发现。另外,研究表明BMP-2参与体内牙髓组织损伤修复过程,且在体外可通过调节细胞的增殖状态,促进牙髓细胞ALP合成等作用,诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化。Notch通路和BMPs信号同为调控细胞增殖、分化的关键信号,其作用存在交叉点。 rhBMP-2对牙髓干细胞自身Delta表达以及二者共同作用对牙髓干细胞分化有何影响?目前有关这一问题的研究报道较少。本课题在对人牙髓干细胞体外分离、培养和鉴定的基础上,进一步研究分析rhBMP-2和Delta与人牙髓干细胞分化的关系,为探讨影响人牙髓干细胞分化的因素提供参考依据。目的研究rhBMP-2对DPSCs分化及Delta表达的影响,并进一步研究rhBMP-2和Delta-1共同作用对牙髓干细胞分化的影响。方法 1.细胞培养与鉴定:牙髓干细胞来源于临床上因正畸或阻生而拔除的健康牙齿,采用酶消化法分离获得并常规原代及传代培养;观察细胞生长状态、形态及其变化;细胞克隆形成率;免疫荧光、免疫组化及RT-PCR法检测细胞表型。 2.细胞分化的检测:为检测rhBMP-2对牙髓干细胞ALP活性的影响,取第5代牙髓干细胞,按以下分组:空白对照组,25,50,100ng/ml rhBMP-2组,分别在培养的第7,14,21天采用ALP活性测定试剂盒进行检测。rhBMP-2作用于牙髓干细胞后RT-PCR检测DSPP表达的情况;Western blot方法检测连续培养第7、14、21天Delta表达情况。为检测rhBMP-2和Delta-1联合应用对人牙髓干细胞分化的影响,用含Delta-1质粒转染COS7细胞,从而在培养液中获得含Deltal-Fc融合蛋白。取第5代牙髓干细胞,按以下分组:空白对照组,rhBMP-2、Delta-1以及二者联合作用组,在连续作用的第7、14、21d检测细胞碱性磷酸酶活性。结果: 1.连续培养的人牙髓干细胞增殖快,细胞呈集落状生长,克隆形成率为4-35个/10细胞,采用免疫组化染色及RT-PCR方法显示细胞表达vimentin、GFAP、nestin、osteocalcin、Ⅲ型胶原,免疫荧光法显示细胞表达STRO-1。 ***-2作用组ALP活性明显高于空白对照组(P＜0.01),并检测出本实验所用rhBMP-2最佳作用浓度为50ng/ml,RT-PCR检测rhBMP-2作用后细胞有DSPP表达。Western-blot检测在细胞生长第21天rhBMP-2刺激组Delta表达高于对照组(P＜0.05)。 ***-2和Delta-1联合作用组ALP活性明显高于对照组及二者单独作用组(P＜0.01)。结论: ***-2可明显增强牙髓干细胞的ALP活性,促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。 ***-2可促进人牙髓干细胞Notch配体Delta的表达。 ***-2和Delta-1之间存在相互协同作用,可明显增强人牙髓干细胞ALP活性。

关键词：牙髓干细胞细胞分化骨形成蛋白2 Delta-1

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脑室内注射瘦素对四肢骨折愈合的影响

天津医药 2014年第6期42卷 558-560页

作者：刘保龙孙志明武俏丽王宏闫华天津医科大学研究生院 300070 天津市环湖医院神经外科

目的观察兔胫腓骨骨缺损模型脑室内注射瘦素蛋白(leptin)对骨折愈合速度的影响。方法建立新西兰兔右侧胫腓骨外侧骨缺损模型,leptin组经兔枕骨大孔向小脑延髓池脑脊液中注射重组兔leptin,对照组以相同方法注射等剂量生理盐水。于术后1、... 详细信息

目的观察兔胫腓骨骨缺损模型脑室内注射瘦素蛋白(leptin)对骨折愈合速度的影响。方法建立新西兰兔右侧胫腓骨外侧骨缺损模型,leptin组经兔枕骨大孔向小脑延髓池脑脊液中注射重组兔leptin,对照组以相同方法注射等剂量生理盐水。于术后1、3、7、14、21 d记录兔体质量变化,并通过CT动态记录骨缺损区域骨痂骨密度(BMD)的变化。于术后21 d,所有动物均处死后取右侧胫腓骨骨缺损区域,以荧光原位杂交技术(FISH)检测骨折区域骨形成蛋白(BMP)-2的表达情况。结果 2组动物造模后,体质量先下降后(14 d)上升,BMD一直呈上升趋势;术后1、3 d,2组体质量及BMD差异均无统计学意义,术后7、14、21 d,leptin组的体质量低于对照组,BMD高于对照组(均P21 d,骨缺损区域BMP-2表达阳性细胞数目高于对照组(个:120.87±29.14 vs 97.65±20.97,t=6.79,P<0.001)。结论经枕骨大孔向小脑延髓池内中注射leptin可加速兔四肢骨缺损的愈合。

关键词：瘦素脑脊液胫骨骨折骨折愈合骨密度原位杂交,荧光兔骨形成蛋白2 bone morphogenetic protein 2

DBM中BMP-2检测初步判断骨库供骨的活性

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中国矫形外科杂志 2019年第20期27卷 1896-1899页

作者：赵彦涛韩丽伟胡先同衷鸿宾中国人民解放军总医院第四医学中心骨科北京市骨科植入医疗器械工程技术研究中心

[目的]定量检测DBM小样中BMP-2含量,以初步评估骨库供体骨的骨诱导活性。[方法]深低温冷冻后的供体骨经过软组织剔除、脱脂、脱钙、干燥、粉碎等过程制成DBM样品。通过Elisa方法对36个供体DBM中BMP-2含量进行定量分析,并结合体内骨诱导... 详细信息

[目的]定量检测DBM小样中BMP-2含量,以初步评估骨库供体骨的骨诱导活性。[方法]深低温冷冻后的供体骨经过软组织剔除、脱脂、脱钙、干燥、粉碎等过程制成DBM样品。通过Elisa方法对36个供体DBM中BMP-2含量进行定量分析,并结合体内骨诱导实验,得出BMP-2含量与骨诱导活性的关系。[结果]不同供体DBM中BMP-2含量相差较大,最低为5.85 ng/g,最高为71.83 ng/g;体内骨诱导实验结果显示,随着BMP-2含量的增多,成骨现象越来越明显(P2含量30 ng/g以下时,成骨面积2含量60 ng/g以上时,成骨面积>25%。[结论] DBM样品中BMP-2的含量与供体骨诱导活性呈正性相关,提示可采用BMP-2的Elisa检测初步评估供体骨的活性。

关键词：骨形成蛋白2 供体筛选骨诱导活性脱钙骨骨移植

BMP2诱导人根尖乳头干细胞分化的作用及机制的研究

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BMP2诱导人根尖乳头干细胞分化的作用及机制的研究

作者：路亚婷山东大学

学位级别：硕士

目的人根尖乳头干细胞(Stem cells from the apical papilla, SCAPs)具有成牙本质向分化、形成根部牙本质的潜能,在未发育完全的恒牙牙根部的发育过程中起重要作用。已有研究证明人骨形成蛋白2(human bone morphogenetic protein 2, BM... 详细信息

目的人根尖乳头干细胞(Stem cells from the apical papilla, SCAPs)具有成牙本质向分化、形成根部牙本质的潜能,在未发育完全的恒牙牙根部的发育过程中起重要作用。已有研究证明人骨形成蛋白2(human bone morphogenetic protein 2, BMP2)能够诱导牙组织来源的干细胞向成牙本质细胞分化,形成牙本质。然而关于BMP2对人根尖乳头干细胞的作用如何尚未见报道。本研究目的是研究BMP2对体外培养的人根尖乳头干细胞增殖及成牙本质向分化的影响及机制。方法及结果第—部分：SCAPs的分离培养、鉴定以及体外诱导分化酶消化法分离培养人根尖乳头细胞,传代后获得稳定生长的细胞。免疫荧光染色及流式细胞仪检测鉴定所培养的细胞干性。成脂诱导及矿化诱导证明所培养的细胞的多向分化潜能。第二部分：BMP2对SCAPs增殖和分化的影响选取含不同浓度的BMP2的培养液培养细胞,通过CCK-8方法检测BMP2对SCAPs增殖的影响,结果显示浓度为0-400ng/ml BMP2对细胞增殖无明显的促进或抑制作用(p2条件培养基(0-400ng/ml)诱导SCAPs的分化,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性,结果显示ALP活性在0-200ng/ml的实验组是逐渐上升的,而在200ng/ml与400ng/ml组无统计学差异。所以在后续实验中我们选取200ng/ml为实验浓度。通过real-time PCR检测牙本质特异性标记物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)以及成骨相关性转录因子(runt-related transcription factor2, Runx2)、骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)、骨钙素(osteocalcin, OCN) mRNA的表达;Western Blotting检测DSPP、Runx2、BSP、OCN蛋白的表达。结果显示BMP2处理细胞后,DSPP、 Runx2、BSP、OCN mRNA及蛋白表达量升高。以上结果充分说明BMP2促进SCAPs的成牙本质／成骨向分化。第三部分MAPKs信号通路在BMP2诱导的SCAPs分化过程中的作用Western Blotting检测BMP2处理SCAPs后MAPKs信号通路蛋白磷酸化水平的变化,结果显示,BMP2促进JNK,ERK和p38的磷酸化,表明BMP2可以激活JNK, ERK和p38信号通路。在BMP2诱导SCAPs分化的同时,分别用20uM浓度的JNK抑制剂SP600125, ERK抑制剂U0126和p38MAPK抑制剂SB203580处理细胞,检测ALP活性,通过real-time PCR和Western Blotting分别检测DSPP、Runx2、BSP、 OCN mRNA和蛋白的表达。结果显示,抑制JNK, ERK和p38的活性后,人根尖乳头细胞ALP活性降低;DSPP、Runx2、BSP和OCN mRNA及蛋白表达水平下降。以上结果表明阻断JNK, ERK和p38MAPK信号通路可抑制BMP2诱导的SCAPs成牙本质/成骨向分化,证明MAPKs信号通路在BMP2对SCAPs成牙／成骨分化过程中起正向调控作用。

关键词：根尖乳头干细胞骨形成蛋白2 细胞分化调节机制

不同质量分数尼古丁与种植体表面处理方式对大鼠种植后骨愈合的影响

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不同质量分数尼古丁与种植体表面处理方式对大鼠种植后骨愈合的影...

作者：孙鑫滨州医学院

学位级别：硕士

第一部分：尼古丁对不同表面处理种植体骨结合的影响目的：通过检测尼古丁对表面喷砂或酸蚀处理种植体植入后骨结合与骨保护素(OPG)、骨形成蛋白2(BMP-2)表达的干预程度,探讨尼古丁影响种植体骨结合的机制。方法：将24只SPF级3月龄SD大... 详细信息

第一部分：尼古丁对不同表面处理种植体骨结合的影响目的：通过检测尼古丁对表面喷砂或酸蚀处理种植体植入后骨结合与骨保护素(OPG)、骨形成蛋白2(BMP-2)表达的干预程度,探讨尼古丁影响种植体骨结合的机制。方法：将24只SPF级3月龄SD大鼠随机分为实验组(尼古丁,2mg/kg/bid背部皮下注射)和对照组(等量生理盐水背部皮下注射),干预2周后,在尼古丁实验组最末次注射1h后皮下注射1mg/kg美加明,12h后观察美加明激发试验引起的尼古丁依赖-戒断症状并予以评分,以确认大鼠尼古丁依赖模型成功建立。建模成功后在大鼠左、右胫骨分别植入表面喷砂或酸蚀处理的钛种植体,并继续施加干预因素。种植后2、4周对种植体及其周围骨组织行CT及骨密度值(Bone Mineral Density, BMD)、X线、荧光定量PCR、HE病理图像观察。采用SPSS17.0软件包对实验数据行单因素方差分析(One-Way ANOVA test),组内两两比较行t检验。结果：与对照组相比,实验组骨结合程度及OPG和BMP-2表达明显下降,差异均有统计学意义(P2周时的1127+28.2 HU降为4周时的960±62.2 HU(P0.05)。荧光定量PCR观察发现,除AEI组BMP-2表达量的变化差异不明显外,其他实验组OPG和BMP-2基因表达量随时间变化均下降明显(P2的表达量,影响种植体的骨结合,尤以表面喷砂处理种植体为甚。第二部分：不同质量分数尼古丁对种植体骨愈合的影响目的：探讨不同质量分数的尼古丁干预对种植体周围骨组织的愈合情况和骨保护素(OPG)及骨形成蛋白2(BMP-2)表达情况的影响。方法：选取24只3月龄SD大鼠,雌雄不限,随机数表法均分为高、中、低浓度的尼古丁实验组和对照组,分别采用不同质量分数(2mg/kg、0.2 mg/kg、0.02 mg/kg)的尼古丁和等量生理盐水干预,每天2次背部皮下注射。干预2周建模成功后,于大鼠左右胫骨近骺端均植入表面喷砂蚀刻处理的钛合金种植体,并继续施加干预因素。种植后第2、4周分别行X线、CT、电镜观察和qRT-PCR检测。采用SPSS17.0软件包对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA test),组内比较行t检验。结果：X线灰度值显示,除高浓度尼古丁组(HDN)与对照组存在差异(P2周时随着尼古丁干预浓度的增加,种植体周围基因表达量逐渐降低,且与对照组差异明显(P2的表达无明显差异(1/0.93±0.17,P>0.05);实验第4周,各尼古丁组的基因表达量均出现下调(P<0.05)。扫描电镜(SEM)观察发现,随着尼古丁浓度和干预时间的增加,骨小梁结构发生改建障碍,多呈纤维骨或编织骨,骨基质分布不均匀且纤维结构排列紊乱无定向。结论：尼古丁对种植体周围骨愈合的抑制作用可能与其下调相关骨活性基因的表达关系密切,且抑制作用有明显的尼古丁作用浓度依赖性和时间依赖性。

关键词：尼古丁骨愈合种植体表面处理浓度依赖性骨保护素骨形成蛋白2

长链非编码RNA-lnc121610参与子宫内膜异位症内膜蜕膜化机制研究

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长链非编码RNA-lnc121610参与子宫内膜异位症内膜蜕膜化机制研究

作者：杨琳厦门大学

学位级别：硕士

目的子宫内膜异位症(EMs)是一种雌激素依赖性女性疾病,目前认为,是子宫内膜腺体细胞和基质细胞异位至宫腔之外的部位而引发的,以不孕和疼痛为典型症状。蜕膜化是子宫内膜的一种特殊分化过程,是内膜胚胎着床和建立妊娠的基础。本研究旨... 详细信息

目的子宫内膜异位症(EMs)是一种雌激素依赖性女性疾病,目前认为,是子宫内膜腺体细胞和基质细胞异位至宫腔之外的部位而引发的,以不孕和疼痛为典型症状。蜕膜化是子宫内膜的一种特殊分化过程,是内膜胚胎着床和建立妊娠的基础。本研究旨在从前期芯片数据中筛选出分泌中期EMs组与正常组内膜组织中差异表达的lncRNA并进行验证。建立人子宫内膜基质细胞(HESC)人工蜕膜化模型并在其中研究lnc121610敲低对细胞增殖和分化的影响。探索lnc121610所受到的上下游分子的影响,为后续研究提供参考。方法采用Q-RTPCR方法验证lnc 121610在EMs组与正常组内膜中的差异表达。在HESC细胞中敲低lnc121610,采用CCK-8法及EdU法检测细胞增殖;对HESC细胞敲低lnc121610后,进行人工蜕膜化,并在加入分化液当天(D0)、48 h(D2)、96h(D4)和144 h(D6)收集细胞用于分析RNA和蛋白水平的变化,采用ELISA、Western Blot及Q-RT PCR等方法检测细胞诱导蜕膜化情况。采用Q-RTPCR方法检测外源性BMP2对lnc121610表达的影响及敲低/过表达lnc121610后PRL和IGFBP1表达水平的变化;在HESC细胞中敲低lnc121610后加入分化液诱导至D4,采用Western Blot及Q-RTPCR方法检测lnc121610敲低后对分泌期SMAD1及其下游分子的影响。结果与正常组比较,分泌中期EMs组内膜组织中lnc121610表达水平和BMP2表达水平明显降低。利用HESC进行人工诱导蜕膜化,蜕膜化标志PRL和IGFBP1基因、蛋白表达水平明显升高,细胞形态发生变化,表明人工蜕膜化模型构建成功。随着蜕膜化的进展,lnc121610的表达逐渐升高。lnc121610敲低组和对照组在EdU细胞阳性率、细胞增殖率、细胞核增殖蛋白表达等方面差异未见明显统计学意义。在诱导蜕膜化D2、D4和D6时,lnc121610敲低组细胞培养基中的PRL浓度和IGFBP1的蛋白表达水平明显低于对照组;在诱导蜕膜化D2、D4和D6时,lnc121610敲低组PRL和lGFBP1的RNA水平明显低于对照组。在细胞培养基中加入外源性BMP2,随着BMP2浓度升高,蜕膜化标志基因PRL和IGFBP1表达水平明显升高;lnc121610表达水平明显升高,而敲低/过表达lnc121610后,则PRL和IGFBP1的表达水平降低/升高。与阴性对照组及空白对照组比较,lnc121610敲低组分化期SMAD1、p-SMAD1、p-SMAD1/5/8蛋白表达明显降低。结论 Lnc121610在EMs中呈低表达;lnc121610可参与HESC细胞蜕膜化;lnc121610的敲低可抑制HESC细胞蜕膜化表型的建立;外源性BMP2可影响HESC细胞中lnc121610的表达;lncl21610的敲低可抑制SMAD1、p-SMAD1及p-SMAD1/5/8在细胞蜕膜化中的表达。

关键词：子宫内膜异位症蜕膜化长链非编码RNA lnc121610 骨形成蛋白2

M2型巨噬细胞抑制放射后BMSCs向肌成纤维细胞转化的实验研究

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M2型巨噬细胞抑制放射后BMSCs向肌成纤维细胞转化的实验研究

作者：赵路佳木斯大学

学位级别：硕士

目的:研究M2型巨噬细胞对放射后的BMSCs向肌成纤维细胞转化的抑制作用。方法:分别培养SD大鼠来源的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）以及由巨噬细胞极化而来的M2型巨噬细胞,通过流式细胞术鉴定其表面标志... 详细信息

目的:研究M2型巨噬细胞对放射后的BMSCs向肌成纤维细胞转化的抑制作用。方法:分别培养SD大鼠来源的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）以及由巨噬细胞极化而来的M2型巨噬细胞,通过流式细胞术鉴定其表面标志物。首先建立BMSCs体外细胞辐照模型,然后依据本模型将照射后的BMSCs随机分为三组进行研究:组1,照射后的BMSCs+M2型巨噬细胞Transwell小室（3μm）共培养;组2,照射后的BMSCs+M2型巨噬细胞Transwell小室（8μm）共培养;组3,BMSCs单纯照射组。在相应时间节点对各组BMSCs分别进行光镜下的细胞形态学观察,CCK-8法细胞增殖能力检测,活细胞筛选检测,并利用western blot检测各组BMSCs内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、NADPH氧化酶（NOX4）、骨形成蛋白2（BMP-2）的表达水平。结果:SD大鼠骨髓间充质干细胞培养基中加入M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）30 ng/ml培养6-9 d后可获得成熟的巨噬细胞;应用20 ng/ml IL-4（白介素4）24 h后可诱导成熟的巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞;照射后的BMSCs与M2型巨噬细胞用Transwell小室（8μm）共培养48 h后,BMSCs中α-SMA和NOX4的表达水平明显降低,BMP-2的表达水平有所增加（P＜0.05）。结论:M2型巨噬细胞可以减少放射后的BMSCs中α-SMA、NOX4的生成并促进BMP-2的表达,抑制放射后的BMSCs向肌成纤维细胞的转化,可能对放射性颌骨骨坏死具有一定的治疗作用。

关键词：骨髓间充质干细胞 M2型巨噬细胞 α-平滑肌肌动蛋白 NADPH氧化酶骨形成蛋白2

MicroRNA靶向Id1对BMSCs成骨分化的影响

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MicroRNA靶向Id1对BMSCs成骨分化的影响

作者：聂晓萌山东大学

学位级别：硕士

[研究背景]骨形成蛋白2 (Bone morphogenetic protein, BMP2)基因可促进骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)的成骨分化,但在成骨分化的终末期该基因可引起BMSCs成骨指标不佳。Idl因子在BMSCs成骨分化过程中的表达变化,是... 详细信息

[研究背景]骨形成蛋白2 (Bone morphogenetic protein, BMP2)基因可促进骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)的成骨分化,但在成骨分化的终末期该基因可引起BMSCs成骨指标不佳。Idl因子在BMSCs成骨分化过程中的表达变化,是BMSCs成骨分化的关键。BMP2上调工d1因子的表达,提示Idl因子可能是BMP2高表达环境中BMSCs成骨分化的关键因子。通过miRNA芯片筛选发现某些miRNA表达水平在BMP2刺激和未刺激的BMSCs中存在显著差异,并且这些miRNA与通过生物信息学预测的可能调控Idl因子表达的miRNA相符合。[目的]阐述体外高表达BMP2及Idl因子的变化对大鼠BMSCs成骨分化的影响,验证Idl因子在BMP2修饰的BMSCs成骨分化中的重要作用,证明Id表达上调是BMP2抑制BMSCs成骨分化的原因并探寻BMP2对Idl的调控机制;拟筛选鉴定出靶向作用于Idl因子的miRNA分子,证明某些特定的miRNA表达变化可能是BMP2上调Idl表达的新分子机制,为颌面部骨缺损修复提供新的研究策略。[方法]1、分离及纯化培养Wistar大鼠的BMSCs,分别于不同时间点,显微镜下观察BMSCs的形态;取第3-5代BMSCs,进行成骨诱导,培养7-14天,进行茜素红染色,光学显微镜下观察矿化情况,进行成骨鉴定;取第3-5代BMSCs,进行成脂诱导,培养7-14天,进行油红0染色,光学显微镜观察着色脂滴,进行成脂鉴定。2、根据Genbank中Idl的mRNA序列设计合成引物,PCR扩增基因片段并鉴定PCR产物;对已构建的pDC316-BMP2-GFP重组腺病毒,进行滴度测定;腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP转染第2-3代BMSCs,病毒转染后绘制细胞生长曲线,检测病毒对细胞生长增殖的影响;取MOI值为40时,腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP转染第2-3代BMSCs,分别于不同时间点收集细胞(Ad-BMP2-BMSCs组、Ad-GFP-BMSCs组、BMSCs组),实时定量PCR检测细胞中目的基因Idl的表达。3、筛选靶向Idl基因的miRNA,应用miRNA在线数据库,针对Idl因子预测可能调控其表达的miRNA分子,根据评分结果加以选择,通过miRNA表达谱芯片及相关技术筛选,将芯片筛选和预测的结果进行分析,提取细胞的RNA,应用Real-time PCR方法检测验证miRNA的变化与芯片检测结果的一致性,筛选从而明确研究的miRNA。[结果]1、成骨诱导的BMSCs生长相对缓慢,细胞形态不规则,呈现多角形成骨细胞形态;诱导7天后,茜素红染色可观察到少量点状红色矿化结节的形成,诱导14天可观察到明显的矿化结节。2、脂肪诱导液诱导BMSCs,诱导后的细胞增殖稍缓慢,细胞形态相对展平;诱导14天后油红O染色可观察到脂滴形成。3、Ad-BMP2转染BMSCs48h后,荧光显微镜现观察细胞绿色荧光蛋白表达的情况,细胞表达绿色荧光比例随MOI值的增加而增高,当MOI值为40时,在荧光显微镜下观察有95%以上的细胞出现了绿色荧光。4、腺病毒转染后没有影响细胞的增殖,各组增殖数目间无显著差异(P>0.05)。5、通过miRNA表达谱芯片及相关技术筛选其差异情况发现有123个miRNA下调,114个miRNA上调;将芯片筛选和预测的结果进行分析,发现一共有3个miRNA发生变化,miRNA-338、miRNA-195及miRNA-98;其中1个上调,2个下调。[结论]1、密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,此方法可得到纯度较好的BMSCs,BMSCs具有成骨分化能力和成脂肪分化能力。2、Ad-BMP2重组腺病毒表达载体,滴度高转染效率好,为稳定且有效的基因表达载体,病毒转染后可使BMSCs过表达BMP2,最佳MOI值为40。3、在靶向Idl的miRNA分子中,生物预测结果与芯片检测结果一致的是：miRNA-338上调、miRNA-195及miRNA-98下调。

关键词：骨组织工程 DNA分化抑制因子1 microRNA 骨髓基质干细胞骨形成蛋白2