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蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2调节香烟提取物诱导的肺上皮间质转化

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中国药理学通报 2017年第12期33卷 1673-1678页

作者：沈辉娟蒋俊霞李芬芬谢强敏颜小锋浙江大学医学院附属第二医院药剂科浙江杭州310009 浙江大学医学院基础医学部浙江杭州310058

目的探索蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导肺上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的调节作用。方法采用Q-PCR法和ELISA法探究Shp2抑制剂PHPS1对CSE诱导的肺上皮细胞转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响;免疫荧光染色法检测EMT相关因子的表达;Western blot法检测p-Shp2/Shp2、p-Smad2/Smad2的蛋白水平。结果 CSE诱导肺上皮细胞Shp2的激活,导致TGF-β1分泌释放增加,进而引起E-钙黏蛋白表达下调,以及波纹蛋白和α-肌动蛋白表达上调,这些变化可被Shp2抑制剂PHPS1抑制。抑制Shp2活性或表达可抑制CSE诱导的Smad2的磷酸化。结论Shp2调节CSE诱导的肺上皮间质转化可能通过Shp2/Smad2信号途径,提示Shp2可能是治疗肺癌和慢性阻塞性肺病新靶点。

关键词：上皮间质转化转化生长因子β1 香烟提取物蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2 慢性阻塞性肺病肺癌

香烟提取物诱导牛冠状动脉内皮细胞损伤的机制

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环境与健康杂志 2008年第9期25卷 776-778,F0003页

作者：战威 SHEETS SM WONG L MARTINS-GREEN M CASIANO CA FLETCHER HM 天津医科大学公共卫生学院天津300070 美国罗马林达大学医学院微生物学与生物化学系美国加州大学里弗塞德分校细胞生物学与神经生物学系

目的通过观察香烟提取物对牛冠状动脉内皮细胞(BCAEC)的损伤作用,为研究吸烟与心血管疾病之间的关系提供依据。方法以吸烟者体内通常的尼古丁浓度为基准,分别用尼古丁、香烟主流烟雾提取物(MSW)和侧流烟雾提取物(SSW)对 BCAEC 进行染毒... 详细信息

目的通过观察香烟提取物对牛冠状动脉内皮细胞(BCAEC)的损伤作用,为研究吸烟与心血管疾病之间的关系提供依据。方法以吸烟者体内通常的尼古丁浓度为基准,分别用尼古丁、香烟主流烟雾提取物(MSW)和侧流烟雾提取物(SSW)对 BCAEC 进行染毒(尼古丁染毒终浓度分别为1×10^(-5)、0.8×10^(-5)、0.9×10^(-5)mol/L),用显微数码成像系统记录细胞形态变化,检测凋亡细胞与坏死细胞的发生比例,测定 caspase 酶活力。结果经尼古丁、MSW 处理的 BCAEC 形态上发生凋亡样变化,处理24 h 后凋亡细胞发生率为5.89%和11.94%。而 SSW 处理后的 BCAEC 呈坏死样变化.处理24 h 后62.84%的细胞发生坏死。尼古丁和 MSW 可诱导 caspase-3活力增高。结论香烟提取物可诱导牛冠状动脉内皮细胞损伤,MSW 可引起细胞凋亡,SSW 导致细胞坏死,caspase-3的激活可能是香烟提取物诱导牛冠状动脉内皮细胞凋亡的机制。

关键词：烟草烟污染香烟提取物尼古丁牛冠状动脉内皮细胞细胞损伤细胞凋亡细胞坏死

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香烟提取物对大鼠血管内皮细胞的损害

中国老年学杂志 2015年第5期35卷 1359-1361页

作者：朱涛李锋严飞刘正霍强新疆医科大学第一附属医院心脏外一科新疆乌鲁木齐830011 伊犁州友谊医院心血管介入科

目的探究香烟提取物(CSE)对大鼠血管内皮细胞(VEC)的影响。方法利用原代培养的方法获得大鼠主动脉VEC(RVEC),采用不同浓度的CSE处理RVEC,分别用MTT和流式细胞仪来检测三组细胞的增殖和凋亡情况,并检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放情况。同时... 详细信息

目的探究香烟提取物(CSE)对大鼠血管内皮细胞(VEC)的影响。方法利用原代培养的方法获得大鼠主动脉VEC(RVEC),采用不同浓度的CSE处理RVEC,分别用MTT和流式细胞仪来检测三组细胞的增殖和凋亡情况,并检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放情况。同时,采用双抗体夹心ELISA法检测细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF)-α、基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10的情况。结果 MTT实验中,与0.05%组相比,0.5%浓度组的细胞生长显著变慢(P<0.05),且这种抑制作用呈现剂量依赖性。LDH释放结果显示,与0.05%组相比,20%浓度的CSE处理可导致细胞LDH释放显著升高(P<0.01),且随着CSE浓度的进一步升高,LDH释放逐渐增多。经过24 h后,CSE处理后的细胞凋亡逐渐增多,差异明显(P<0.01)。而对于细胞分泌的TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10含量,CSE干预组均比对照组明显增加(P<0.01)。结论CSE可以明显抑制RVEC的生长,加剧其凋亡,并促进细胞分泌TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10的能力。

关键词：香烟提取物血管内皮细胞细胞增殖细胞凋亡肿瘤坏死因子α

香烟提取物对人脐静脉内皮细胞蛋白亚硝基化的影响及机制

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中国动脉硬化杂志 2016年第9期24卷 889-892,938页

作者：陈玉龙贾敏陕西省缺血性心血管疾病重点实验室西安医学院基础与转化医学研究所陕西省西安市710021

目的探讨香烟提取物(CSE)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)蛋白亚硝基化的影响。方法以HUVEC为体外模型,利用免疫荧光染色对细胞蛋白亚硝基化进行检测,并用生物素转化方法对荧光结果进行验证;利用Western blot对蛋白进行了检测;另外,在实验过... 详细信息

目的探讨香烟提取物(CSE)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)蛋白亚硝基化的影响。方法以HUVEC为体外模型,利用免疫荧光染色对细胞蛋白亚硝基化进行检测,并用生物素转化方法对荧光结果进行验证;利用Western blot对蛋白进行了检测;另外,在实验过程中,对超氧阴离子水平也进行了检测。结果不同浓度CSE(0.005%、0.01%、0.02%和0.04%)均能够明显减少蛋白的亚硝基化水平,且随着浓度增加,蛋白亚硝基化水平减少越明显。NO供体药物硝普钠(SNP)、内源性供体亚硝基谷胱甘肽(GSNO)、长效NO供体NO亲和复合体(NONOate)和NADPH氧化酶抑制剂加拿大麻素均能够恢复被CSE所导致的蛋白亚硝基化减少。另外,CSE能够增加超氧阴离子水平,这种作用能够被加拿大麻素所抑制。结论 CSE能够减少HUVEC蛋白亚硝基化水平。这种作用与其激活NDAPH氧化酶所引起的超氧阴离子积聚和NO产生通路的阻断有关。

关键词：香烟提取物人脐静脉内皮细胞超氧阴离子蛋白亚硝基化

香烟提取物促进人肺动脉平滑肌细胞增殖及其机制

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香烟提取物促进人肺动脉平滑肌细胞增殖及其机制

作者：王勋武汉大学

学位级别：硕士

目的:肺动脉高压是一种复杂的小肺动脉疾病,以持续性血管收缩,血管壁的增厚,血管改建和进展性肺动脉阻力的增加为特征,其病情发展可导致右心衰竭并最终导致死亡。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的异常增... 详细信息

目的:肺动脉高压是一种复杂的小肺动脉疾病,以持续性血管收缩,血管壁的增厚,血管改建和进展性肺动脉阻力的增加为特征,其病情发展可导致右心衰竭并最终导致死亡。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的异常增殖被认为是血管壁增厚,血管改建,动脉管腔狭窄的主要原因。最近的动物和人的实验研究均表明,除了缺氧外,吸烟可能对血管结构的变化产生直接的作用,致使发生肺动脉的改建进而发展为肺动脉高压。然而,这其中准确的机制尚不完全清楚。细胞内钙离子在调节血管平滑肌中扮演着重要的作用。细胞内钙离子的增加可以激活收缩蛋白,并引起收缩反应。细胞内钙离子浓度的增加主要依赖肌浆网(SR),电压门控钙通道(voltage-operated calcium channels,VOCC),和钙库操作性钙通道(store-operated calcium channel,SOCC)。近年来,SOCC 在血管平滑肌领域获得了极大的研究注意。SOCC是一种高度选择性的钙通道,其组分构成尚不完全清楚,且因细胞种类不同而异,目前已发现包括基质相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)家族、Orai、一过性受体电位非选择性阳离子通道(transient receptor potential non-selective cation channel,TRPC)家族。TRPC 是SOCC的重要组成部分,可以被G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体活化,是一种非选择性、Ca2+渗透性阳离子通道,有证明表明好几种TRPC通道充当SOCC的组成,然而,大部分证据都依赖于特定TRPC亚型的敲除或者siRNA的转染沉默,而非直接证明其在SOCC的功能。一个重要的研究发现是,特定亚型的TRPC的敲除可引起同等程度的SOCC活动和钙内流的抑制。一般来说,TRPC1,4和5对钙库的耗竭敏感,是SOCC的组成部分,TRPC3,6和7组成受体操作性钙通道(receptor-operated channels,ROCs),为 G 蛋白激酶 C 和甘油二酯提供门控。STIM家族主要包括两种亚型,STIM1和STIM2,有实验证明在HEK293细胞,STIM1被siRNA转染后的表达下调可抑制毒胡萝卜素引起的钙内流和毒蕈碱刺激诱导的钙电流,但是不改变剩余钙离子水平,膜电位。而STIM2的抑制则没有STIM1明显。STIM1氨基端的信号肽序列和跨膜部分表明蛋白的氨基端对应着细胞内基质和ER的管腔,所以STIM1可能充当钙离子感受器的作用,引起SOCE的活动。STIM1以介导非兴奋细胞的钙触发钙释放电流而作为其主要功能,同时,STIM1也被发现在内质网膜上充当感受器。在PASMC,SOCC主要由表达于内质网的钙离子感受器STIM1与表达于细胞膜的非选择性蛋白TRPC1是SOCC的重要组成部分。通过SOCC形成的操作性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE),近年来获得了极大地研究关注。尽管SOCE被发现已有20年,但SOCC的构成和功能一直存在争议。SOCE是一种重要的细胞程序,与许多细胞活动相关,如增殖、迁移、收缩等。之前有许多研究证明,不同类型的细胞内SOCE的阻断可抑制细胞增殖,而细胞增殖则与SOCE的增强有关。SOCE形成的典型细胞内信号转导途径如下:当胞内尤其是肌质网储存的Ca2+的耗竭时,内质网上的跨膜蛋白即钙离子感受器STIM1聚集成簇并脱离内质网结合位点,朝细胞膜移动,将成孔蛋白TRPC1活化,并形成STIM1—TRPC1复合体,导致Ca2+通道开放,进而形成SOCE。SOCE在PASMCs的增殖和迁移中扮演重要角色,SOCE的阻滞剂如Ni2+、SKF96365能明显减缓PASMC的增殖。细胞周期蛋白D1(cyclin D1)是cyclin家族中的重要成员,是细胞增殖程序重要的调节物质,在细胞增殖过程,cyclin D1可作为丝分裂的感受器,同时也能通过驱动目的细胞度过G1期以促进细胞增殖。作为一种协作癌基因,cyclin D1基因在恶性肿瘤患者频繁过表达,并且在肿瘤的发展、维持中起着十分重要的作用。有模型表示cyclin D1的过表达在细胞周期调控途径中可能充当驱动癌基因的角色。肿瘤生长阶段,可较早发现cyclin D1表达过剩。且近来越来越多的报道指出,cyclin D1是与肺动脉高压相关的重要的下游媒介,可通过促进PASMCs增殖的方式参与肺动脉血管的重塑。基于以上证据,我们假设吸烟促进PASMCs增殖的机制为:吸烟诱导PASMC的SOCC表达的上调(SOCE的增强),接着SOCE的增强引起下游的cyclin D1表达增加来促进细胞增殖。本实验将就此假设研究

关键词：香烟提取物人肺动脉平滑肌细胞钙库操作性钙电流细胞周期蛋白D1

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香烟提取物诱导肺上皮细胞凋亡的机制研究

香烟提取物诱导肺上皮细胞凋亡的机制研究

作者：杨新富浙江大学

学位级别：硕士

研究背景和研究目的：吸烟是慢性阻塞性肺部疾病(COPD)主要致病因素之一。香烟烟雾中所含活性氧(ROS)引起的氧化应激会进一步导致COPD的发展。肺上皮屏障是肺抵抗外界环境的第一道防御系统。香烟烟雾可以诱导肺上细胞的损伤和凋亡,但是... 详细信息

研究背景和研究目的：吸烟是慢性阻塞性肺部疾病(COPD)主要致病因素之一。香烟烟雾中所含活性氧(ROS)引起的氧化应激会进一步导致COPD的发展。肺上皮屏障是肺抵抗外界环境的第一道防御系统。香烟烟雾可以诱导肺上细胞的损伤和凋亡,但是其机制目前并不十分清楚。我们的研究意在探讨香烟提取物诱导肺上皮细胞凋亡的分子机制。方法：香烟提取物(CSE)刺激人肺上皮细胞株(BEAS-2B),构建细胞凋亡模型。用MTT法检测CSE对细胞的毒性;采用流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧(ROS)表达水平;Western blot方法检测CSE对BEAS-2B中凋亡信号调节激酶-1(ASK-1)、 C-Jun氨基端激酶(JNK)、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)等信号通路激活的影响;采用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和p38 siRNA预处理细胞,研究ROS对下游信号通路的调节作用。结果：1)CSE可浓度依赖性抑制BEAS-2B细胞活性,诱导细胞凋亡。2)CSE可浓度依赖性诱导BEAS-2B细胞内ROS的产生;抗氧化剂NAC(5 mM)可显著抑制CSE诱导ROS产生和BEAS-2B细胞凋亡。3)在BEAS-2B细胞中,CSE可浓度依赖性激活ASK-1、p38 MAPK、JN K通路;抗氧化剂NAC可浓度依赖性抑制CSE诱导的ASK-1、p38 MAPK、JNK通路的激活。4)P38基因沉默后能显著抑制CSE诱导的BEAS-2B细胞凋亡。5)CSE可浓度依赖性诱导BEAS-2B细胞内核因子相关因子2(Nrf-2)的表达;抗氧化剂NAC(10mM)可显著抑制CSE诱导的Nrf-2表达;p38 MAPK抑制剂SB203580和p38 MAPK基因沉默均可显著抑制CSE诱导的Nrf-2表达。结论：1)CSE可诱导BEAS-2B细胞内ROS的产生,ROS通过调节下游ASK-14P98 MAPK信号通路导致细胞凋亡。2)ROS及其下游ASK-1/p38 MAPK信号通路也可调节CSE诱导的BEAS-2 B细胞内Nrf-2的激活。

关键词：凋亡肺上皮细胞香烟提取物 Nrf-2 氧化应激 p38 MAPK

香烟提取物及辛伐他汀对血管内皮细胞纤溶平衡的影响

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香烟提取物及辛伐他汀对血管内皮细胞纤溶平衡的影响

作者：马瑜慧山西医科大学

学位级别：硕士

研究背景:吸烟作为呼吸系统疾病的一个常见危险因素,大多数研究都集中在气道上。研究发现,吸烟可以引起血管内皮的损伤,而内皮损伤是肺血管病、冠心病等多种疾病的重要因素,因此,研究吸烟与肺血管病的发生有重要意义。正常人体血液中存... 详细信息

研究背景:吸烟作为呼吸系统疾病的一个常见危险因素,大多数研究都集中在气道上。研究发现,吸烟可以引起血管内皮的损伤,而内皮损伤是肺血管病、冠心病等多种疾病的重要因素,因此,研究吸烟与肺血管病的发生有重要意义。正常人体血液中存在着凝血与纤溶两个系统,它们的平衡状态可以维持血流正常发挥作用。无论是凝血系统的激活还是纤溶系统的失活都可以引发血栓的形成。其中,组织型纤溶酶原激活物（t-PA）和纤溶酶原抑制物-1（PAI-1）作为纤溶系统的主要成分,它们的表达决定着纤溶系统的功能。多种因素可影响血管内皮细胞的纤溶活性,但研究香烟烟雾对血管内皮细胞纤溶活性的直接作用报道不多见。辛伐他汀（Simvastatin）作为一种新型的他汀类降脂药,近年来发现,其功能具有多效性,如保护内皮细胞、抑制炎症、抗凝等作用,而且对炎症因子介导的纤溶活性降低也有显著的改善作用。但辛伐他汀是否可以改善由香烟提取物（CSE）引起内皮细胞纤溶功能的降低,报道尚不多见。目的:研究不同条件下CSE对血管内皮细胞t-PA及PAI-1产生的影响,同时用CSE刺激经辛伐他汀预处理过的血管内皮细胞,并测定其t-PA、PAI-1蛋白和mRNA的表达,从纤溶系统方面来探讨吸烟与血栓形成的关系,进而从实验微环境角度证实吸烟可以损伤内皮细胞的纤溶功能,而辛伐他汀对吸烟所致内皮细胞纤溶功能的损害具有一定的保护作用。方法:在无菌条件下,选取健康产妇足月分娩的新生儿脐带,消化、分离、培养其内皮细胞（HUVECs）,实验分为两部分:（1）不同条件下（不同浓度及不同时间点）CSE对血管内皮细胞纤溶平衡的影响:选用第4代代HUVECs,接种于24孔培养板中,分为三组:①对照组;②不同浓度（5%、10%、20%）同一时间点CSE组:6h后收集各组细胞上清液;③同一浓度不同时间点CSE组:5%CSE刺激HUVECs,于不同时间点（4h、6h、8h、12h、24h）分别收集细胞上清液,采川酶联免疫吸附双抗体夹心分析（ELISA）法测定各组上清液中t-PA和PAI-1的抗原浓度;（2）CSE对经辛伐他汀预处理的血管内皮细胞纤溶平衡的影响:选用第4代代HUVECs,接种于24孔培养板中,分为对照组、5%CSE组及5%CSE+辛伐他汀组,培养24h后收集各组的细胞及上清液,采用ELISA检测各组上清液中t-PA和PAI-1的蛋白含量,反转录聚合链链反应（RT-PCR）法检测各组细胞t-PA和PAl-1mRNA的表达。结果:（1）CSE对内皮细胞纤平衡的影响:与对照组相比,不同浓度（5%、10%、20%）同一时间点CSE组中,6h后各浓度CSE组PAI-1含量均显著增高（P0.05）。结论:（1）CSE可以损伤血管内皮细胞,抑制其纤溶活性,从而增加血栓病的发生;（2）辛伐他汀对CSE所致的内皮细胞纤溶功能障碍具有一定的保护作用。

关键词：香烟提取物组织型纤溶酶原激活物纤溶酶原激活物抑制物-1 人脐静脉内皮细胞辛伐他汀

香烟提取物对肺间质纤维化的影响机制以及还原型谷胱甘肽的干预作用

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香烟提取物对肺间质纤维化的影响机制以及还原型谷胱甘肽的干预作...

作者：李晓玲河北医科大学

学位级别：硕士

目的：香烟烟雾中含有多种有害化学物质，是多种疾病的主要诱因之一，而且被公认为是引起肺间质纤维化的重要危险因素。香烟烟雾中的氧化剂和自由基可通过多种途径产生氧化应激，大量证据表明氧化应激在肺间质纤维化的发病机制中扮演着... 详细信息

目的：香烟烟雾中含有多种有害化学物质，是多种疾病的主要诱因之一，而且被公认为是引起肺间质纤维化的重要危险因素。香烟烟雾中的氧化剂和自由基可通过多种途径产生氧化应激，大量证据表明氧化应激在肺间质纤维化的发病机制中扮演着重要的角色，无论是在急性发作期还是缓解期，病人均存在氧化／抗氧化失衡，然而其分子机制尚不清楚。在临床上肺间质纤维化尚无特效的治疗方法，近来抗氧化治疗引起许多学者关注，研究显示还原性谷胱甘肽（GSH）是机体内重要的还原剂，具有抗氧化作用，可清除自由基及其他活性氧簇，保护肺组织免受氧化损伤。因此本实验就以肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞为模型，用不同浓度香烟提取物(cigarette smoke extract，CSE)刺激体外培养的A549细胞，观察细胞生长的形态学改变及增殖抑制情况。通过检测细胞上清液中各项氧化指标及反应纤维化程度的指标，来探讨吸烟对肺间质纤维化影响的可能机制以及还原型谷胱甘肽对吸烟引起的肺间质纤维化是否有逆转作用。方法：体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞，取对数生长期的细胞进行试验。参照Carp and Janoff[1]的方法，通过特殊装置制备香烟提取物。抽吸2支去过滤烟嘴的香烟，把烟雾融入不含血清1640培养基中，调整PH值，并除去细菌和大颗粒，然后稀释至不同的浓度，30min中内用于试验。本实验首先尝试应用0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%浓度的香烟提取物培养液培养细胞，采用MTT法测定细胞活力，通过相差显微镜观察CSE对细胞增殖形态的影响。依据其结果选定合适的浓度进行实验分组。实验分为空白对照组、2.5%CSE组、5%CSE组、7.5%CSE组，7.5%CSE+GSH组(GSH1mmol/L).分别收集空白对照组和各干预组细胞培养24h小时后的上清液，应用比色分析法测细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛（MDA）含量，ELISA法检测细胞上清液中转化生长因子1(TGF-β1)的水平。结果：1倒置显微镜下观察A549细胞在不同浓度CSE作用下形态学变化倒置显微镜拍摄结果显示CSE作用后A549细胞生长密度减低，细胞之间空隙加大，漂浮细胞增多，贴壁细胞也呈回缩变圆的态势，出现萎缩，与对照组的细胞形态区别明显。2不同浓度CSE对A549细胞的生长抑制作用通过MTT比色法检测，CSE对体外培养的A549细胞有较强的增殖抑制作用，抑制作用呈剂量和时间依赖性。相同浓度香烟提取物不同时间（12、24、36h）作用后，随作用时间的延长其抑制率增大，差异有统计学意义(P香烟提取物作用后，随着浓度的增高其抑制率增大，差异有统计学意义(P香烟提取物可抑制肺泡上皮细胞的生长，抑制作用呈剂量和时间依赖性。2香烟提取物可诱导肺泡上皮细胞分泌TGF-β1、MDA，使SOD活性下降，从而引起其氧化损伤及损伤后细胞修复变化。3还原型谷胱甘肽可以使CSE刺激后的A549细胞产生的MDA、TGF-β1减少，SOD增加，对吸烟引起的氧化损伤有一定逆转作用。

关键词：香烟提取物肺间质纤维化还原型谷胱甘肽(GSH) 丙二醛(MDA) 转化生长因子β1(TGF-β1) 超氧化物歧化酶(SOD)

香烟提取物对巨噬细胞功能损伤及相关机制的研究

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香烟提取物对巨噬细胞功能损伤及相关机制的研究

作者：袁风娇南京大学

学位级别：硕士

吸烟是当今危害人类健康的一个重要因素,是各种肺部疾病发生、发展和恶化的主要诱因,免疫系统损伤在疾病中发挥重要作用,本论文主要研究吸烟对巨噬细胞功能的损伤及其机制,初步探讨巨噬细胞在吸烟导致的疾病中的重要作用。第一部分主... 详细信息

吸烟是当今危害人类健康的一个重要因素,是各种肺部疾病发生、发展和恶化的主要诱因,免疫系统损伤在疾病中发挥重要作用,本论文主要研究吸烟对巨噬细胞功能的损伤及其机制,初步探讨巨噬细胞在吸烟导致的疾病中的重要作用。第一部分主要为香烟提取物(CSE)对小鼠巨噬细胞系Ana-1细胞的毒性影响。结果显示,CSE作用12h可以显著抑制Ana-1细胞增殖,诱导Ana-1细胞凋亡,同时导致LDH大量释放、线粒体膜电位下降;同时,CSE抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进促凋亡蛋白Bax和Bad的表达。此外还发现,低浓度(15%)或长时间(≥12h)的CSE刺激细胞内ROS水平显著上升,抗氧化酶活性降低,细胞核内NF-κBP65和p50蛋白表达水平降低。在CSE加入前1h预先用10μMNF-κB的抑制剂PDTC处理Ana-1细胞,结果显示,细胞凋亡的数量增多。这些结果表明,CSE导致巨噬细胞凋亡归结于诱导产生氧化应激,使氧化和抗氧化不平衡,导致线粒体损伤并抑制NF-κB活性。总之,在低浓度/短时间的CSE刺激下,巨噬细胞抗凋亡机制起主导作用,而高浓度/长时间的CSE刺激,激活了巨噬细胞凋亡途径。第二部分主要为香烟提取物对巨噬细胞M2型极化的诱导及其机制研究。鉴于低浓度的CSE不引起巨噬细胞凋亡,我们进一步从体外和体内两方面探讨低浓度吸烟对巨噬细胞的作用。采用浓度低于4%的CSE作用Ana-1巨噬细胞,采用流式细胞术检测细胞内ROS水平、细胞吞噬能力和细胞表面分子CD163和MHC-Ⅱ的表达水平,采用半定量RT-PCR和ELISA方法检测相关细胞因子的表达水平,并用Western Blotting法检测细胞内p-JAK2和p-STAT3的水平,以及NF-κBp65和p50分别在胞浆和胞核中的蛋白水平。结果显示,CSE作用后Ana-1细胞内ROS水平显著降低、吞噬能力减弱、NO释放量减少;细胞表面M1型标记分子MHC-Ⅱ的水平降低以及相关细胞因子TNF-α、IL-12p40和iNOS表达降低;M2型标记分子CD163的表达显著升高以及相关细胞因子IL-10、TGF-β1和TGF-β2表达升高。并且,CSE促进巨噬细胞p-STAT3和p-JAK2的表达,促进NF-KBp65和NF-KBp50在细胞浆中的表达,同时抑制细胞核内NF-KBp65的表达,促进细胞核内NF-KBp50的表达;STAT3的磷酸化抑制剂可以促进吸烟诱导的IL-12p40的mRNA表达,而抑制吸烟诱导的IL-10mRNA表达。采用BALB/c小鼠原代巨噬细胞验证上述结果。小鼠肺泡巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞(MBMDMs)经CSE(<2%浓度)作用3天后,流式细胞术检测M2型细胞表面分子CD163的表达水平,ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子的水平。结果显示,三种巨噬细胞的CD163表达水平均显著升高,M1型相关细胞因子有下降的趋势,M2型细胞因子表达有升高趋势。进一步采用BALB/c小鼠吸烟实验验证吸烟对M2型巨噬细胞的诱导作用,结果显示小鼠吸烟6天后肺泡巨噬细胞CD163表达水平显著升高,证实吸烟可诱导巨噬细胞向M2型转化,与体外实验结果一致。因此,本研究发现吸烟可以诱导巨噬细胞向M2型转变,其机制可能与JAK2/STAT3信号通路的激活和NF-κB信号通路的抑制有关。

关键词：巨噬细胞香烟提取物凋亡线粒体膜电位氧化应激 NF-κBp65 NF-κBp50 CD163 细胞因子 M2极化 p-JAK2 p-STAT3