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Ad-hBMP-2基因转染骨骼肌卫星细胞体外成骨分化的实验研究

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Ad-hBMP-2基因转染骨骼肌卫星细胞体外成骨分化的实验研究

作者：孙树洋山东大学

学位级别：硕士

目的： 1．探讨骨骼肌卫星细胞体外分离培养、鉴定的方法，研究骨骼肌卫星细胞的生物学特性，为后续的实验奠定基础。 2．评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2（Ad-hBMP-2）基因体外转染骨骼肌卫星细胞后... 详细信息

目的： 1．探讨骨骼肌卫星细胞体外分离培养、鉴定的方法，研究骨骼肌卫星细胞的生物学特性，为后续的实验奠定基础。 2．评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2（Ad-hBMP-2）基因体外转染骨骼肌卫星细胞后，肌卫星细胞分化为成骨样细胞的能力;并测定基因转染后目的基因体外表达的情况。应用Ad-GFP基因转染肌卫星细胞，测定腺病毒转染的效率。为应用骨骼肌卫星细胞修复骨缺损提供实验依据。方法： 1．采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞，进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态，通过生长曲线、细胞融合率等指标研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力，利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。 ***-hBMP-2基因体外转染骨骼肌卫星细胞后，通过形态学观察、生长曲线的测定、碱性磷酸酶（ALP）细胞化学染色及活性检测、骨钙素（OC）及Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色、矿化结节形成实验和Western—blot，观察Ad-hBMP-2基因转染后骨骼肌卫星细胞生物学行为的变化和目的基因表达的情况。Ad-GFP基因转染骨骼肌卫星细胞后2天，用荧光显微镜测定腺病毒转染效率，并观测Ad-GFP基因转染的骨骼肌卫星细胞传代后绿色荧光蛋白的表达情况。

关键词：腺病毒骨形成蛋白2 骨骼肌卫星细胞组织工程基因治疗

茶多酚对人牙槽骨成骨细胞增殖以及成骨细胞相关基因表达的影响

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茶多酚对人牙槽骨成骨细胞增殖以及成骨细胞相关基因表达的影响

作者：谢巍遵义医学院

学位级别：硕士

目的:通过观察不同浓度茶多酚(tea polyphenols,TP)对健康人牙槽骨成骨细胞(human alveolar osteoblasts,HAOB)增殖以及成骨细胞(osteoblasts,OB)相关基因Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、组织非特异性碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNAP)、Ⅰ型胶原蛋白α1链(collagen typeⅠalpha 1,COL1A1)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)基因表达的影响,研究TP对健康HAOB增殖以及OB相关基因的影响,寻求一种简单安全可靠的方法保持牙周组织健康,甚至修复已破坏的牙周组织,为进一步研究TP对口腔疾病和骨代谢相关疾病的治疗提供实验基础和理论依据。方法:1.通过改良的预消化组织块培养法体外培养健康HAOB,进行形态学观察,并采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)偶氮偶联法和细胞茜素红钙染色法进行细胞鉴定;2.采用细胞增殖—毒性检测试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)检测不同浓度TP对健康HAOB增殖的情况;3.采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ PCR)检测OB相关基因RUNX2、OSX、TNAP、COL1A1、OCN和BMP2基因的表达情况。结果:1.应用改良的预消化组织块培养法体外培养健康HAOB,约5天左右可见HAOB从骨粒边缘游出,多为三角形和梭形、体积较大、椭圆形单核、见1个核仁、无接触抑制等形态特征符合OB;ALP偶氮偶联法鉴定达90%的细胞阳性表达;细胞茜素红钙染色法鉴定呈阳性。***-8结果表明:48 h时各浓度TP对HAOB均有明显促进细胞增殖的作用(P24 h和72 h促进效果更佳;24 h、48 h和72 h时均在100μg/ml TP作用下对细胞增殖的促进效果更好(P24 h和72 h时在低浓度TP作用下促进作用不显著,甚至在102μg/ml TP影响下出现抑制作用(P2的相对表达量与实验第二部分促进HAOB的增殖情况基本吻合;OSX、COL1A1、OCN和BMP2在72 h时1.0μg/ml TP组的相对表达量较24 h和48 h时有所增高;COL1A1和OCN相对表达量的趋势类似。结论:采用改良的预消化组织块培养法可以成功体外培养出HAOB;不同浓度TP对HAOB增殖的影响不同,在10-4μg/ml00μg/ml(0.0001μg/mlμg/ml)TP浓度范围内促进细胞增殖呈浓度依赖性,尤其100μg/ml(1μg/ml)TP比其他浓度的促进细胞增殖作用更强,但随着浓度增加会出现抑制现象,并且在48 h时促进作用比24 h和72 h时效果更佳;TP对OB的增殖可能与RUNX2的表达呈正相关,而且72 h时在1.0μg/ml(1μg/ml)TP的影响下,TP可以促进OSX、COL1A1、OCN和BMP2的表达增加。

关键词：茶多酚人牙槽骨成骨细胞 Runt相关转录因子2 成骨细胞特异性转录因子骨形成蛋白2

pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2质粒对大鼠牙囊细胞增殖影响的初步研究

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pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2质粒对大鼠牙囊细胞增殖影响的初步...

作者：沈月腾重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：体外培养并鉴定SD大鼠牙囊细胞，构建pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2两种真核表达载体，脂质体介导pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2转染SD大鼠牙囊细胞，并检测两者对细胞增殖的早期影响，促进两种生长因子在牙周组织工程中的进一步... 详细信息

目的：体外培养并鉴定SD大鼠牙囊细胞，构建pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2两种真核表达载体，脂质体介导pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2转染SD大鼠牙囊细胞，并检测两者对细胞增殖的早期影响，促进两种生长因子在牙周组织工程中的进一步应用。方法：1. SD大鼠牙囊细胞的体外纯化培养及组织学来源鉴定，取第四代牙囊细胞进行后期转染。2.设计Igf1和Bmp2基因的引物，PCR技术扩增两种基因片段，并构建pMD-19T/Igf1和pMD-19T/Bmp2载体。3.对pMD-19T/Igf1与pEGFP-N1质粒及pMD-19T/Bmp2与pEGFP-N1质粒进行酶切，使酶切后的Igf1，Bmp2基因分别与pEGFP-N1空质粒连接并鉴定连接后的质粒。4．取第四代牙囊细胞进行分组实验，共5组：①空白对照组、②脂质体组、③pEGFP-N1/Igf1质粒＋脂质体组、④pEGFP-N1/Bmp2质粒＋脂质体组、⑤pEGFP-N1/Igf1质粒+pEGFP-N1/Bmp2质粒＋脂质体组。5.绿色荧光观察：转染后第二天开始观察，每天一次，持续4d。6. MTT法检测细胞活力：转染后第二天1开始检测各组细胞的活力，每天一次，持续4d。7.考马斯亮蓝（Bradford）染色法检测细胞内总蛋白浓度：配制Bradford蛋白测定工作液，分光光度计测定每组细胞的吸光值，计算出蛋白质浓度。结果：1.体外成功培养SD大鼠牙囊细胞并传代纯化，第四代细胞活力较佳。2.成功构建真核表达载体pEGFP-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2。3.镜下观察荧光表达：转染后第2d最强。4.检测细胞增殖活力：转染后第1d、3d、4d均为④组＞⑤组＞③组＞①组＞②组，④⑤组间差异无统计学意义（p＞0.05），其余组间差异有统计学意义（p＜0.05）。转染后第2d为⑤组＞④组＞③组＞①组＞②组，④⑤组间差异无统计学意义（p＞0.05），其余组间差异有统计学意义（p＜0.05）。5.细胞内蛋白浓度：结果与MTT法测量结果基本一致，③④⑤组蛋白浓度明显高于其他三组，④⑤组间差异无统计学意义（p＞0.05）。除②组外各组蛋白浓度从转染后第2d开始上升，第3d显著升高，第4d略有下调。结论：1.成功构建Igf1与Bmp2两种基因的真核表达载体：pEGFP-N1/Igf1质粒和pEGFP-N1/Bmp2质粒。2.脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染48h时绿色荧光表达量最强。3.脂质体Lipofectamine2000对细胞的毒性作用较为明显。***-N1/Igf1和pEGFP-N1/Bmp2质粒早期对细胞增殖均有促进作用，但两者同时作用时相对于单独的pEGFP-N1/Bmp2质粒并无显著优势，其相互作用仍需进一步实验研究。

关键词：胰岛素样生长因子1 骨形成蛋白2 牙囊细胞基因治疗增殖

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激光照射后大鼠牙髓防御修复机制的实验研究

激光照射后大鼠牙髓防御修复机制的实验研究

作者：金燕娇天津医科大学

学位级别：硕士

目的:通过建立大鼠牙本质过敏症的模型,用脱敏剂量的脉冲CO激光照射,观察牙髓组织中热休克蛋白70(HSP70)、转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形成蛋白2(BMP-2)在不同时间段和部位的表达情况,并用透射电镜观察微观变化,分析各观察指标在损伤... 详细信息

目的:通过建立大鼠牙本质过敏症的模型,用脱敏剂量的脉冲CO激光照射,观察牙髓组织中热休克蛋白70(HSP70)、转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形成蛋白2(BMP-2)在不同时间段和部位的表达情况,并用透射电镜观察微观变化,分析各观察指标在损伤防御和自我修复过程中的生物学意义,进一步探讨牙髓组织经激光照射后的损伤修复机制。方法:18周龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只经牙本质过敏症模型制备后,常规喂养十天,随机分为5组,每组九只,即A组(激光照射后4小时处死组)、B组(激光照射后3天处死组)、C组(激光照射后2周处死组)、D组(激光照射后4周处死组)和N组(激光未照射组)。大鼠处死后立即截取左侧上颌第一磨牙(M1)、第二磨牙(M2)、第三磨牙(M3)连同部分颌骨标本共40例(每组8只),进行HE染色和免疫组织化学分析。在每组中随机抽取一只大鼠,处死后劈开左侧上颌M1牙冠,取出牙髓经固定后切片,进行透射电镜观察。应用Image-Pro Plus 5.0图像分析处理软件测得免疫组化图像的平均OD值,所得数据应用SPSS11.5统计软件,秩和检验Kruskal—Wallis法、Nemenyi法以及完全随机设计单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD-t检验。结果:脉冲CO激光照射后HE染色结果:成牙本质细胞空泡性变和牙髓血管充血和出血情况的数据经统计学分析后得出:A组和C组、D组、N组差异有统计学意义(P形成。牙髓中HSP70的表达情况经统计学分析后发现:A组、B组、C组、D组、N组冠髓中的平均OD值分别为:0.3610±0.0380,0.2132±0.0341,0.1951±0.0208,0.1765±0.0381,0.1932±0.0460,A组与其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。牙髓中TGF-β1的表达情况经统计学分析后发现:A组、B组、C

关键词：脉冲CO2激光热休克蛋白70 转化生长因子β1 骨形成蛋白2 免疫组织化学透射电镜机制

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碳酸饮料对大鼠拔牙创愈合的影响

碳酸饮料对大鼠拔牙创愈合的影响

作者：杨坤华北理工大学

学位级别：硕士

目的通过SD大鼠长期、大量摄入碳酸饮料,观察大鼠拔牙创新生牙槽骨X线片,骨密度,组织形态学变化,检测拔牙创的骨形成蛋白2(BMP-2),白细胞介素1(IL-1)的表达情况。探讨碳酸饮料对大鼠拔牙创愈合的影响,为临床长期大量饮用碳酸饮料拔牙患... 详细信息

目的通过SD大鼠长期、大量摄入碳酸饮料,观察大鼠拔牙创新生牙槽骨X线片,骨密度,组织形态学变化,检测拔牙创的骨形成蛋白2(BMP-2),白细胞介素1(IL-1)的表达情况。探讨碳酸饮料对大鼠拔牙创愈合的影响,为临床长期大量饮用碳酸饮料拔牙患者牙槽骨愈合提供实验依据。方法选取SD大鼠60只,随机分组的方法分为对照组和实验组。对照组大鼠按照正常喂养方式喂养,实验组大鼠不给饮水,每日两次,每次20ml左右可口可乐(市售封装)的计量喂养。分组喂养的第4w,8w和12w对两组大鼠每组每次随机选取5只进行胫骨近端骨密度(BMD)的检测。大鼠拔牙创的制备:大鼠麻醉状下,对大鼠左上第一磨牙进行拔除。继续给予对照组正常饮食喂养、实验组可乐喂养(原剂量不变)。在拔牙后的2w,4w,6w,8w对大鼠分批处死,每次处死5只大鼠,取大鼠拔牙创周围牙槽骨,剔除软组织后,行X线和BMD的检测。观察大鼠拔牙创的整体骨愈合情况及骨量的变化。标本固定后脱钙,包埋,切片分别进行HE组织切片染色和免疫组化BMP-2、IL-1的染色。运用Olympus软件系统采图,Image-Pro-plus6.0软件对HE染色图片进行骨计量学分析,对比新生骨小梁宽度和间距;免疫组化图像行平均光密度(MOD)测算。实验所有数据经由统计分析处理软件SPSS19.0进行统计学处理,首先确定样本是否符合正太分布,再进行方差齐性检验,组间比较用t检验,以P2w对比两组大鼠胫骨近端骨密度出现显著差异(P2 X线肉眼观察粗略的反应大鼠拔牙创的愈合情况,相同时间点对照组的大鼠拔牙创愈合情况比实验组愈合更好。3拔牙术后实验组2w,4w,6w,8w大鼠拔牙创新生牙槽骨周围的骨密度均显著低于对照组(P2w时实验组与对照组比较,拔牙创内新骨形成量少,新生骨小梁间距宽,宽度窄,骨计量学统计对比分析(P骨形成少,拔牙创口处牙槽骨未长平,新生骨小梁排列更为杂乱,骨小梁间距宽且纤细,骨计量学统计对比分析有差异(P2w时对照组BMP-2免疫组化图像MOD值显著大于实验组(P0.05)。6 IL-1免疫组化图像MOD值2w时实验组与对照组比较P2碳酸饮料的过量摄入会降低大鼠拔牙创骨愈合的质量,并使愈合变慢。3碳酸饮料会抑制大鼠拔牙创愈合过程中BMP-2的表达、促进IL-1的表达,有抑制成骨和促进破骨的作用。

关键词：碳酸饮料拔牙创骨形成蛋白2 白细胞介素1

BMP2基因修饰的骨髓间充质干细胞促进缝牵引区新骨形成的实验研究

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BMP2基因修饰的骨髓间充质干细胞促进缝牵引区新骨形成的实验研究

作者：张斌斌山西医科大学

学位级别：硕士

目的:1.将比格犬作为实验动物,用自行设计的牵引装置进行缝牵引成骨实验,模拟人缝牵引成骨治疗面中份发育不全的过程,希望建立一种可靠的的面中部骨缝牵引动物模型,为后续研究缝牵引成骨的相关机制提供基础。2.本课题以腺病毒为载体,应... 详细信息

目的:1.将比格犬作为实验动物,用自行设计的牵引装置进行缝牵引成骨实验,模拟人缝牵引成骨治疗面中份发育不全的过程,希望建立一种可靠的的面中部骨缝牵引动物模型,为后续研究缝牵引成骨的相关机制提供基础。2.本课题以腺病毒为载体,应用基因治疗的手段将Ad-BMP2转染至骨髓间充质干细胞,研究其对缝牵引成骨的促进作用,从而为早期治疗颅颌面骨畸形缩短缝牵引成骨治疗周期提供理论依据。方法:1.4-5个月比格犬3只,随机分为实验组2只和对照组1只。实验组于双侧颧颞缝、颧上颌缝、腭横缝植入种植钉作为骨标志点,以犬尖牙窝作为面中部骨骼的承力点,采用头颅外牵引架进行牵引,每侧800g力,弹性牵引15天。对照组仅于骨缝两侧植入种植钉作为骨标志点。通过游标卡尺和X线检查测量骨缝两侧种植钉之间的距离来证实牵引所致的改变;头影测量测量颅底角角度变化分析牵引方向;HE染色在显微镜下观察骨缝宽度、细胞及新生骨组织形态与结构。2.全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行成骨、成脂诱导鉴定,CCK-8测定P3细胞生长曲线;测定Ad-BMP2最佳感染复数,取以最佳感染复数感染后第3天的细胞行qRT-PCR、Western-blot检测目的基因的表达;14只比格犬面中部经缝牵引15天左右进入固定期,实验分为3组,每组4只比格犬,牵引完成后即刻于双侧颧颞缝A组注射等量生理盐水、B组注射未转染BMP-2的BMSCs、C组注射转染Ad-BMP2的BMSCs并维持牵引2周、4周。按照预设时间节点(牵引完成后即刻2只,2、4周时A、B、C三组各2只)处死动物并取材,行HE染色并测量骨缝宽度及骨小梁厚度、Masson染色观察骨成熟程度、Ⅰ型胶原免疫组化染色并测量IOD值,进行统计学分析。结果:1.实验组比格犬牵引架性能稳定、固位良好。实验组比格犬牵引过程中上颌逐渐前突,咬合关系逐渐变为Ⅱ类错合。牵引15天时可见前牙覆盖距离约为8-9mm。牵引前后游标卡尺和X线测量各骨缝标志点间的距离示:腭横缝骨标志点间距扩增最大,颧颞缝次之,颧上颌缝扩增较少。术前术后头影测量颅底角基本变化不明显,上颌基本为平行前移。组织学显示:对照组骨缝胶原纤维较致密,缝边缘可见成骨细胞,显示有成骨活动;实验组骨缝增宽明显,成纤维细胞数量明显增加,胶原纤维疏松,细胞和纤维排列方向基本一致,与牵引力的方向趋于平行,小血管和骨髓腔较多,骨缝周围骨小梁较薄,显示活跃的成骨活动。2.成功分离培养骨髓间充质干细胞,成骨诱导21天后茜素红染色阳性,成脂诱导20天后油红O染色阳性。CCK-8结果P3代BMSCs生长曲线呈“S”形,具有较强的增殖能力。qRT-PCR结果显示Ad-BMP2转染BMSCs组与BMSCs组相比BMP-2基因表达增加(P2转染BMSCs组BMP-2蛋白表达增加。HE染色示A、B、C三组骨缝宽度依次变窄、骨小梁厚度依次增加,且任意两组间骨缝宽度、骨小梁厚度差异均有统计学意义(P2周、4周骨缝宽度逐渐减小、骨小梁厚度逐渐增加,且任意两个时间点之间骨缝宽度、骨小梁厚度差异均有统计学意义(P2周、4周IOD值先升高后降低,且任意两个时间点之间IOD值差异均有统计学意义(P2.全骨髓贴壁法培养的骨髓间充质干细胞具备成骨成脂分化能力,增长能力良好;Ad-BMP2可成功转染至骨髓间充质干细胞并表达分泌BMP-2,BMSCs可作为基因治疗的种子细胞;BMSCs可以促进骨缝牵引区新骨形成与改建,Ad-BMP2转染的BMSCs促进效果更加显著,临床应用可能缩短缝牵引成骨的治疗过程。

关键词：骨髓间充质干细胞骨形成蛋白2 腺病毒缝牵引成骨面中部发育不全

BMP2和VEGF165在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

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BMP2和VEGF165在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

作者：石磊遵义医学院

学位级别：硕士

目的：建立大鼠体外骨髓间充质干细胞的分离培养方法,观察BMP2和VEGF165表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的蛋白表达情况。方法：全骨髓贴壁分离培养方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体2000介导下将BMP2和VEGF165表达质粒导... 详细信息

目的：建立大鼠体外骨髓间充质干细胞的分离培养方法,观察BMP2和VEGF165表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的蛋白表达情况。方法：全骨髓贴壁分离培养方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体2000介导下将BMP2和VEGF165表达质粒导入大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组织化学及Elise法检测BMP2和VEGF165在大鼠骨髓间充质干细胞中的蛋白表达情况及规律。结果：转染BMP2和VEGF165表达质粒的大鼠骨髓间充质干细胞有明显的BMP2和VEGF165的蛋白表达。结论：经转染BMP2和VEGF165双基因的大鼠骨髓间充质干细胞能表达以上两种基因。

关键词：骨形成蛋白2 血管内皮生长因子骨髓间充质干细胞

电针刺激通过调控肠道肌层巨噬细胞分泌BMP2影响肠道动力

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电针刺激通过调控肠道肌层巨噬细胞分泌BMP2影响肠道动力

作者：李英莉华中科技大学

学位级别：硕士

目的:最近研究表明,糖尿病肠道动力紊乱的机制与肠道肌层巨噬细胞的数量及功能的改变有关。骨形成蛋白2作为TGF-β家族的一员,在肠神经的生长、发育、分化等方面有重要作用。而肌层巨噬细胞可以通过分泌骨形成蛋白2,选择性作用于肠神经... 详细信息

目的:最近研究表明,糖尿病肠道动力紊乱的机制与肠道肌层巨噬细胞的数量及功能的改变有关。骨形成蛋白2作为TGF-β家族的一员,在肠神经的生长、发育、分化等方面有重要作用。而肌层巨噬细胞可以通过分泌骨形成蛋白2,选择性作用于肠神经元表面,影响肠道动力。前期研究已证实电针刺激可以影响肠道全层巨噬细胞及肠神经元,但电针刺激对肠道肌层巨噬细胞及其分泌的骨形成蛋白2是否产生影响尚不清楚。基于以上理论,本研究以长期慢性电针刺激糖尿病小鼠为模型,探索肠道肌层巨噬细胞的表型及数量、骨形成蛋白2、肠神经元三者在糖尿病导致的肠道动力紊乱中的作用。方法:C57bl/6健康成年雄性小鼠随机分为5组:正常对照组(Control)、糖尿病组(DM)、糖尿病+慢性假性电针刺激组(DM+SEA,30min/天)、糖尿病+慢性电针刺激低频组(DM+LEA,10Hz 1mA 30min/天)、糖尿病+慢性电针刺激高频组(DM+HEA,100Hz 1mA 30min/天)。电针刺激周期为糖尿病成模后8周。分别使用Western Blot、流式细胞术、Real-time PCR及免疫荧光染色技术检查结肠全层M2型巨噬细胞总量、肌层巨噬细胞相对数量、BMP2/BMPR-Smad通路中部分分子及下游神经元PGP9.5、nNOS表达量在各组小鼠结肠中的差异。结果:(1)低频及高频电针刺激可以改善糖尿病小鼠肠道传输时间延长的情况;(2)结肠肌层巨噬细胞以M2表型为主,糖尿病可导致结肠全层M2型巨噬细胞绝对含量及肌层M2型巨噬细胞相对含量减少,高频电针刺激则可纠正这些改变;(3)肌层M2型巨噬细胞通过BMP2/BMPR-Smad通路,作用于肠神经元,糖尿病小鼠可出现BMP2、BMPR1b、Smad1、PGP9.5、nNOS的下调,高频电针刺激可以促进以上各分子上调,从而改善肠道动力。结论:糖尿病小鼠存在着肠道传输时间的延长,结肠全层M2型巨噬细胞绝对数量、肌层M2型巨噬细胞相对数量下调,BMP2/BMPR-Smad信号通路部分分子及下游神经元(nNOS为主)表达的下调,而高频电针刺激可以纠正上诉各种改变,从而改善肠道动力。

关键词：电针刺激糖尿病胃肠动力肌层巨噬细胞骨形成蛋白2 肠神经元

Ad-hBMP-2对兔成骨细胞生物学行为影响的体外实验研究

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Ad-hBMP-2对兔成骨细胞生物学行为影响的体外实验研究

作者：晋国营山东大学

学位级别：硕士

目的：检测 Ad-hBMP-2在体外环境下对成骨细胞的生物学行为的影响，为Ad-hBMP-2和成骨细胞复合生物材料用于临床治疗骨缺损或整形用骨提供实验依据和理论指导。方法： 1．应用人胚肾293细胞作为包装细胞，扩增携带hBMP-... 详细信息

目的：检测 Ad-hBMP-2在体外环境下对成骨细胞的生物学行为的影响，为Ad-hBMP-2和成骨细胞复合生物材料用于临床治疗骨缺损或整形用骨提供实验依据和理论指导。方法： 1．应用人胚肾293细胞作为包装细胞，扩增携带hBMP-2表达片段的重组腺病毒载体Ad-hBMP-2，利用氯化铯密度梯度超速离心法对其进行纯化，应用50％感染量测定(infectious dose 50，ID)方法对纯化的病毒液进行病毒滴度测定。 2．以新生(出生后1-3天)新西兰大白兔颅骨骨膜培养出的成骨细胞为细胞模型，通过倒置相差显微镜观察、四唑盐比色法(MTT法)检测、碱性磷酸酶(Alkali phosphate，ALP)活性测定、免疫细胞化学测定、RT-PCR检测和茜素红染色等方法观察Ad-hBMP-2转染后的成骨细胞和对照组成骨细胞的形态、生长、增殖、成骨功能的差异。以期对Ad-hBMP-2在骨组织工程临床的广泛应用提供实验依据。结果： 1．本实验成功培养了293细胞，并扩增和纯化了Ad-hBMP-2，所得到的纯化的病毒滴度为1.58×10pfu/ml。 2．免疫细胞化学染色：5天时Ad-hBMP-2转基因组hBMP-2单克隆抗体染色，胞浆呈现棕黄色异染，即阳性。对照组(未转染组)呈现阴性。 ***-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，逆转录—聚合酶链式反应)结果：Ad-hBMP-2转染组细胞RT-PCR结果阳性，对照组RT-PCR结果

关键词：重组腺病毒骨形成蛋白2 成骨细胞 RT—PCR 细胞培养基因治疗