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长角血蜱胚胎发育的研究

长角血蜱胚胎发育的研究

作者：郑建美河北师范大学

学位级别：硕士

蜱类为专性吸血的外寄生动物,不仅传播多种病原体而且还有很强的繁殖力。每只雌蜱一生能产卵几百至几千粒,蜱类的繁殖力决定了其种群数量及危害程度。所以了解蜱卵胚胎发育的规律对预测其幼虫出现的时期,掌握防治时机有重要的实践意义... 详细信息

蜱类为专性吸血的外寄生动物,不仅传播多种病原体而且还有很强的繁殖力。每只雌蜱一生能产卵几百至几千粒,蜱类的繁殖力决定了其种群数量及危害程度。所以了解蜱卵胚胎发育的规律对预测其幼虫出现的时期,掌握防治时机有重要的实践意义。本文以广泛分布于我国的长角血蜱Haemaphysalis longicornis Neumann为研究对象,运用组织学、激光共聚焦技术、SDS-PAGE、生物化学、免疫印迹、气相色谱/质谱(GC/MS)等现代生物学的研究方法,首次对其胚胎发育过程中的形态和物质变化进行了较系统的研究,揭示了蜱类胚胎发育的规律。主要结果如下:1、建立了适合长角血蜱卵的石蜡切片技术体系:以10%次氯酸钠溶液软化卵壳3～5 min,用Smith液固定24h,用系列乙醇脱水,二甲苯透明,得出了最佳脱水和透明条件。2、获得了较为系统的胚胎发育不同时期的实体照片,这些时期包括胚盘形成、胚带形成、器官形成等发育时期。3、SDS-PAGE结果显示:胚胎发育中,156KD、150KD、120KD、107KD、68KD、17KD、18KD、20KD、21KD和22KD蛋白的动态变化均出现在长角血蜱形态发生的不同时期。4、卵黄蛋白(Vn)的Western-blot分析结果显示:Vn的八个亚基在胚胎发育中有不同程度的消耗,幼虫非寄生期的营养来源来自Vn。5、经夹心ELISA检测, Vn在胚胎发育中逐渐被利用,尤其在胚胎发育早期(由3.016μg/egg降到1.601μg/egg)和器官形成期由(1.907μg/egg降到1.394μg/egg)利用率最高。6、测定了长角血蜱胚胎发育过程中的蛋白、糖、脂、水分的变化;初步探讨了胚胎发育中的主要能源物质为蛋白和脂类;糖参与了几丁质的合成;在胚胎晚期,大量的水分用于增加内压使幼虫突破卵壳。7、应用GC/MS技术测定出长角血蜱胚胎发育中的主要化学物质。结果显示:长角血蜱胚胎发育中共有19中化学物质,分别为十七烷酸、二十五烷、棕榈酸等。在胚胎发育的不同时期出现了特定的化学物质,保证了胚胎发育的顺利完成。

关键词：长角血蜱组织学胚胎发育生化分析

实验室条件下长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生物学特性

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中国兽医科学 2007年第4期37卷 277-281页

作者：李知新刘光远田占成谢俊仁王路龚真莉柴慧萍孙晓林甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省兽医寄生虫学重点实验室甘肃兰州730046

在实验室条件下，对我国北方长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生活史进行了首次观察。研究发现，行孤雌生殖的长角血蜱为三宿主蜱；在兔体完成1个世代共需106～154d，饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重的差异不显著（P〉0... 详细信息

在实验室条件下，对我国北方长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生活史进行了首次观察。研究发现，行孤雌生殖的长角血蜱为三宿主蜱；在兔体完成1个世代共需106～154d，饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重的差异不显著（P〉0．05），而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显著（P〈0．01）；雌蜱饱血体重可达吸血前的108．46±19．72倍，与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显著（P〈0．01）。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显著正相关r=0．8970（P〈0．01）；生殖效率指数REI=6．76，生殖适合度指数RFI=6．29；蜱发育时间在不同季节无明显变化。

关键词：长角血蜱孤雌生殖生物学特性

长角血蜱唾液腺功能蛋白发掘与吸血适应机制研究

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长角血蜱唾液腺功能蛋白发掘与吸血适应机制研究

作者：赵华渠河北师范大学

学位级别：硕士

蜱是一种专性吸血的外寄生节肢动物,可携带并传播多种病原体,造成人、畜患上疾病甚至死亡,严重影响人类健康和畜牧业发展。长角血蜱Haemaphysalis longicornis隶属于硬蜱科Ixodidae血蜱属Haemaphysalis,该物种分布广泛,数量众多,危害性... 详细信息

蜱是一种专性吸血的外寄生节肢动物,可携带并传播多种病原体,造成人、畜患上疾病甚至死亡,严重影响人类健康和畜牧业发展。长角血蜱Haemaphysalis longicornis隶属于硬蜱科Ixodidae血蜱属Haemaphysalis,该物种分布广泛,数量众多,危害性极大。长角血蜱为完成整个生活史需要吸食大量宿主血液,其中唾液腺作为重要器官,可分泌多种促进吸血和消化的活性分子,帮助长角血蜱完成正常的吸血活动。研究唾液腺不同吸血时期蛋白差异表达对于阐明长角血蜱的唾液腺吸血的分子机制,进而全面揭示长角血蜱的生存适应对策具有重要意义。本实验利用第二代测序技术对长角血蜱雌蜱饥饿期、交配前吸血期、交配后半饱期和饱血期的四个吸血阶段进行转录组测序。测序并合并组装,共产生87825条Unigene,其中长度在1Kb以上的Unigene有13222条,进行功能注释,共注释29109条Unigene。利用该转录组序列作为数据库,进行长角血蜱唾液腺4个不同吸血时期所有蛋白质的定量蛋白质组学研究。最终通过基于iTRAQ的定量蛋白质组学技术,以长角血蜱4个不同吸血时期的唾液腺蛋白作为研究对象,鉴定到表达差异蛋白3223条,其中具有注释信息的蛋白3164条,未注释蛋白59条。利用生物信息学方法对差异表达蛋白进行系统分析,最终发现了众多与调控促进吸血蛋白表达和运输相关的蛋白,我们挑选了其中一些重要蛋白进行了RNA干扰,例如驱动蛋白、动力蛋白、网格蛋白、分选蛋白、半乳糖激酶和腺苷酰硫酸激酶,最终发现驱动蛋白和动力蛋白被干扰后,雌蜱吸血受到明显抑制,导致其过早从宿主体表脱落甚至死亡。通过功能分析,我们推测两种蛋白在长角血蜱吸血功能分子运输过程中起着重要作用。本论文利用定量蛋白质组学方法对长角血蜱不同吸血时期唾液腺蛋白进行研究,并结合研究结果筛选到能明显影响雌蜱吸血的两种蛋白----驱动蛋白和动力蛋白,这两种蛋白也是首次在长角血蜱中得到报道。实验结果对于阐明长角血蜱唾液腺生理变化的分子机制以及长角血蜱适应吸血的分子机制具有重要意义,对于通过分子手段抑制蜱类吸血具有一定的指导意义,并为蜱类的综合防治提供理论依据。

关键词：长角血蜱转录组定量蛋白质组学 iTRAQ RNAi

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长角血蜱唾液腺退化分子机制研究

长角血蜱唾液腺退化分子机制研究

作者：王笑河北师范大学

学位级别：硕士

蜱是一种专性吸血的体外寄生虫,携带并传播病原体,可导致人、野生动物及家畜感染上多种疾病,不但对人类健康造成危害,同时也严重影响着畜牧业的发展。蜱类包括硬蜱、软蜱和纳蜱三科,其中硬蜱种类最多,分布最广泛,危害最严重。本课题的... 详细信息

蜱是一种专性吸血的体外寄生虫,携带并传播病原体,可导致人、野生动物及家畜感染上多种疾病,不但对人类健康造成危害,同时也严重影响着畜牧业的发展。蜱类包括硬蜱、软蜱和纳蜱三科,其中硬蜱种类最多,分布最广泛,危害最严重。本课题的研究对象长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)隶属于硬蜱科Ixodidae,血蜱属Haemaphysalis,广泛分布于亚洲东部以及澳大利亚。该蜱种在中国的分布也非常广泛,是一种携带多种病原体的蜱种,严重影响着人类健康和畜牧业发展,对其研究具有重要的社会和经济意义。蜱为了能够快速不断地吸食宿主血液,进化出了一对特殊的唾液腺。这种特殊的唾液腺可分泌大量辅助吸血的大分子和小分子物质,具有阻止宿主血液凝固,以及抵抗宿主免疫反应等功能。相对于雄蜱,雌蜱的危害更为严重。雌蜱具有超强的繁殖能力,为了完成整个生活史,需要吸食大量宿主血液并传播病原体。当雌蜱饱血后,即停止吸血并从宿主体表脱落,唾液腺此时已经失去存在的意义,开始迅速退化。研究唾液腺的退化对于了解蜱类唾液腺的机能和调节机制,控制蜱类吸血并综合提高蜱疫防控机制具有重要意义。为了明晰蜱类唾液腺退化的分子机制,本研究以长角血蜱雌蜱为研究对象,采用定量蛋白质组学技术全面分析唾液腺退化过程中全部蛋白的动态变化,寻找在唾液腺退化过程中起到重要调控作用的蛋白质,以期为蜱类的生物防治提供一些理论依据。本研究利用iTRAQ定量蛋白质组学技术分析了雌蜱唾液腺退化过程中4个时间点所有蛋白的表达量变化,最终鉴定到2302条差异表达蛋白。运用生物信息学对差异表达蛋白进行全方位分析,结果显示细胞凋亡信号通路和三羧酸循环过程在退化过程中起到重要作用。最终筛选出几种重要蛋白进行进一步功能分析:F0F1型ATP合成酶、NADH泛醌氧化还原酶、细胞色素C、凋亡诱导因子、溶酶体酸性磷酸酶。我们对这些蛋白逐一进行RNA干扰,这五条蛋白被干扰后,相应靶基因的转录水平均有不同程度的下降。其中F0F1型ATP合成酶、NADH泛醌氧化还原酶、细胞色素C和凋亡诱导因子被干扰后的雌蜱饱血体重、产卵量和孵化率等均发生下降。这些蛋白在未来很可能成为防控长角血蜱的药物靶点,本课题的研究结果不仅全方位诠释了长角血蜱唾液腺退化的分子机制,也为蜱类的生物防治提供了一些理论依据。

关键词：长角血蜱唾液腺退化 iTRAQ RNAi

长角血蜱孤雌生殖种群卵黄蛋白抗体的制备及卵黄发生的研究

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长角血蜱孤雌生殖种群卵黄蛋白抗体的制备及卵黄发生的研究

作者：何艳洁河北师范大学

学位级别：硕士

本研究以长角血蜱Haemaphysalis longicornis Neumann孤雌生殖种群为研究对象,运用生物化学、免疫细胞化学等现代生物学研究方法,首次制备出长角血蜱孤雌生殖种群卵黄蛋白(vitellin, Vn)的多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)和单克... 详细信息

本研究以长角血蜱Haemaphysalis longicornis Neumann孤雌生殖种群为研究对象,运用生物化学、免疫细胞化学等现代生物学研究方法,首次制备出长角血蜱孤雌生殖种群卵黄蛋白(vitellin, Vn)的多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)和单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb),并对所得的单抗做了一系列鉴定。通过双抗体夹心ELISA实验测定成蜱各时期内脏周脂肪体、腔壁脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)或Vn的含量。上述研究对于深入阐明蜱类卵黄发生过程具有重要的科学意义。主要研究结果如下: 1、用长角血蜱孤雌生殖种群卵黄蛋白免疫新西兰大白兔,取兔血清进行纯化,获得Vn的多克隆抗体。应用间接ELISA检测抗体效价,效价高达1:768000以上。 2、用长角血蜱孤雌生殖种群卵黄蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经3-4次克隆化筛选,获得7株能稳定分泌抗Vn的单克隆抗体,分别为1F6、2H6、3A9、4G11、4H1、5G11和6G2。 3、经间接ELISA检测,单抗1F6、4H1、6G2的效价均在1:819200以上,单抗2H6、3A9、4G11、5G11的效价均在1:1638400以上。 4、采用Sigma公司的mouse monoclonal antibody isotyping reagents测定抗体亚型,1F6、3A9亚型为IgG2a,2H6、4G11、5G11、6G2亚型为IgG2b,4H1亚型为IgG1。 5、经夹心ELISA实验检测,7株单抗均具有高度特异性。 6、4G11具有最高的效价和特异性。纯化的4G11效价在1:819200以上,其亲和常数为4.6×107,具有很强的亲和力。 7、将纯化后的4G11进行SDS-PAGE分析,结果显示4G11的重链和轻链的分子量分别为55.8KD和20.9KD。 8、将纯化后4G11进行Western blot分析,发现单抗4G11仅与卵黄蛋白9条亚基中的2个亚基发生免疫反应。 9、应用双抗体夹心ELISA检测长角血蜱孤雌生殖种群成蜱各时期内脏周脂肪体、腔壁脂肪体、血淋巴和卵巢中Vg或Vn的含量。结果表明,血淋巴在饱血当天已经出现Vg,内脏周脂肪体和腔壁脂肪体在饱血当天也出现了Vg,但含量很低,卵巢在饱血后4天开始出现Vn,这说明长角血蜱孤雌生殖种群的卵黄发生过程可能是由脂肪体合成Vg,一经合成便迅速释放到血淋巴,Vg经血淋巴运输到卵巢,被发育中的卵母细胞吸收、沉积并加工成Vn,为胚胎发育提供充足的营养。

关键词：长角血蜱孤雌生殖卵黄发生卵黄蛋白卵黄原蛋白单克隆抗体脂肪体血淋巴卵巢

感染严重发热伴血小板减少综合征病毒半饱血长角血蜱中肠微生物多样性分析

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中国热带医学 2023年第4期23卷 347-352页

作者：陈晨袁传飞康乐夏乾峰海南医学院热带医学院海南海口571199 海南医学院热带转化医学教育部重点实验室海南海口571199 中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室北京100101

目的探讨携带严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)半饱血长角血蜱中肠微生物群落组成及多样性。方法提取3组携带SFTSV半饱血长角血蜱中肠DNA,应用HiSeq平台对样品16S rDNA基因进... 详细信息

目的探讨携带严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)半饱血长角血蜱中肠微生物群落组成及多样性。方法提取3组携带SFTSV半饱血长角血蜱中肠DNA,应用HiSeq平台对样品16S rDNA基因进行高通量测序,以操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)聚类分析、Alpha多样性分析阐明内共生微生物群落组成及多样性。结果3组携带SFTSV半饱血长角血蜱中肠微生物聚类分别为143、113、163个OTU,绘制稀疏性曲线和丰度等级曲线,表明数据具有足够的测序深度,感染SFTSV半饱血长角血蜱中肠微生物组成丰富,但物种分布不均匀;微生物群落组成分析显示,在门水平上,变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)为主要优势菌门。在纲水平上,γ-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)、杆菌纲(Bacilli)、β-变形杆菌纲(Betaproteobacteria)、放线菌纲(Actinomycetia)为主要优势菌纲。在目水平上,军团菌目(Legionellales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、放线菌目(Actinomycetales)为主要优势菌目。在科水平上,柯氏体科(Coxiellaceae)、杆菌科(Bacillaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、红藻科(Rhodocyclaceae)为主要优势菌科。在属水平上,以柯氏体属(Coxiella)相对丰度最高,其次主要为苍白空气芽孢杆菌属(Aeribacillus)、Azonexus;Alpha多样性分析结果显示,Shannon指数平均值为139.67,Simpson指数平均值为0.48,Chao指数平均值为145.06,ACE指数平均值为147.11。结论感染SFTSV半饱血长角血蜱中肠微生物物种多样性丰富。研究结果为进一步探讨长角血蜱肠道微生物与SFTSV互作关系以及开发对蜱虫与蜱传疾病防治的新思路提供了依据。

关键词：严重发热伴血小板减少综合征病毒长角血蜱 16S rDNA 高通量测序肠道微生物多样性分析

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兔非特异性免疫力抗长角血蜱幼虫感染能力的研究

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中国农业大学学报 1998年第S2期3卷 79-81页

作者：赵忠芳孔繁瑶索勋南开大学生物系 300021 中国农业大学动物医学院

本实验以卡介苗作为免疫增强剂和以地塞米松与雷公藤擦剂作为免疫抑制剂,以此改变兔非特异性免疫功能,观察免疫力不同的动物抗长角血蜱幼虫感染的能力.结果发现非特异性免疫增强组兔对蜱抵抗力较强,而非特异性免疫抑制组相对较弱,提示... 详细信息

本实验以卡介苗作为免疫增强剂和以地塞米松与雷公藤擦剂作为免疫抑制剂,以此改变兔非特异性免疫功能,观察免疫力不同的动物抗长角血蜱幼虫感染的能力.结果发现非特异性免疫增强组兔对蜱抵抗力较强,而非特异性免疫抑制组相对较弱,提示在蜱活动季节灭蜱时,应该考虑动物体况,加强动物营养,对种用动物以免疫增强剂进行接种,减少疾病的发生。蜱作为多种病原体的生物性媒介和自身作为病原体对人和动物危害严重。通常采用的灭蜱措施主要有药物防治、生物防治等,但对不同体况动物自身抗蜱能力的研究尚缺,本实验对此进行了研究。

关键词：兔非特异性免疫力长角血蜱

不同饲喂方式和温度对长角血蜱甘肃株生物学特性的影响

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动物医学进展 2010年第5期31卷 26-31页

作者：李知新刘光远田占成谢俊仁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫原病原生物学国家重点实验室甘肃省兽医寄生虫学重点实验室甘肃兰州730046 宁夏动物疾病预防控制中心宁夏银川750002

在不同饲喂方式和温度条件下,观察我国北方长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)甘肃株的生活史及对其生物学特性的影响。将试验蜱分组后置于不同饲喂方式和温度下,待其发育到下一阶段,叮咬实验动物,连续调查其发育阶段的生物学特性。... 详细信息

在不同饲喂方式和温度条件下,观察我国北方长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)甘肃株的生活史及对其生物学特性的影响。将试验蜱分组后置于不同饲喂方式和温度下,待其发育到下一阶段,叮咬实验动物,连续调查其发育阶段的生物学特性。研究发现,完成一个世代需101 d～148 d。成年饥饿雌蜱吸血期具有两个显著特征:缓慢吸血和快速吸血;经兔体叮咬的成年雌蜱其饱血体重小于羊体。不同饲喂条件下长角血蜱饱血体重、产卵量差异极显著(P蜱、若蜱的蜕变时间随温度的升高而缩短;当饱血雌蜱处于发育阶段时,产卵前期、产卵期及卵的孵化期均随着温度的升高而缩短;16℃～30℃条件下长角血蜱产卵量没有变化,利于蜱的存活;4℃以下和45℃以上饱血蜱及其后代不能存活;16℃以下蜱的发育周期延长。结果表明,长角血蜱为三宿主蜱;雄蜱可以帮助雌蜱吸血;在羊体上的吸血能力优于在兔体上的吸血能力;温度对长角血蜱的发育繁殖有影响。

关键词：长角血蜱生物学特性温度饲喂方式

天冬氨酸蛋白酶在卵形巴贝斯虫侵染长角血蜱过程中的作用研究

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中国兽医科学 2024年

作者：罗金张高峰崔晶晶柳志成赵帅阳任巧云胡东生曹立华常国勤殷宏罗建勋刘光远中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃农业大学动物科学技术学院庄浪县畜牧兽医中心高台县动物疫病预防控制中心高台县新坝镇畜牧兽医工作站高台县南华镇畜牧兽医工作站江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学

本试验以天冬氨酸蛋白酶(AP)为目标基因，探究其表达抑制后对卵形巴贝斯虫侵染长角血蜱的能力。利用5′/3′-RACE和PCR扩增天冬氨酸蛋白酶基因的全长和CDS，然后根据获得的序列设计siRNA干扰引物。通过颈静脉接种卵形巴贝斯虫的方式构... 详细信息

本试验以天冬氨酸蛋白酶(AP)为目标基因，探究其表达抑制后对卵形巴贝斯虫侵染长角血蜱的能力。利用5′/3′-RACE和PCR扩增天冬氨酸蛋白酶基因的全长和CDS，然后根据获得的序列设计siRNA干扰引物。通过颈静脉接种卵形巴贝斯虫的方式构建动物感染模型，将通过RNAi干扰AP基因表达后的长角血蜱置于感染卵形巴贝斯虫牛体表，使蜱叮咬后检测蜱及蜱卵中卵形巴贝斯虫的感染率。结果显示，长角血蜱AP基因全长为1 497 bp，编码区序列为1 176 bp。该基因的RNAi可使AP的表达丰度降低81.91%(P=0.003长角血蜱AP能有效抑制卵形巴贝斯虫的垂直传播，虽然该基因在蜱种间有较高保守性，但是其核酸序列仍然存在一定的差异。该基因第626～644位或第257～275位定点结合可作为潜在的阻断卵形巴贝斯虫传播的疫苗设计靶点，该位点可以发挥抑制/干扰AP的表达的作用。该作用下可有效阻止卵形巴贝斯虫的垂直传播，而且可导致巴贝斯虫的感染水平的显著降低。因此，本研究不仅有助于揭示巴贝斯虫的生物学特性，也为疾病防控提供了潜在的新策略，为公共卫生提供更加有效的干预措施。

关键词：长角血蜱卵形巴贝斯虫天冬氨酸蛋白酶 RNA干扰 RACE