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高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用

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应用与环境生物学报 2014年第3期20卷 357-362页

作者：盛冠一诸葛斌宗红陆信曜方慧英宋健诸葛健江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院工业微生物研究中心无锡214122 江南大学化学与材料工程学院无锡214122

利用PCR-mediated Technique对酿酒酵母W303-1A金属硫蛋白基因(cup1)进行敲除,获得一株铜离子敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A cup1△),其对Cu2+抑制浓度由1.2 mmol/L降为0.08 mmol/L;以pYX212载体为基本构架,以*** W303-1A cup1△为宿主菌,构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统,并成功表达了绿色荧光蛋白基因(gfp),从而实现了高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统的构建与应用.本研究构建的高灵敏度铜抗性酿酒酵母表达系统不仅廉价、安全,而且丰富了酵母的表达系统,同时对微生物的铜抗性机理及生物修复功能的研究具有指导意义.

关键词：酿酒酵母 PCR-mediated Technique cup1 铜抗性绿色荧光蛋白

一株溶杆菌Lysobacter soli RCu6的转录组水平铜抗性机制研究

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中国生态农业学报（中英文） 2022年第12期30卷 2002-2010,I0001-I0008页

作者：李富玉陈帅民刘梦帅陈苗苗李小方刘彬彬中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心石家庄050022 中国科学院大学北京100049 吉林省农业科学院农业资源与环境研究所长春130033 中国农业大学资源与环境学院/植物-土壤相互作用教育部重点实验室/中国农业大学国家农业绿色发展研究院北京100193 瓦赫宁根大学植物生态与自然保护组荷兰瓦赫宁根6700AA

铜是许多细胞酶所必需的微量元素,然而过量的铜通常对细胞有毒。细菌已经进化出许多铜抗性策略,但其分子机制尚不完全清楚。本研究在农田土壤中分离了一株高度抗铜(对铜的抗性达3.2 mmol∙L^(−1))的细菌菌株RCu6,并利用全基因组和转录组... 详细信息

铜是许多细胞酶所必需的微量元素,然而过量的铜通常对细胞有毒。细菌已经进化出许多铜抗性策略,但其分子机制尚不完全清楚。本研究在农田土壤中分离了一株高度抗铜(对铜的抗性达3.2 mmol∙L^(−1))的细菌菌株RCu6,并利用全基因组和转录组学方法分析研究了其抗铜机制。RCu6菌株的全基因组测序显示该菌株在分类学上属于溶杆菌(Lysobacter soli);与已发现的同种菌株相比,基因组分析显示该菌株具有独特的由多个基因编码的抗铜系统。转录组分析表明在0.8 mmol∙L^(−1)和1.6 mmol∙L^(−1)胁迫下分别有315个和839个基因差异表达;铜稳态、组氨酸代谢、硫代谢和铁硫簇组装途径与RCu6菌的铜抗性相关,表明RCu6抗铜是一个细胞内多系统协同过程。本研究揭示了溶杆菌属菌株铜抗性分子水平的机制,为重金属污染农田土壤修复和利用提供了菌种资源和理论依据。

关键词：溶杆菌基因组学转录组学铜抗性

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断奶前后仔猪和母猪粪便源大肠杆菌耐药性和铜抗性的分析

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畜牧兽医学报 2015年第3期46卷 482-490页

作者：计徐郑卫江邹雪婷黄九锡姚文南京农业大学动物科技学院南京210095

旨在比较断奶前后仔猪和母猪大肠杆菌耐药性和铜抗性的变化,并分析其可能原因,为寻求控制大肠杆菌耐药性形成与传播的营养措施提供依据。试验中,采用CLSI推荐的琼脂稀释法,对分离自仔猪及其哺乳母猪的224株大肠杆菌的7种抗生素耐药性及... 详细信息

旨在比较断奶前后仔猪和母猪大肠杆菌耐药性和铜抗性的变化,并分析其可能原因,为寻求控制大肠杆菌耐药性形成与传播的营养措施提供依据。试验中,采用CLSI推荐的琼脂稀释法,对分离自仔猪及其哺乳母猪的224株大肠杆菌的7种抗生素耐药性及铜抗性进行检测。结果表明,224株大肠杆菌对7种抗生素均有不同程度的耐药(耐药率范围28.13%~93.30%),70.09%的菌株表现出多重耐药性(MDR)。分离自母猪与哺乳仔猪的大肠杆菌抗生素耐药率相似度较高,仅有对氨苄西林和庆大霉素的耐药率差异显著。而断奶后仔猪源大肠杆菌的耐药率相对于母猪和哺乳仔猪变化明显,耐受头孢噻呋、氟苯尼考和氯霉素的菌株都极显著增加(P铜的抗性程度明显增加(P铜抗性增加时,对抗生素耐药性也有所变化,两者之间有一定的相关性。母猪肠道内的耐药菌及饲料中的抗生素添加剂对仔猪大肠杆菌耐药性产生、维持与加剧发挥了重要作用,仔猪饲料中添加的高水平铜与大肠杆菌耐药水平的变化存在一定的关系。

关键词：仔猪大肠杆菌耐药性铜抗性

不同来源的海州香薷和野胡萝卜的铜抗性及铜积累差异

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环境工程学报 2007年第5期1卷 94-100页

作者：柯文山熊治廷谢明吉熊双莲黄河李民敬湖北大学生命科学学院武汉430062 武汉大学资源与环境科学学院武汉430079

以来自矿区(铜绿山和赤马山铜矿)和非矿区(红安、武汉严西湖)的海州香薷和野胡萝卜种群为对象,通过土培实验,研究了2种植物的铜抗性及铜吸收积累差异。结果显示,来自矿区的海州香薷和野胡萝卜种群的铜抗性都明显高于非矿区种群,但2种植... 详细信息

以来自矿区(铜绿山和赤马山铜矿)和非矿区(红安、武汉严西湖)的海州香薷和野胡萝卜种群为对象,通过土培实验,研究了2种植物的铜抗性及铜吸收积累差异。结果显示,来自矿区的海州香薷和野胡萝卜种群的铜抗性都明显高于非矿区种群,但2种植物种群的铜吸收积累特征明显不同:海州香薷植物吸收的Cu主要集中在根中,但矿区种群吸收积累的铜量明显低于非矿区种群;而野胡萝卜吸收的Cu主要集中在地上部分(地上部分的Cu富集量是根的1.5倍),但积累的铜量在矿区和非矿区种群间没有明显的差异。因此,来自矿区的海州香薷可能进化为铜避性对策,而野胡萝卜的铜抗性与其吸收积累的总量没有明显的关系,但有很好的向地上运输能力。

关键词：海州香薷野胡萝卜铜抗性铜积累

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植物相关细菌铜抗性研究进展

湖北农业科学 2012年第11期51卷 2169-2171页

作者：吴亚男高必达杨玉文赵廷昌湖南农业大学生物安全科学技术学院长沙410128 中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

围绕铜的生理作用及毒性、抗铜基因在植物相关细菌中的分布、植物相关细菌的抗铜机制、植物相关细菌铜抗性与动植物的关系、植物相关细菌铜抗性的应用等方面进行了概述。

关键词：植物病原细菌植物促生菌铜抗性毒性

青枯菌copSRABCD基因簇铜抗性作用机理及表达调控研究

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青枯菌copSRABCD基因簇铜抗性作用机理及表达调控研究

作者：王晓宁中国农业科学院

学位级别：硕士

植物细菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由雷尔氏菌属植物致病种(Ralstonia spp.泛称青枯菌)引起的一种世界性分布的重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂,铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了... 详细信息

植物细菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由雷尔氏菌属植物致病种(Ralstonia spp.泛称青枯菌)引起的一种世界性分布的重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂,铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了铜抗性菌株。全基因组序列测定表明,青枯菌Po82菌株大质粒上普遍携带了丁香假单胞菌中的铜抗性编码基因copSRABCD的同源物。以青枯菌Po82菌株为研究对象,通过反向遗传学的研究手段,构建copA、copD、copSR基因缺失菌株及相应互补菌株。解析了copA、copD、copSR基因与青枯菌铜胁迫应答、代谢活性、致病力和运动性等表型生物学特征之间的关系以及copSRABCD基因簇的表达调控关系。应用RNA-seq测序技术,测定Po82菌株以及copABCD基因缺失菌株在营养丰富培养条件、铜诱导培养以及寄主体内环境的转录本,发掘不同培养条件下共表达与差异表达的基因,以期探明copSRABCD基因簇的功能并发掘新的铜抗性及致病相关基因,为进一步深入解析青枯菌寄主及环境适应性进化的分子机理奠定基础。1.铜抗性候选基因copA、copD、copSR基因功能验证铜MIC测定结果表明Po82△copA、Po82△copD及Po82△copSR菌株的铜抗性MIC值都较野生型菌株降低。致病力测定结果表明,相较于野生型菌株,Po82△copA菌株的致病力下降,Po82△copSR菌株的致病力增强,而Po82△copD菌株的致病力没有显著差异。生长曲线结果表明,在铜胁迫的环境中,copA、copD缺失菌株影响青枯菌的生长速率。运动性测定结果表明,copA基因与青枯菌的运动能力无关,copD、copSR基因的缺失影响青枯菌的运动能力。并且copA的缺失导致青枯菌对α-D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源,L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代谢利用速率降低。2.铜抗性基因簇表达调控测定qRT-PCR结果显示copSRABCD基因簇的表达受到铜离子的诱导,copABCD基因的表达量随着CuSO浓度的增加而增加,证实了该基因簇为诱导型表达。RT-PCR结果显示,copABCD为同一转录单位,copSR为同一转录单位。通过测定copSR基因缺失菌株中copABCD基因的表达模式,明确了copSR对copABCD基因的调控方式为负调控。3.青枯菌离体与体内转录组学研究研究明确了离体培养条件下,亚抑制铜浓度水平诱导不仅可正调控Po82和Po82△copABCD菌株铜抗性相关基因的表达,相当数量的致病相关基因的表达也显著上调。上调表达的致病相关基因大部分为hrp基因簇的组成基因和III型效应子(T3Es)编码基因。此外,离体铜诱导培养条件下,Po82和Po82△copABCD菌株中的czcABC、fur、marR等重金属和抗生素调控基因的表达量显著上调。在寄主体内环境中,copABCD基因簇缺失菌株上调表达Ⅳ型菌毛编码基因及致病相关基因。转录组测序结果为进一步明确copSRABCD基因簇的功能并发掘新的铜抗性及致病相关基因奠定基础。

关键词：铜抗性 copSRABCD 基因表达调控转录组致病性

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酿酒酵母铜抗性的研究

酿酒酵母铜抗性的研究

作者：盛冠一江南大学

学位级别：硕士

酿酒酵母作为一种模式菌株在生物研究领域被广泛应用，然而目前表达系统中将特定异源抗性基因或者营养缺陷性作为筛选标记，费用大且会对细胞有负面影响，廉价的筛选标记为研究者所一直寻找。铜离子是酿酒酵母生理代谢中所需微量元素，... 详细信息

酿酒酵母作为一种模式菌株在生物研究领域被广泛应用，然而目前表达系统中将特定异源抗性基因或者营养缺陷性作为筛选标记，费用大且会对细胞有负面影响，廉价的筛选标记为研究者所一直寻找。铜离子是酿酒酵母生理代谢中所需微量元素，但其浓度高时会抑制酵母细胞，酿酒酵母的cup1与ccc2是两个关键的铜抗性基因。以酿酒酵母铜抗性作为筛选标记不仅廉价、灵敏度高，而且对细胞有负面影响小，是一种理想的抗性筛选标记，而有关酵母铜抗性作为筛选标记的报道较少。本研究旨在构建一种廉价、安全、高敏感度的铜抗性酿酒酵母表达体系，并应用于外源蛋白的表达，同时也对酿酒酵母铜抗性机制进行初步研究。（1）为了构建高敏感度的铜抗性酿酒酵母，同时部分考察酿酒酵母铜抗性机制，本研究首先探究了不同铜离子浓度胁迫下酿酒酵母铜抗性基因cup1和ccc2的转录水平。结果表明：随着铜离子浓度的提高，酿酒酵母cup1、ccc2基因转录水平基本上都呈现先增加后减少的趋势，其中两基因均在0.6mM Cu2+时转录水平最高，与0mM Cu2+下两基因转录水平相比，两基因转录水平分别提高了3倍与1.3倍;在相同的铜离子浓度梯度下，cup1基因的转录水平大约是ccc2基因的两倍左右。由此推测，酿酒酵母cup1基因的大量转录更有助于抵御胞外浓度过高的铜离子产生的毒害作用。（2）构建高敏感度的铜抗性酿酒酵母，利用The PCR-mediated Technique技术，分别敲除酿酒酵母cup1、ccc2基因，得到S. cerevisiae W303-1Acup1与S. cerevisiae W303-1Accc2菌株。S. cerevisiae W303-1A cup1菌株对铜离子的最低抑制浓度达到0.08mM，最低抑制浓度降低了约93%;S. cerevisiae W303-1Accc2菌株对铜离子的最低抑制浓度达到0.8mM左右，最低抑制浓度降低了约33.3%。与S. cerevisiae W303-1Accc2相比，S. cerevisiae W303-1A cup1对铜离子更加敏感，可以推测，与ccc2基因相比，cup1基因在酿酒酵母铜抗性中起到更为关键的作用，酿酒酵母抗铜机制中金属螯合作用要大于其运送作用。S. cerevisiae W303-1A cup1为本研究所获得铜离子敏感性宿主，经培养测试，其菌落形态、发酵性能与S. cerevisiae W303-1A差异不显著。（3）构建并应用高敏感度的铜抗性酿酒酵母表达系统，以S. cerevisiae W303-1Acup1为宿主菌，利用pYX212载体为基本构架构建了以cup1作为筛选标记的pYX212M表达系统，0.3mM Cu2+的SC培养基作为筛选条件，阳性转化子概率为80%以上，pYX212M在含有0.3mM Cu2+的SC培养基中，质粒的稳定性平均在88%以上，并利用该系统成功表达了绿色荧光蛋白基因。该系统的建立为廉价筛选标记的广泛使用提供了一种方法。

关键词：酿酒酵母铜抗性 cup1 ccc2 半定量RT-PCR 基因敲除 pYX212M 绿色荧光蛋白

仔猪断奶前后大肠杆菌耐药性和铜抗性的差异比较

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仔猪断奶前后大肠杆菌耐药性和铜抗性的差异比较

仔猪断奶前后肠球菌和乳杆菌耐药性及铜抗性的差异比较

中国畜牧兽医学会动物营养学分会第七届中国饲料营养学术研讨会

作者：计徐郑卫江邹雪婷黄九锡姚文南京农业大学动物科技学院

大肠杆菌(Escherichia coli)是人和动物肠道内的正常菌,可通过自身基因突变和外源捕获耐药基因产生耐药性,也可将耐药基因通过质粒传递到肠道或环境中与其共存的其他细菌,在耐药基因的传播中起了重要作用。而在养猪生产过程中,断奶一周... 详细信息

大肠杆菌(Escherichia coli)是人和动物肠道内的正常菌,可通过自身基因突变和外源捕获耐药基因产生耐药性,也可将耐药基因通过质粒传递到肠道或环境中与其共存的其他细菌,在耐药基因的传播中起了重要作用。而在养猪生产过程中,断奶一周内的仔猪易出现大肠杆菌感染引起的腹泻(post-weaning diarrhea,PWD)。仔猪断奶腹泻一旦发生,会给养猪生产带来极大的经济损失,饲料中添加抗生素

关键词：仔猪大肠杆菌耐药性铜抗性

来源： cnki会议 cnki会议评论

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仔猪断奶前后肠球菌和乳杆菌耐药性及铜抗性的差异比较