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PRRSV非结构蛋白2合成肽多克隆抗体的制备及应用

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中国动物传染病学报 2024年

作者：张彦兵解艺璇李慧肖长广葛菲菲刘珂魏建超李宗杰邵东华李蓓蓓马志永孙延鸣邱亚峰石河子大学动物科技学院上海市动物疫病预防控制中心中国农业科学院上海兽医研究所

本研究旨在利用PRRSV Nsp2合成肽进行多克隆抗体的制备，并分析了该抗体的特性。应用生物信息学技术预测获得PRRSV非结构蛋白Nsp2的抗原肽序列，并通过化学合成的方法获得抗原肽，将其与KLH载体蛋白进行偶联；随后，将偶联好的抗原肽与... 详细信息

本研究旨在利用PRRSV Nsp2合成肽进行多克隆抗体的制备，并分析了该抗体的特性。应用生物信息学技术预测获得PRRSV非结构蛋白Nsp2的抗原肽序列，并通过化学合成的方法获得抗原肽，将其与KLH载体蛋白进行偶联；随后，将偶联好的抗原肽与弗氏佐剂混合，通过对新西兰大白兔进行免疫获得的血清即为针对Nsp2的多克隆抗体；最后，利用ELISA、Western blot及间接免疫荧光法(IFA)对多克隆抗体的特性进行分析。研究结果显示：ELISA检测该多克隆抗体的效价超过105；Western blot检测可以特异性的检测到细胞过表达和不同毒株病毒感染的Nsp2蛋白；IFA检测分析得出，该多克隆抗体可有效地区分病毒感染和未感染的样品。此外，PRRSV Nsp2合成肽多克隆抗体还可以应用于不同毒株PRRSV感染样品的检测，这为进一步研究PRRSV Nsp2的功能提供了一个有效的工具。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒合成肽多克隆抗体非结构蛋白2

冠状病毒非结构蛋白Nsp2的演化、结构与功能

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中国生物化学与分子生物学报 2023年第10期39卷 1375-1382页

作者：薛甜焦亚娟黄耀伟浙江大学动物医学系杭州310058 岭南现代农业科学与技术广东省实验室华南农业大学兽医学院广州510642

以新冠病毒(SARS-CoV-2)为代表的冠状病毒(coronavirus,CoV)主要危害呼吸系统和消化道系统,严重危害人类与动物健康。冠状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白质在病毒木瓜样蛋白酶作用下,经... 详细信息

以新冠病毒(SARS-CoV-2)为代表的冠状病毒(coronavirus,CoV)主要危害呼吸系统和消化道系统,严重危害人类与动物健康。冠状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白质在病毒木瓜样蛋白酶作用下,经切割后形成的成熟加工产物。Nsp2的研究较少,其在病毒复制相关的生命周期、与宿主相互作用等过程中发挥的主要作用至今未得到阐明。尽管Nsp2在不同CoVs中变异程度较大,但其演化分型与不同冠状病毒亚属的分型一致。最近对SARS-CoV-2 Nsp2的高级结构进行了解析和分析,同时也发现了SARS-CoV-2 Nsp2上存在一些与新冠突变株相关的显著突变,但是对Nsp2结构与突变及其生物学功能的联系仍不清楚。虽然Nsp2对于冠状病毒复制是非必须的,但是对于野生毒株达到最大病毒复制量至关重要。Nsp2被招募到被感染细胞的双层膜囊泡结构,与多种病毒蛋白质相互作用,协同参与病毒复制与转录。Nsp2还通过与多种宿主蛋白质相互作用,不仅参与线粒体、溶酶体、内质网等细胞器的生理过程,调节宿主细胞的能量代谢与物质转运,还通过影响干扰素的产生调节宿主先天免疫应答。本文对冠状病毒,特别是新冠病毒的Nsp2的产生、遗传演化、结构、主要变异位点进行了归纳,同时对其参与病毒复制、与病毒蛋白质及宿主蛋白质互作等最新研究进行概述总结,以期为冠状病毒的病原生物学、致病机制研究与防控提供参考。

关键词：冠状病毒新冠病毒非结构蛋白2 演化结构生物学功能

丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP的克隆化

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世界华人消化杂志 2005年第14期13卷 1700-1704页

作者：张黎颖成军邓红刘妍王琳北京地坛医院传染病研究所北京市100011 西安交通大学第二医院感染科陕西省西安市710004 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心北京市100039

目的:克隆化HCV非结构蛋白2(NS2)蛋白反式调节靶基因(NS2TP). 方法:依据我们构建的HCV NS2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术获得新基因NS2TP的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研... 详细信息

目的:克隆化HCV非结构蛋白2(NS2)蛋白反式调节靶基因(NS2TP). 方法:依据我们构建的HCV NS2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术获得新基因NS2TP的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研究. 结果:NS2TP基因编码区为456核苷酸(nt),编码产物为151氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因. 结论:发现了HCV

关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白2 反式调节基因 NS2TP 克隆

高致病性PRRSV TJ株Nsp2蛋白的缺失及其二级结构预测

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湖南农业大学学报（自然科学版） 2011年第4期37卷 429-435页

作者：王凤雪冷雪李真光温永俊刘准武华中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室吉林吉林市132109

根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株F3代全基因序列(GenBank登录号为EU860248),结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,选择高致病性PRRSV TJ株噬斑克隆纯化前后14个不同代次,利用合成的引物扩增各代次N... 详细信息

根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株F3代全基因序列(GenBank登录号为EU860248),结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,选择高致病性PRRSV TJ株噬斑克隆纯化前后14个不同代次,利用合成的引物扩增各代次Nsp2基因的高变区片段及F3代和F92代Nsp2全基因,并进行产物克隆和氨基酸序列分析及结构预测。测序结果表明:PRRSV TJ株在克隆传代过程中出现了序列整段缺失,共缺失120个氨基酸,并且从F18代噬斑克隆开始一直稳定存在。缺失高变区及Nsp2蛋白二级结构预测结果表明:缺失的氨基酸使Nsp2蛋白在空间结构上发生了较大的变化,推测这可能与PRRSV TJM–F92的毒力和致病力减弱有关。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2 蛋白缺失蛋白二级结构

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2的生物信息学分析

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安徽农业科学 2012年第21期40卷 10903-10905页

作者：孙荡高歌周胜鲍梦雅茅翔南京农业大学动物医学院江苏南京210095

[目的]为临床上构建PRRSV的拮抗性小肽及相关疫苗设计提供理论参考。[方法]对NCBI上国内分离的PRRSV毒株(FJ175688.1)Nsp2的氨基酸序列进行生物信息学方法分析,并对其组分、理化性质、跨膜结构域、二级结构、糖基化位点、磷酸化位点和B... 详细信息

[目的]为临床上构建PRRSV的拮抗性小肽及相关疫苗设计提供理论参考。[方法]对NCBI上国内分离的PRRSV毒株(FJ175688.1)Nsp2的氨基酸序列进行生物信息学方法分析,并对其组分、理化性质、跨膜结构域、二级结构、糖基化位点、磷酸化位点和B细胞抗原表位进行预测。[结果]Nsp2含有7段的跨膜区域,二级结构中自由卷曲含量最高(57.64%),同时含有4个糖基化位点和76个磷酸化位点。综合分析表明,Nsp2具有大量的抗原决定簇。[结论]通过对Nsp2的生物信息学分析,可为PRRSV疫苗设计提供理论基础。

关键词： PRRSV 非结构蛋白2 生物信息学结构与功能

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甲型流感病毒宿主范围决定因素的研究进展

中国预防兽医学报 2023年第8期45卷 869-876页

作者：张晓芮汤思淇朱大帷李海玲冯亚莉徐艺娜苏超凡冷昊钰王永涛张月美太晓春张莹沈阳农业大学动物科学与医学学院/重要家畜疫病研究教育部重点研究室/辽宁省人畜共患病研究重点实验室辽宁沈阳110866 辽宁省农业发展服务中心辽宁沈阳110033 高唐县畜牧水产事业中心山东聊城252800 山东海利生物制品有限公司山东潍坊262233

流感是由流感病毒所引起的一类急性呼吸道疾病。流感病毒分为4种类型:A(甲)、B(乙)、C(丙)和D(丁)。其中甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)的宿主范围极广,除了家禽、鸟类以外,IAV还能感染马、猪、海豹、水貂、老虎、犬、猫等哺乳动... 详细信息

流感是由流感病毒所引起的一类急性呼吸道疾病。流感病毒分为4种类型:A(甲)、B(乙)、C(丙)和D(丁)。其中甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)的宿主范围极广,除了家禽、鸟类以外,IAV还能感染马、猪、海豹、水貂、老虎、犬、猫等哺乳动物以及人类[1]。IAV基因组编码10种必需蛋白,分别为聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶酸性蛋白(PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、非结构蛋白1(NS1)以及非结构蛋白2(NS2),此外其还编码多种附件蛋白,包括PB1-F2蛋白、PA-X蛋白等。

关键词：甲型流感病毒急性呼吸道疾病基质蛋白宿主范围聚合酶碱性蛋白非结构蛋白2 基因组编码

热休克蛋白HSP90AB1对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

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畜牧与兽医 2022年第12期54卷 128-135页

作者：谢丰玉康磊陈梦莉郑家杨李宗杰李蓓蓓邵东华邱亚峰魏建超马志永刘珂黎满香湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

旨在研究宿主热休克蛋白HSP90AB1对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响。选用对PRRSV易感的MARC-145细胞系,探究过表达和干扰HSP90AB1对病毒复制的影响,利用激光共聚焦免疫荧光和免疫共沉淀验证HSP90AB1与PRRSV的非结构蛋白NSP2... 详细信息

旨在研究宿主热休克蛋白HSP90AB1对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响。选用对PRRSV易感的MARC-145细胞系,探究过表达和干扰HSP90AB1对病毒复制的影响,利用激光共聚焦免疫荧光和免疫共沉淀验证HSP90AB1与PRRSV的非结构蛋白NSP2作用关系,利用双荧光素酶试验探究HSP90AB1和NSP2对NF-kB活性的影响。结果表明,过表达HSP90AB1后显著抑制病毒的复制,干扰HSP90AB1的表达后促进病毒的复制;免疫共沉淀结果和激光共聚焦免疫荧光说明,HSP90AB1和NSP2存在相互作用;双荧光素酶报告试验表明HSP90AB1能逆转NSP2对NF-κB活性的抑制作用。综上,HSP90AB1可能通过与PRRSV NSP2相互作用,拮抗NSP2对NF-kB活性的抑制来抑制病毒的复制和感染。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒热休克蛋白HSP90AB1 非结构蛋白2 病毒复制

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定

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中国预防兽医学报 2019年第4期41卷 385-390页

作者：宋欢孙明霞尹坤温永俊刘永刚蔡雪辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150069 中国农业科学院特产研究所吉林长春130112 内蒙古农业大学内蒙古呼和浩特010018

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利... 详细信息

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米抗体非结构蛋白2

猪传染性胃肠炎病毒Nsp2与宿主细胞蛋白PSMD11相互作用的研究

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中国畜牧兽医 2021年第7期48卷 2569-2576页

作者：孙傲颖王亚楠姜艳平崔文乔薪瑗周晗唐丽杰徐义刚李一经王丽东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 黑龙江省动物疾病防控技术与制剂创制实验室哈尔滨150030

为确定猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)与宿主细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11(PSMD11)之间是否存在相互作用,本研究利用RT-PCR方法扩增猪源PSMD11基因,并构建其真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11,经测序和双酶切验证正确后,转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11是否能在IPEC-J2中表达。利用免疫共沉淀(Co-IP)试验检测TGEV Nsp2和宿主细胞PSMD11蛋白之间的相互作用,并通过激光共聚焦显微镜观察TGEV Nsp2与PSMD11在宿主细胞中的共定位情况。结果显示,本研究成功扩增了猪源PSMD11基因,大小约为1474 bp,基因序列经测序比对与标准序列完全一致。构建的真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11能在IPEC-J2细胞中成功表达PSMD11蛋白;Co-IP结果表明,PSMD11与Nsp2之间存在相互作用;共定位试验结果显示,PSMD11与Nsp2的相互作用发生在细胞质中,且细胞中PSMD11蛋白的表达位置并未因Nsp2的表达而发生改变。本研究结果为进一步研究TGEV Nsp2在病毒感染过程中所发挥的重要作用提供新的线索。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 非结构蛋白2 26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11 蛋白互作