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筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4b慢病毒L02稳定株差异表达基因和基因通路

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中南大学学报（医学版） 2014年第2期39卷 117-123页

作者：蒋孝华谢玉桃蔡亚平雷创江波彭花中南大学湘雅医院感染科长沙410087 南华大学附属第一医院感染科湖南衡阳421001 南华大学流行病学教研室湖南衡阳421001

目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)1b型非结构蛋白4b(nonstructural protein 4b,NS4b)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4b差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4b在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据。方... 详细信息

目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)1b型非结构蛋白4b(nonstructural protein 4b,NS4b)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4b差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4b在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据。方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4b和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2-mkate2复苏扩增;应用Human Gene 1.0ST芯片筛选出LO2-NS4b与LO2-mkate2差异表达基因。基于京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行显著性分析。应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶Cδ结合蛋白(protein kinase C delta binding protein,PRKCDbP)基因、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列(baculoviral IAP repeat containing 3,bIRC3)基因和b细胞淋巴瘤2样1基因(b-cell lymphoma 2-like1,bCL2L1)的mRNA水平。结果:以LO2-NS4b与LO2-mkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4b中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上调和1 236个基因表达下调。上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通路、Wnt信号通路和细胞周期通路等。Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一致,分别是AKT1,bIRC3和bCL2L1,吻合率为60%。结论:HCV NS4b可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和细胞增殖等有关的多种基因表达,主要影响与细胞凋亡、细胞周期和癌症相关的信号转导通路。

关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白4b 基因芯片慢病毒

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丙型肝炎病毒非结构蛋白4b研究进展

国外医学（病毒学分册） 2003年第1期10卷 10-13页

作者：王建军刘妍成军解放军第三零二医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4 b(NS4 b)是至今为止功能尚不明确的 HCV非结构蛋白 ,近年来的研究表明其定位于内质网膜 ,与细胞内膜结构的功能有关。在体外实验中 ,它和 NS4 A一起可以抑制宿主细胞的翻译 ;在一定程度上可以减弱机体... 详细信息

丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4 b(NS4 b)是至今为止功能尚不明确的 HCV非结构蛋白 ,近年来的研究表明其定位于内质网膜 ,与细胞内膜结构的功能有关。在体外实验中 ,它和 NS4 A一起可以抑制宿主细胞的翻译 ;在一定程度上可以减弱机体对抗病毒药物干扰素 -α(INF-α)的反应 ,同时使病毒可以逃避宿主对病毒的免疫 ;在 HCV病毒的致瘤性方面亦有重要作用。可以与 NS3、NS4 A、NS5 A、NS5 b等相互作用 ,对其它非结构蛋白的功能起协同、促进甚或是下调作用。

关键词：基因定位亚细胞定位丙型肝炎病毒非结构蛋白4b 研究进展

NF2基因在丙肝病毒非结构蛋白4b调节细胞周期中的作用

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基础医学与临床 2019年第9期39卷 1289-1293页

作者：张战锋谢在春庞志宇陈久凯周迎春广州中医药大学第一附属医院检验科

目的在HEPG2细胞内观察丙肝病毒(HCV)非结构蛋白4b(NS4b)对神经纤维瘤病Ⅱ型(NF2)基因的影响及NF2在NS4b调节细胞周期中的作用。方法将细胞分为多组,其中3组对照,分别为无处理组、pCDNA3.1空质粒组和si-NF2 control组;3组作用组,分别为N... 详细信息

目的在HEPG2细胞内观察丙肝病毒(HCV)非结构蛋白4b(NS4b)对神经纤维瘤病Ⅱ型(NF2)基因的影响及NF2在NS4b调节细胞周期中的作用。方法将细胞分为多组,其中3组对照,分别为无处理组、pCDNA3.1空质粒组和si-NF2 control组;3组作用组,分别为NS4b质粒组、NF2质粒组和si-NF2沉默基因组。每组经过转染、培养后收获细胞;RT-qPCR和Western blot检测细胞内相应基因转录及表达;流式细胞仪检测细胞周期。结果NS4b可降低NF2转录水平(P4b的高表达和NF2的低表达对细胞周期具有相似的作用,及促进细胞周期向S期的转变;而NF2的高表达则使细胞周期停滞在G 0/G 1。结论NS4b对NF2具有一定的调控作用,NF2可能参与NS4b调控细胞周期机制。

关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白4b 神经纤维瘤病Ⅱ型基因细胞周期

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丙型肝炎病毒非结构蛋白4b的研究进展

泸州医学院学报 2006年第4期29卷 369-371页

作者：陈霞李昌平泸州医学院附属医院消化内科四川泸州646000

丙型肝炎(HCV)为全球流行性疾病,据估计全球HCV感染者超过1亿人.每年受HCV新感染者在100万以上.HCV是一个单股正链RNA,属黄病毒科,编码约9600个核苷酸,可分为5'末端、3'末端和位于两个末端之间的约9400个核苷酸的开放读码框,编码由3010... 详细信息

丙型肝炎(HCV)为全球流行性疾病,据估计全球HCV感染者超过1亿人.每年受HCV新感染者在100万以上.HCV是一个单股正链RNA,属黄病毒科,编码约9600个核苷酸,可分为5'末端、3'末端和位于两个末端之间的约9400个核苷酸的开放读码框,编码由3010或3011个氨基酸组成的前蛋白多肽.

关键词：非结构蛋白4b 丙型肝炎病毒 NS3蛋白酶氨基酸组成丝氨酸蛋白酶单股正链RNA NS4b NS4A NS5A NS5b

筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4b转染细胞差异表达基因

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世界华人消化杂志 2004年第10期12卷 2316-2320页

作者：刘妍王建军成军杨倩纪冬王春花党小艳徐志强中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市100039

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4b(NS4b)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4b蛋白在丙型肝炎慢性化及致细胞发生发展过程中的分子生物学机制方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCVNS4b基因序列特异性的引物,以含有HV-H全基因组... 详细信息

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4b(NS4b)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4b蛋白在丙型肝炎慢性化及致细胞发生发展过程中的分子生物学机制方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCVNS4b基因序列特异性的引物,以含有HV-H全基因组cDNA的质粒pbRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4b蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCVNS4b编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4b.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系.HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体:pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行.DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Westernblot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4b蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCVNS4b转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4b蛋白致病的分子生物学机制提供依据.

关键词：筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4b 转染细胞差异表达基因

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4b抑制IFN介导的抗病毒反应

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微生物学报 2006年第5期46卷 802-806,i0001页

作者：郑义罗海波高博黄来强清华大学深圳研究生院生命科学部深圳518055 武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室武汉430072

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)非结构蛋白NS4b的功能仍不很清楚。本实验旨在研究NS4b对干扰素介导的抗病毒反应的影响。建立稳定表达NS4b的细胞系后,用空斑实验研究NS4b在不同浓度的IFN_α下对水泡口炎病毒(VSV)的影响,利用代表2... 详细信息

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)非结构蛋白NS4b的功能仍不很清楚。本实验旨在研究NS4b对干扰素介导的抗病毒反应的影响。建立稳定表达NS4b的细胞系后,用空斑实验研究NS4b在不同浓度的IFN_α下对水泡口炎病毒(VSV)的影响,利用代表2308个信号传导相关的基因的微点阵研究其对细胞基因表达的影响,和流式细胞仪分析IFNGR1的荧光强度。结果显示HCV_NS4b能微弱地抑制IFN_α介导的抗病毒反应,可能原因是HCV_NS4b抑制一些与免疫反应相关的基因的表达,特别是与IFN_γ信号传导有关的基因。因此,NS4b对HCV耐受干扰素治疗起一定的作用。

关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白4b 空斑实验 DNA微点阵

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4b基因酵母表达载体的构建及表达

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军医进修学院学报 2005年第4期26卷 263-265页

作者：刘妍崔玉芳白桂芹成军王琳纪冬戴久增军事医学科学院放射医学研究所免疫学研究室北京100850 解放军302医院北京100039

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4b基因的酵母细胞表达载体,为探索HCVNS4b在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法在HCV全长质粒pbRTM/HCV-1为模板扩增HCVNS4b基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收... 详细信息

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4b基因的酵母细胞表达载体,为探索HCVNS4b在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法在HCV全长质粒pbRTM/HCV-1为模板扩增HCVNS4b基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGbKT7中表达。提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果:成功构建HCVNS4b基因酵母表达载体,Western免疫印迹分析显示了HCVNS4b在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在,融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论:HCVNS4b蛋白在酵母中表达成功。

关键词：丙型肝炎非结构蛋白4b 酵母菌基因表达

登革2型病毒非结构蛋白NS4b的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

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生物技术通讯 2009年第1期20卷 4-7页

作者：赵慧邓永强刘忠钰李晓峰陈水平姜涛秦成峰秦鄂德军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:原核表达、纯化登革2型病毒非结构蛋白NS4b,并制备其多克隆抗体,以研究其结构与功能。方法:扩增编码登革2型病毒NS4b的24～238位氨基酸残基的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌bL21(DE3),IPTG诱导表达;采... 详细信息

目的:原核表达、纯化登革2型病毒非结构蛋白NS4b,并制备其多克隆抗体,以研究其结构与功能。方法:扩增编码登革2型病毒NS4b的24～238位氨基酸残基的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌bL21(DE3),IPTG诱导表达;采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中回收融合蛋白;用纯化后的融合蛋白免疫bALb/c鼠制备多克隆抗体,采用间接免疫荧光法检测抗体效价。结果:原核表达了NS4b-GST融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,抗体效价为1∶800。结论:登革2型病毒NS4b的24～238位氨基酸残基可诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,这为研究NS4b的结构与功能奠定了基础。

关键词：登革2型病毒非结构蛋白4b 原核表达多克隆抗体

酵母双杂交筛选与牛病毒性腹泻病毒NS4b互作的宿主蛋白

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中国兽医学报 2023年第2期43卷 269-277页

作者：丁媛石金凤韩子琪刁乃超邓贺文李健明时坤杜锐吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 吉林农业大学中药材学院吉林长春130118 梅花鹿药用资源利用关键技术研究室吉林长春130118 吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心吉林长春130118 动物生产及产品质量安全教育部重点实验室吉林长春130118

为探究NS4b蛋白在牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,bVDV)感染和复制过程中的作用,利用酵母双杂交(yeast two hybrid,Y2H)技术筛选与bVDV NS4b蛋白互作的宿主细胞蛋白质。以构建的bVDV NS4b重组质粒pGbKT7-NS4b作为诱饵质... 详细信息

为探究NS4b蛋白在牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,bVDV)感染和复制过程中的作用,利用酵母双杂交(yeast two hybrid,Y2H)技术筛选与bVDV NS4b蛋白互作的宿主细胞蛋白质。以构建的bVDV NS4b重组质粒pGbKT7-NS4b作为诱饵质粒,采用酵母双杂交技术,与牛肾细胞MDbK-cDNA文库进行杂交。将获得的阳性克隆菌落经质粒抽提、测序分析和免疫共沉淀试验,确定可与NS4b互作的宿主细胞蛋白。结果表明,成功构建了诱饵质粒pGbKT7-NS4b,该质粒可在酵母菌中表达NS4b蛋白。采用酵母双杂交技术从牛肾细胞基因组文库获得14个阳性克隆,阳性克隆经测序、互补试验、免疫共沉淀验证后明确可与bVDV NS4b蛋白互作的宿主蛋白为SYNGR2和RAbACI。上述研究为进一步研究bVDV NS4b蛋白在bVDV感染和复制中的作用机制奠定了理论基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白4b 酵母双杂交蛋白质互作