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长角血蜱卵泡抑素相关蛋白的定性

生物工程学报 2009年第11期25卷 1646-1651页

作者：田占成刘光远殷宏罗建勋谢俊仁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株卵泡抑素基因的核苷酸序列(GenBank Accession ***248886)设计合成一对引物,从本实验室保藏的单克隆洁净长角血蜱饥饿成蜱中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出814bp的卵泡抑素基因,序列比对结果显示... 详细信息

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株卵泡抑素基因的核苷酸序列(GenBank Accession ***248886)设计合成一对引物,从本实验室保藏的单克隆洁净长角血蜱饥饿成蜱中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出814bp的卵泡抑素基因,序列比对结果显示:与长角血蜱致病性Okayama株的核苷酸序列及氨基酸序列一致性分别为97.8%和99%,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中进行表达,GST融合重组蛋白预期分子量为57kD。表达重组蛋白经MagneGSTTM蛋白纯化系统纯化后作为抗原分别与抗不同发育阶段长角血蜱(卵、幼蜱、若蜱、成蜱)多克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,结果表明:与长角血蜱卵制备的多克隆抗体有很强的免疫反应,而与其他发育阶段(幼蜱、若蜱、成蜱)饥饿长角血蜱制备的多克隆抗体反应性很弱。以上结果表明:长角血蜱卵泡抑素蛋白在长角血蜱产卵及卵成熟发育时期的表达水平较其他发育阶段(幼蜱、若蜱、成蜱)的蛋白表达水平高。

关键词：长角血蜱卵泡抑素定性

长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的构建及免疫学筛选

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第1期27卷 6-10页

作者：柴慧萍刘光远张林龚真莉谢俊仁田占成贾宁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫原病原生物学国家重点实验室甘肃省兽医寄生虫学重点实验室兰州730046 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

目的构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,筛选长角血蜱功能性抗原基因。方法在无RNA酶污染的条件下提取长角血蜱总RNA,进而纯化mRNA,以寡脱氧胸腺核苷酸[oligo(dT)]为引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将cDNA分子定... 详细信息

目的构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,筛选长角血蜱功能性抗原基因。方法在无RNA酶污染的条件下提取长角血蜱总RNA,进而纯化mRNA,以寡脱氧胸腺核苷酸[oligo(dT)]为引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将cDNA分子定向克隆至具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体。用噬菌体包装蛋白对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转化大肠埃希菌(Escherichia coli)ER1647,从而构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库。使用兔抗长角血蜱全蜱血清对该文库进行免疫学筛选,经过2次筛选得到的阳性噬菌体转化*** BM25.8亚克隆为重组质粒,转化*** JM109,提取重组质粒进行PCR和测序分析。结果长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的基础库容量为1.8×106pfu,重组率为100%,扩增后的滴度为2.4×109pfu/ml。筛选获得42个阳性克隆,序列分析表明有12个新cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱原肌凝蛋白、环状扇头蜱幼蜱未知蛋白、黑腹果蝇染色体2R、褐黄血蜱线粒体DNA、青海血蜱HqL09、Hq05和肌球蛋白轻链mRNA等具有同源性。结论构建了长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,获得的阳性克隆为长角血蜱功能性抗原的研究奠定基础。

关键词：长角血蜱雌蜱 cDNA表达文库免疫学筛选

长角血蜱和微小扇头蜱的形态与分子生物学鉴定

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中华流行病学杂志 2011年第6期32卷 608-612页

作者：覃新程田俊华王剑波卢昕孙强正金东周敦金徐建国张永振中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 武汉市疾病预防控制中心

目的建立鉴定长角血蜱和微小扇头蜱的形态学和分子生物学相结合的方法。方法采集自湖北和河南省布尼亚新病毒疫区家养动物体表寄生的蜱及草丛、灌木中的蜱；先以形态学鉴定，后用PCR方法扩增得到蜱的12SrDNA，测序后进行同源性和系统进... 详细信息

目的建立鉴定长角血蜱和微小扇头蜱的形态学和分子生物学相结合的方法。方法采集自湖北和河南省布尼亚新病毒疫区家养动物体表寄生的蜱及草丛、灌木中的蜱；先以形态学鉴定，后用PCR方法扩增得到蜱的12SrDNA，测序后进行同源性和系统进化分析。结果形态学方法鉴定采集到两种蜱：长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）。蜱的12SrDNA经克隆、测序，用PAUP4．0软件构建系统发生树，湖北、河南省两种蜱的12SrDNA序列分别与长角血蜱和微小扇头蜱聚类，与形态学鉴定结果一致。结论在传统形态学分类的基础上结合分子生物学鉴定方法能更准确地鉴定蜱的种类。

关键词：长角血蜱微小扇头蜱鉴定

长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

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中国兽医科学 2009年第8期39卷 659-664页

作者：刘建刚刘光远田占成谢俊仁龚真莉张丽艳中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析。以新合成的长角血蜱饥饿和半饱... 详细信息

为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析。以新合成的长角血蜱饥饿和半饱血雄蜱cDNA第一链为模板,用RT-PCR方法对从文库中挑选的5个表达序列标签(EST)进行鉴定。初步获得18个EST,BlastX分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白。RT-PCR鉴定结果显示,随机挑选的5个新EST中有3个在半饱血状态下差异表达。结果表明,成功地构建了长角血蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库,获得了有潜在生物学功能的EST。

关键词：长角血蜱抑制消减杂交(SSH) cDNA文库

长角血蜱新基因HL05全长序列的克隆与原核表达

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中国兽医科学 2011年第4期41卷 380-386页

作者：张丽艳刘光远田占成谢俊仁龚真莉刘建刚中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

以兔抗长角血蜱饥饿雌蜱全蜱蛋白阳性血清为探针,对长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库进行免疫学筛选,获得一个阳性克隆HL05。经5′-RACE技术得到HL05基因的全长序列。HL05基因全长1 053bp,开放阅读框长540bp,编码179个氨基酸,预计蛋白分子... 详细信息

以兔抗长角血蜱饥饿雌蜱全蜱蛋白阳性血清为探针,对长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库进行免疫学筛选,获得一个阳性克隆HL05。经5′-RACE技术得到HL05基因的全长序列。HL05基因全长1 053bp,开放阅读框长540bp,编码179个氨基酸,预计蛋白分子质量为20.01ku。序列同源性分析表明,该基因为长角血蜱新基因。对推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,表明HL05蛋白为分泌型蛋白,无跨膜区,具有较高的抗原指数。将该基因亚克隆后连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导后得到大小为46ku左右的重组蛋白,与预期大小一致。Western-blot结果显示兔抗长角血蜱成蜱全虫抗体能够识别该重组蛋白。

关键词：长角血蜱 HL05新基因全长序列分析原核表达

长角血蜱蛋白质二硫键异构酶-2的生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2021年第7期40卷 2497-2504页

作者：张科王涵王瑜郝丽亚邱渊浩李清利肖明平顶山学院医学院平顶山467000 汝州市畜牧局疫病防控中心汝州467500 青海大学农林科学院西宁810016

本研究旨在利用生物信息学软件分析长角血蜱的蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase-2,PDI-2)的结构特点,并预测其B、T细胞抗原表位。利用ProtParam分析PDI-2蛋白质的理化性质,利用SignalP分析蛋白的信号肽,利用SOSUI分析蛋... 详细信息

本研究旨在利用生物信息学软件分析长角血蜱的蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase-2,PDI-2)的结构特点,并预测其B、T细胞抗原表位。利用ProtParam分析PDI-2蛋白质的理化性质,利用SignalP分析蛋白的信号肽,利用SOSUI分析蛋白可溶性,利用Bcepred分析蛋白表面可及性、柔韧性和亲(疏)水性,利用ProSacle分析蛋白亲水性区域,利用MotifScan分析蛋白翻译后修饰位点,利用SOPMA分析蛋白的二级结构,利用Phyre2预测蛋白质三级结构,利用IEDB、BepiPred、SYFPEITHI预测其T、B细胞抗原表位。结果显示,长角血蜱PDI-2的分子式为C_(2538)H_(3966)N_(654)O_(795)S_(17),理论等电点为4.85;PDI-2含有13个(scores≥1.9)高亲水性区域,11个(scores≥2.0)柔韧性区域,11个(scores≥1.9)表面可及性区域;该蛋白含有20个蛋白翻译后修饰位点;α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别占42.69%、19.44%、5.01%和32.87%;最终预测PDI-2蛋白存在20个CTL优势表位和3个Th优势表位,可能的B细胞抗原表位有23个。本研究发现PDI-2蛋白含有丰富的抗原表位,为深入研究该蛋白提供了理论依据。

关键词：长角血蜱 PDI-2 蛋白特性抗原表位生物信息学分析

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长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

中国兽医科学 2012年第6期42卷 551-556页

作者：罗金刘光远田占成谢俊仁沈辉田美媛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达... 详细信息

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。

关键词：长角血蜱 4D8基因克隆原核表达

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气象因子对长角血蜱寻觅活动的影响

林业科学 2020年第6期56卷 68-75页

作者：柳絮飞周在豹王巍郑建旭魏婉红李凯北京林业大学自然保护区学院北京100083 北京市林业保护站北京100029 河北小五台山国家级自然保护区管理局张家口075700 首都机场海关北京101300

【目的】通过对北京西部山地常见林分环境硬蜱优势种(长角血蜱)种群动态研究,探讨不同气象因子对蜱寻觅活跃度的影响,以指导游人和林间作业人员规避蜱叮咬。【方法】2017—2018年,在北京西部山地风景区内选取3个试验地点,通过拖旗法每2... 详细信息

【目的】通过对北京西部山地常见林分环境硬蜱优势种(长角血蜱)种群动态研究,探讨不同气象因子对蜱寻觅活跃度的影响,以指导游人和林间作业人员规避蜱叮咬。【方法】2017—2018年,在北京西部山地风景区内选取3个试验地点,通过拖旗法每2周对样地内长角血蜱采样数量进行一次有放回抽样调查,每次调查3 h,通过手持式温湿度计及自动气象站收集温度、相对湿度、太阳辐射等9个气象因子数据,采用主成分分析、T检验法和Pearson相关系数对不同地点间蜱数量及气象因子与长角血蜱寻觅活动间关系进行分析。【结果】1)长角血蜱成蜱年度动态呈双峰模式,主高峰为5月,是9月次高峰蜱数量的13.9倍;2)不同样地间蜱数量具有差异,以畜牧业活动为主的唐家场平均采集数量显著高于从事少量农业活动的东沟(t=-3.38,P0.05);3)长角血蜱寻觅活动与太阳辐射、饱和差和蒸发量呈正相关,与相对湿度、落叶层相对湿度和露点温度成负相关;4)通过主成分分析法对9个气象因子进行降维,共提取2个主成分,累积贡献率达78.32%,其中第1主成分定义为温度因素,以采样温度、饱和差、太阳辐射和蒸发量贡献最大,达42.39%;第2主成分定义为湿度因素,以相对湿度、落叶层相对湿度和露点温度贡献最大,达35.93%。【结论】长角血蜱成蜱在该地有春、秋2个数量高峰期并以春季为主;温暖干燥的天气条件使得蜱活跃性更强,外加春季种群数量高发,二者耦合使得春季成为我国北方地区硬蜱侵袭和叮咬的高发季节;由于宿主的存在导致畜牧活动区域长角血蜱种群呈现高密度分布,因此在上述地区和天气条件下,特别是在春季应加强对蜱传疾病的监管。

关键词：长角血蜱时空动态气象因子影响

长角血蜱唾液腺中腺苷三磷酸双磷酸酶的纯化及其酶切机制

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昆虫学报 2002年第3期45卷 307-312页

作者：程远国吴厚永李德昌李成文赵彤言军事医学科学院微生物与流行病研究所北京100071 解放军军需大学寄生虫学教研室长春130042

利用染料亲和层析 (CibacornBlue柱 )和离子交换层析 (MacrosphereWCX柱 )对长角血蜱Haemaphysalislongicornis唾液腺的腺苷三磷酸双磷酸酶进行纯化 ,经SDS PAGE证实其分子量为 6 6kD。腺苷三磷酸双磷酸酶可以水解ATP和ADP ,但对AMP无... 详细信息

利用染料亲和层析 (CibacornBlue柱 )和离子交换层析 (MacrosphereWCX柱 )对长角血蜱Haemaphysalislongicornis唾液腺的腺苷三磷酸双磷酸酶进行纯化 ,经SDS PAGE证实其分子量为 6 6kD。腺苷三磷酸双磷酸酶可以水解ATP和ADP ,但对AMP无水解作用 ,水解ATP和ADP的Km 值均为 0 2 μmol L ,Vmax值分别为 12 5和 15 6 μmol (min·mg)。腺苷三磷酸双磷酸酶水解ATP的中间产物是ADP ,最终产物是AMP和正磷酸。表明腺苷三磷酸双磷酸酶水解ATP的位点是 5′ 核苷酸的γ 磷酸键 ,水解ADP的位点是 5′ 核苷酸的 β 磷酸键。

关键词：长角血蜱唾液腺腺苷三磷酸双磷酸酶酶水解