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环境科学 2020年第8期41卷 3781-3786页

作者：宁雪梁金松柏耀辉廖恺玲俐刘会娟曲久辉清华大学水质与水生态研究中心北京100084 中国科学院生态环境研究中心饮用水科学与技术重点实验室北京100085 生态环境部对外合作与交流中心北京100035

锰氧化微生物的催化作用能将二价锰的氧化速率提高几个数量级,影响自然界锰元素的价态变化和归趋.以往研究大都关注锰氧化单一菌株,而笔者前期研究揭示了两株细菌(Sphingopyxis ***-31和Arthrobacter ***-31)的种间相互作用能够触发Arth... 详细信息

锰氧化微生物的催化作用能将二价锰的氧化速率提高几个数量级,影响自然界锰元素的价态变化和归趋.以往研究大都关注锰氧化单一菌株,而笔者前期研究揭示了两株细菌(Sphingopyxis ***-31和Arthrobacter ***-31)的种间相互作用能够触发Arthrobacter ***-31产生锰氧化活性.为了进一步揭示其发生的普适性、机制及潜在工程应用,以另外3种Sphingopyxis菌株为研究对象,采用纯培养、比较基因组学和转录组分析等研究手段,发现其中1株菌也能触发Arthrobacter ***-31产生锰氧化活性,表明微生物种间相互作用触发锰氧化具有一定的广泛性.进一步筛选了可能参与菌株相互作用的基因,发现Sphingopyxis的抗生素合成基因转录水平普遍上升,表明其可能参与了触发Arthrobacter ***-31产生锰氧化活性.基于以上发现,最终在反应器中验证了利用微生物种间相互作用强化二价锰氧化去除的可行性.

关键词：微生物种间相互作用锰氧化节杆菌鞘氨醇盒菌生物强化

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一株氰氟草酯降解新菌株Sphingopyxis ***9的分离鉴定及降解特性

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应用与环境生物学报 2019年第6期25卷 1464-1469页

作者：侯颖裴韬王维宇尤晓颜牛明福黄天晨河南科技大学食品与生物工程学院

氰氟草酯是应用于稻田的一种除草剂,其广泛使用给水生生态带来了一定威胁.利用连续富集培养的方法,从农药厂活性污泥中筛选出一株氰氟草酯高效降解菌WP9.采用16S rRNA基因序列分析并结合菌落菌体形态和生理生化特性,将菌株WP9鉴定为鞘... 详细信息

氰氟草酯是应用于稻田的一种除草剂,其广泛使用给水生生态带来了一定威胁.利用连续富集培养的方法,从农药厂活性污泥中筛选出一株氰氟草酯高效降解菌WP9.采用16S rRNA基因序列分析并结合菌落菌体形态和生理生化特性,将菌株WP9鉴定为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis).在以100 mg/L氰氟草酯为唯一碳源的无机盐培养基中,菌株WP9在120 h内可将其降解97.03%.菌株WP9降解炔草酯的最适温度和pH分别为30℃和7.0;当菌株WP9的接种量≥5%时,其对100 mg/L氰氟草酯的降解效果较好;当氰氟草酯浓度≤100 mg/L时,菌株WP9对氰氟草酯的平均降解速率随着底物浓度的增加而呈指数增长.通过超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)鉴定降解产物为氰氟草酸和氰氟草酚,推测氰氟草酯首先通过酯键水解生成氰氟草酸,然后氰氟草酸通过醚键水解生成氰氟草酚.本研究关于鞘氨醇盒菌对氰氟草酯降解的报道结果,可为开展氰氟草酯污染环境的生物修复提供新菌种和理论基础.(图8参30)

关键词：氰氟草酯鞘氨醇盒菌分离鉴定降解特性

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一株伏马毒素降解菌的筛选与鉴定

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中国粮油学报 2017年第4期32卷 110-115页

作者：杨朋飞常晓娇伍松陵王峻王楠希屈凌波孙长坡河南工业大学生物工程学院郑州450001 国家粮食局科学研究院北京100037 河南工业大学粮油食品学院郑州450001

以伏马毒素FB_1为唯一碳源,采用富集培养法从污泥样品中分离到1株高效降解FB_1的菌株。经高效液相色谱(HPLC)法检测,该菌在液体无机盐培养基(MSM)中对FB_1有良好的削减能力,5 d内可将25μg的FB_1完全降解。通过对该菌的16S rDNA序列进... 详细信息

以伏马毒素FB_1为唯一碳源,采用富集培养法从污泥样品中分离到1株高效降解FB_1的菌株。经高效液相色谱(HPLC)法检测,该菌在液体无机盐培养基(MSM)中对FB_1有良好的削减能力,5 d内可将25μg的FB_1完全降解。通过对该菌的16S rDNA序列进行同源性分析,并结合生理生化试验,最终鉴定为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis sp.),命名为ASAG22。ASAG22细胞内产生的活性物质将FB_1降解为4种质荷比分别为406.352 7、288.209 9、264.182 7和220.156 9的新物质,且该活性物质经蛋白酶K处理而失去活性。

关键词：伏马毒素鞘氨醇盒菌生物降解

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伏马菌素B1降解菌的分离鉴定、降解特性及初步应用研究

伏马菌素B1降解菌的分离鉴定、降解特性及初步应用研究

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作者：高红侠淮阴工学院

学位级别：硕士

伏马菌素是玉米等农作物中常见的镰刀菌毒素,主要分为11种类型,其中伏马菌素B污染最普遍,危害最大,于1993年被国际癌症机构列为2B类致癌物质。FB结构较为稳定,可引起多种人畜病害,对神经、器官以及免疫系统具有较强的毒性。物理与化学... 详细信息

伏马菌素是玉米等农作物中常见的镰刀菌毒素,主要分为11种类型,其中伏马菌素B污染最普遍,危害最大,于1993年被国际癌症机构列为2B类致癌物质。FB结构较为稳定,可引起多种人畜病害,对神经、器官以及免疫系统具有较强的毒性。物理与化学消减毒素的方法,不但会造成化学药剂的残留,还会引起农作物与饲料品质的损失。采用生物技术的手段控制粮食与饲料中毒素的污染已成为近年来FB脱毒技术的研究热点。本实验对FB的微生物降解进行研究,主要包括以下研究内容:采用富集培养的筛菌方法,以FB为唯一碳源,从土壤中筛选得到一株FB降解菌。对该菌进行形态观察、分子鉴定与生理生化实验,确定该菌株为鞘氨醇盒菌属（Sphingopyxis sp.）,并命名为L11。在无机盐培养基中,L11在30℃的条件下,3 d内可将5 m L培养基中的30μg FB完全降解。菌株的最适生长温度为35℃,最适生长p H为6.0～7.0。在所选的碳源与氮源中,最适宜菌株生长的碳源、氮源分别为麦芽糖与碳酸氢铵。菌株降解FB的最适p H为7.0,最适温度为25～30℃,此条件下菌株L11在48 h内可降解MSM培养基中87.88%的FB。培养基中FB的浓度增加至15μg/m L会提高降解菌对FB的降解率,超过此浓度,L11对FB的降解率随浓度增加而降低。金属离子Mg、Ca或Mn能够提高L11对FB的降解效果。降解菌L11中,降解FB的活性物质是一种位于细胞内的降解蛋白。以Sphingopyxis ***144中的fum D基因为参考设计引物,将L11的全基因组DNA作为模板,从L11中PCR扩增获得了FB降解基因gfd,并构建重组质粒p ET29a-gfd、p GEX-gfd,将重组质粒分别导入*** BL21（DE3）、*** Shuffle（T7）、*** Rosseta（DE3）感受态细胞中进行外源表达。通过优化诱导剂IPTG浓度、表达温度、表达载体和表达宿主等条件,确定FB降解基因gfd在18℃、IPTG浓度为0.1 m M,表达载体为p GEX,表达宿主为*** Shuffle（T7）时,可溶性表达效果最好。酶学特性实验结果表明,FB降解酶GFD的最适降解温度为35～40℃,最适反应p H为6.0～7.0。为了能够实现FB降解基因gfd在枯草芽孢杆菌中的表达,成功构建了重组枯草芽孢杆菌WB800-p AX01-P-apr E-gfd,重组表达后的培养液上清中有大量重组蛋白,FB降解酶的可溶性得到极大程度提高。将重组菌应用于FB污染的DDGS中,可以有效降解FB,且在40℃条件下,对DDGS中FB的降解率最高。

关键词：伏马菌素B1 鞘氨醇盒菌降解基因表达

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伏马毒素降解菌的分离鉴定与降解特性及机理研究

伏马毒素降解菌的分离鉴定与降解特性及机理研究

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作者：胡俊强南京农业大学

学位级别：硕士

伏马毒素是一类由镰刀菌在一定温度、湿度条件下产生的水溶性次级代谢产物,主要污染玉米及其制品。伏马毒素能引起猪肺水肿和马脑白质软化症等疾病,人类的食管癌和神经管缺陷也与其密切相关,严重威胁人畜健康。近年来关于生物法控制粮... 详细信息

伏马毒素是一类由镰刀菌在一定温度、湿度条件下产生的水溶性次级代谢产物,主要污染玉米及其制品。伏马毒素能引起猪肺水肿和马脑白质软化症等疾病,人类的食管癌和神经管缺陷也与其密切相关,严重威胁人畜健康。近年来关于生物法控制粮食和饲料中的霉菌毒素已成为研究热点。本文对伏马毒素B1(FB1)的制备和FB1降解菌进行了研究,主要包括以下研究内容:伏马毒素的制备、分离与纯化:在灭菌大米中接种高产毒镰刀菌,制备毒素基质。选用XAD-2大孔吸附树脂初步净化毒素提取液,通过调节温度、pH、溶液浓度优化吸附条件。筛选合适的溶剂体系,利用高速逆流色谱分离纯化获得大量的FB1和伏马毒素B3(FB3)。制备的毒素经质谱检测结合核磁共振进行定性分析,经高效液相色谱检测结合称重法进行定量分析。结果表明,利用大孔吸附树脂联合高速逆流色谱单次可制备124 mg FB1和47 mg FB3,纯度分别可达96.8%和95.6%,总回收率为75%。本方法制备量大、成本低,制备获得的FB1为降解菌的筛选提供了物质基础。以FB1为唯一碳源,从土壤中分离得到一株FB1高效降解菌FDS-1。通过形态学观察、生理生化实验和16S rRNA序列分析,鉴定为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis sp.)。FDS-1的最适生长温度为30℃,最适生长pH为8.0,在无机盐培养基中,FDS-1的最适降解温度为25℃,最适降解pH范围为8.0～9.0。该菌株FB1降解活性物质分布于细胞内部。以FDS-1全基因组为模板,克隆获得两段FB1降解酶基因fumD和fumI。将获得的两段基因插入pET29A载体后转化至*** BL21中构建重组大肠杆菌,通过IPTG诱导重组大肠杆菌表达降解酶基因,表达产物均为无活性的包涵体沉淀,以高浓度尿素溶解包涵体,镍柱纯化后通过梯度透析复性降解酶。结果表明,FD酶的分子量为58 kDa,最适降解温度为30℃～40℃,最适降解pH范围是5.0～9.0;FI酶的分子量为48kDa,最适降解温度为40℃,最适降解pH为8.0～9.0,两种酶的热稳定性较差,60℃时均会丧失生物学活性。把FD酶和FI酶作用后的FB1的降解产物进行质谱分析,获得降解产物的结构,初步推断FB1经FD酶降解后形成水解伏马毒素B1(HFB1),HFB1经FI酶作用后转化为2-酮基-HFB1,但FI酶不能直接降解FB1。将融合信号肽(AprE、NprE、SacB)的目的基因插入pAX01载体构建重组质粒,利用化学法将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞,成功构建重组芽孢杆菌。其中fumD基因在芽孢杆菌中成功表达,fuml基因未能分泌表达。对不同时间节点FD降解酶的活性进行检测。结果表明,FD降解酶酶活在24 h时达到最高,且三种信号肽对FD降解酶的分泌量无显著影响。

关键词：伏马毒素高速逆流色谱鞘氨醇盒菌降解机制

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伏马毒素降解菌的机制解析及降解酶基因的克隆

伏马毒素降解菌的机制解析及降解酶基因的克隆

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作者：杨朋飞河南工业大学

学位级别：硕士

伏马毒素(Fumonisins,FB)是一类由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等镰刀菌属(Fusarium spp.)在特定条件下产生的水溶性次级代谢产物,是一种污染分布较为普遍的真菌毒素。产毒菌侵染玉米和小麦等... 详细信息

伏马毒素(Fumonisins,FB)是一类由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等镰刀菌属(Fusarium spp.)在特定条件下产生的水溶性次级代谢产物,是一种污染分布较为普遍的真菌毒素。产毒菌侵染玉米和小麦等粮食作物不仅造成粮食减产,伏马毒素随着食品链条传递还严重危害人畜健康。近年来关于如何脱除粮油及其制成品中的伏马毒素已成为研究热点。本研究以筛选到的伏马毒素高效降解菌为研究对象,通过质谱分析等手段,解析了该菌株对伏马毒素的降解机制,进一步采用分子生物学手段,克隆获得了伏马毒素的相关基因,并通过构建工程菌使降解酶成功表达;通过HPLC和LC-MS解析降解酶对FB的降解产物,进一步确证该菌株对伏马毒素的降解机理。研究结果如下:以伏马毒素FB为唯一碳源,筛选获得一株伏马毒素高效降解菌,该菌在30℃,220 r/min条件下,培养5 d可将25μg(50μg/mL)的FB完全降解。通过对该菌株的形态观察,生理生化特征分析,并结合16S rRNA序列分析,该菌株被鉴定为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis sp.),命名为ASAG22。以ASAG22菌株的基因组DNA为模板,通过PCR方法克隆出两段大小分别为1620 bp和1266 bp的伏马毒素降解酶基因序列,导入大肠杆菌的表达载体中,成功构建了工程菌YD和YI。通过对工程菌进行诱导,降解酶成功表达,通过纯化进行SDS-PAGE和Western Blot分析,结果表明,YD酶和YI酶大小分别为53 KD和48 KD,大小均与理论值一致。对菌株ASAG22降解FB的机理初步研究表明:菌株对FB的降解源于细菌产生的细胞内活性物质,且该活性物质经蛋白酶K处理后对FB的降解能力明显降低。对FB的降解产物进行质谱分析,发现FB降解为质荷比分别为406.3527、288.2099、264.1827和220.1569等高丰度新物质。用HPLC法研究纯化酶对FB的降解表明:YD酶可将FB完全降解,并产生一种新物质HFB。YI酶不能降解FB,但YI酶与10 mM丙酮酸共同作用可将HFB完全降解。酶解产物进行LC-MS解析发现,HFB为单一的质荷比为406.3527的物质,HFB经YI酶和丙酮酸的作用后转化为质荷比为405.3233(2-keto-HFB)和448.3643(2-acetamide-HFB)的物质。根据HPLC和LC-MS的检测结果可以推断:FB经YD酶处理,脱去2分子丙三羧酸生成HFB,HFB经YI酶和丙酮酸共同作用,使HFB上的氨基发生氧化生成2-keto-HFB,发生乙酰化生成2-acetamide-HFB,其中2-keto-HFB为无毒产物。

关键词：伏马毒素鞘氨醇盒菌基因克隆降解机理高效液相色谱飞行时间质谱

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