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钙敏感性受体活化促进缺血/再灌注损伤心肌细胞的凋亡及炎症反应

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南京医科大学学报（自然科学版） 2012年第10期32卷 1366-1371页

作者：周雪媛严凌朱铁兵潘世阳王连生陶正贤杨志健曹克将南京医科大学第一附属医院心脏科江苏南京210029 临床中心实验室江苏南京210029

目的:探讨钙敏感性受体活化与心肌细胞缺血/再灌注损伤后凋亡及炎症反应的关系。方法:缺氧/复氧法处理新生大鼠心肌细胞,建立心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型。新生大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺血/再灌注组、GdCl3(C... 详细信息

目的:探讨钙敏感性受体活化与心肌细胞缺血/再灌注损伤后凋亡及炎症反应的关系。方法:缺氧/复氧法处理新生大鼠心肌细胞,建立心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型。新生大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺血/再灌注组、GdCl3(CaSR激动剂)组、GdCl3+SB203058(p38MAPK特异抑制剂)组。TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定钙敏感性受体(calcium-sensing receptor,CaSR)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达;免疫蛋白印迹法(Western blot)测定Caspase-3、Bcl-2和丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的蛋白表达。结果:模拟I/R增强了CaSR、TNF-α、IL-6、p38MAPK的表达及心肌细胞凋亡;GdCl3进一步增强了上述作用,而对Caspase-3和Bcl-2则分别起着正向及负向调节作用;与GdCl3组相比,GdCl3+SB203058组p38MAPK、TNF-α、IL-6的表达明显降低,而心肌细胞凋亡及CaSR的表达无明显改变。结论:CaSR激活不仅促进新生鼠心肌细胞I/R损伤后心肌细胞凋亡,且通过p38MAPK信号转导促进I/R区域的炎症反应。

关键词：钙敏感性受体凋亡心肌细胞缺血/再灌注炎症反应

钙敏感性受体在创伤失血性休克大鼠血管反应性调节中的作用及机制

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钙敏感性受体在创伤失血性休克大鼠血管反应性调节中的作用及机制

作者：彭小勇中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

创伤失血性休克是指由于各种创伤所致血管损伤、实质脏器破裂、骨折等引起机体出血、水肿以及渗出等一系列临床综合征。创伤失血性休克后存在血管低反应性,主要表现为血管对舒、缩血管活性药物不敏感,即反应性显著下降甚至不反应。血管... 详细信息

创伤失血性休克是指由于各种创伤所致血管损伤、实质脏器破裂、骨折等引起机体出血、水肿以及渗出等一系列临床综合征。创伤失血性休克后存在血管低反应性,主要表现为血管对舒、缩血管活性药物不敏感,即反应性显著下降甚至不反应。血管低反应性对休克的治疗和预后有严重的影响,是复苏后血压能否回升、休克最终能否成功救治的重要制约因素之一。相关资料显示,在临床ICU中约有30%-40%的病人死亡与血管低反应性有关。因此,深入阐明休克血管低反应性的发生机制具有重要意义。钙敏感性受体(Calcium-sensing Receptor,CaSR),是最早由Brown等在牛的甲状旁腺中发现,属于G蛋白偶联受体家族成员,它的主要作用是维持细胞内外的Ca稳定。近来研究发现,CaSR在心血管系统中也发挥重要的作用,如参与血管钙化和心肌细胞凋亡的调控。有研究显示,CaSR可通过血管内皮细胞调节血管舒张进而调节血压。但CaSR是否参与创伤失血性休克后血管低反应性的调节、其机制如何,目前尚不清楚。据此,本研究拟采用大鼠创伤失血性休克模型以及原代血管平滑肌细胞(VSMC),研究CaSR在创伤失血性休克后血管反应性调节中的作用及机制。主要内容包括两部分:○1 CaSR抑制剂Calhex231(Cal)是否通过调节血管反应性发挥对创伤失血性休克大鼠的保护作用;○2 Cal调节创伤失血性休克血管反应性的机制。目的是为进一步阐明血管低反应性的发生机制提供基础,并为寻找失血性休克新的治疗方法提供实验依据。主要实验方法:建立SD大鼠创伤失血性休克模型;用离体张力测定技术检测肠系膜上动脉(SMA)和心肌乳头肌对血管活性药物诱导的收缩反应性;采用微循环显微镜检测肠系膜微动脉(MA)收缩反应性;采用激光共聚焦显微镜检测单个VSMC收缩反应性;采用八通道数据采集分析仪检测血流动力学指标;采用激光散斑血流测定仪检测重要器官(肝、肾)血流量;采用心输出量测定仪检测心输出量;采用细胞收缩记录系统检测单个心肌细胞的收缩功能;采用ELISA试剂盒检测血甲状旁腺素(PTH)水平;采用蛋白免疫印迹(WB)检测CaSR、肌球蛋白轻链(MLC)、磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)、α肾上腺素受体(α-AR)及β肾上腺素受体(β-AR)的蛋白表达水平;qPCR检测microRNA(miR)相对表达量。研究内容:第一部分CaSR抑制剂Cal对创伤失血性休克大鼠的保护作用及与调节血管反应性的关系1.实验分为6组:正常组、休克组、乳酸林格氏液(LR)复苏组、LR+Cal 0.1mg/kg组、LR+Cal 1mg/kg组以及LR+Cal 5mg/kg组,观察不同剂量Cal对创伤失血性休克大鼠存活情况(存活率和存活时间)和血流动力学指标的影响。2.依据实验结果选择合适的Cal剂量用于后续实验。实验分为4组:正常组、休克组、LR组以及LR+Cal 1mg/kg组,观察Cal对创伤失血性休克大鼠重要器官(肝、肾)血流量的影响;检测Cal对创伤失血性休克大鼠心输出量、心肌乳头肌以及急性分离的心肌细胞的收缩反应性的影响;检测Cal对创伤失血性休克大鼠SMA和MA血管反应性以及急性分离的VSMC收缩反应性的影响。第二部分CaSR抑制剂Cal调节创伤失血性休克大鼠血管反应性与MLC磷酸化、肾上腺素受体及miR的关系1.同上建立大鼠创伤失血性休克模型,收集血样及SMA组织样本,检测血PTH水平,检测SMA组织中CaSR、MLC、p-MLC、α-AR及β-AR蛋白表达水平,以及miRs(miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-208a、miR-1)相对表达量。2.采用大鼠原代培养的VSMC,观察Cal和CaSR-siRNA处理对CaSR蛋白表达水平、miRs(miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-208a、miR-1)相对表达量的影响。研究结果:一、Cal通过调节血管反应性发挥对创伤失血性休克大鼠的保护作用1.创伤失血性休克后大鼠在数小时内全部死亡,单纯给予LR复苏仅轻度延长休克大鼠的存活时间,Cal治疗能明显提高休克大鼠的存活率和存活时间。创伤失血性休克后大鼠血流动力学指标(MAP、LVSP以及±Dp/Dt)明显降低,LR治疗也只有轻度改善作用,Cal治疗能显著改善上述各项指标,以Cal 1mg/kg的效果最为显著。2.创伤失血性休克后大鼠重要器官(肝、肾)血流量明显降低,LR复苏仅轻度增加血流量,Cal治疗能明显增加肝、肾血流量。创伤失血性休克后大鼠心输出量、心肌乳头肌以及急性分离的心肌细胞收缩反应性均降低,LR复苏即能显著改善上述指标,Cal治疗与单纯LR治疗效果无明显差异。创伤失血性休克引起了严重的血管低反应性,包括SMA、MA以及急性分离的VSMC的收缩反应性均降低,LR治疗仅有轻度改

关键词：钙敏感性受体创伤失血性休克血管低反应性 Calhex231 α1-肾上腺素受体肌球蛋白轻链磷酸化 miR-429 miR-208a

钙敏感性受体和活性维生素D在钙磷平衡和骨骼代谢中的相互作用及机制研究

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钙敏感性受体和活性维生素D在钙磷平衡和骨骼代谢中的相互作用及...

作者：陶春香南京医科大学

学位级别：硕士

为了研究钙敏感性受体(CaSR)和活性维生素D[1,25(OH)D]在钙磷平衡和骨骼代谢中的相互作用及机制,我们建立了CaSR和25羟维生素D-1-α羟化酶[1α(OH)ase]双基因敲除[CaSR1α(OH)ase]小鼠模型,比较分析了2周龄CaSR1α(OH)ase小鼠与相应单... 详细信息

为了研究钙敏感性受体(CaSR)和活性维生素D[1,25(OH)D]在钙磷平衡和骨骼代谢中的相互作用及机制,我们建立了CaSR和25羟维生素D-1-α羟化酶[1α(OH)ase]双基因敲除[CaSR1α(OH)ase]小鼠模型,比较分析了2周龄CaSR1α(OH)ase小鼠与相应单基因敲除及野生型(WT)同窝小鼠的表型差异。与先前的研究结果一致,约85%的CaSR小鼠在出生后两周内死亡,幸存至两周者体格小,体重轻,血钙明显升高,血磷降低,血甲状旁腺素(PTH)水平明显升高,甲状旁腺肥大。两周龄1α(OH)ase小鼠表现为轻度低钙低磷血症,血PTH升高50%,甲状旁腺中度肥大,但能存活到成年。CaSR1α(OH)ase小鼠生存期较CaSR小鼠延长,2周和4周龄CaSR1α((OH)ase小鼠生存率分别为91%和42%。2周龄CaSR1α(OH)ase小鼠体重较CaSR小鼠明显增加,血钙正常,血磷较CaSR和1α(OH)ase小鼠低,血PTH水平较CaSR小鼠更高。这些结果说明,1α(OH)ase基因敲除能通过纠正CaSR小鼠的高钙血症而延长其存活期,但由于更严重的高PTH血症致使CaSR1α(OH)ase小鼠不能存活至成年。为了明确CaSR和1,25(OH)D在骨骼生长发育过程中的相互作用,我们通过影像学和组织学比较分析了2周龄不同基因型小鼠骨骼的表型差异。CaSR小鼠表现为严重的骨骼生长障碍,包括长骨短小,钙化的次级骨化中心缺如,骨密度降低,但干骺端小梁骨密度增加。1α(OH)ase小鼠长骨略短,钙化的骺端较小,骨密度轻度降低。CaSR1α(OH)ase小鼠长骨长度、皮质骨和小梁骨密度均较CaSR小鼠明显增加。这些结果说明1α(OH)ase基因敲除能够部分改变CaSR缺失引起的严重的骨骼生长发育。为了明确CaSR和1,25(OH)D在软骨内成骨中的相互作用,我们通过组织学和免疫组织化学的方法分析比较了2周龄不同基因型小鼠生长板的表型差异。CaSR小鼠表现为次级骨化中心形成延迟,增殖细胞核抗原(PCNA)阳性软骨细胞减少,软骨细胞肥大带明显增宽。1α(OH)ase小鼠生长板和肥大带宽度较WT小鼠稍有增宽。在2周龄CaSR1α(OH)ase小鼠,次级骨化中心已开始形成,肥大软骨细胞中已开始出现血管和成骨细胞。生长板和肥大带宽度较CaSR小鼠明显变窄,而PCNA阳性软骨细胞则较CaSR小鼠明显增加。鉴于甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)在软骨细胞增殖和分化中起有重要作用,我们通过PTHrP免疫组织化学染色发现PTHrP阳性细胞在CaSR小鼠明显减少,而在CaSR1α(OH)ase小鼠则较CaSR小鼠有所增加,但没有达到WT小鼠的水平。这些结果说明,1α(OH)ase基因敲除能够通过上调PTHrP,增加软骨细胞的增殖而起到部分纠正CaSR缺失引起的软骨内成骨的严重障碍。为了明确CaSR和1,25(OH)D在骨形成和骨吸收中的相互作用,我们通过组织学,组织化学和免疫组织化学及图像分析检测了两周龄不同基因型小鼠骨组织的表型差异。与WT小鼠相比,成骨细胞数、小梁骨容量和骨钙素(OCN)阳性面积在CaSR小鼠均明显增加;在1α(OH)ase小鼠则有所减少,而在CaSR1α(OH)ase小鼠增加更为明显。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性破骨细胞数在CaSR小鼠增加,在1α(OH)ase小鼠减少;而在CaSR1α(OH)ase小鼠与WT小鼠相似。NF-κB受体活化素配体(receptoractivatior of NF-κB ligand,RANKL)阳性细胞和面积变化与成骨细胞的变化一致。这些结果说明,CaSR缺失引起的成骨细胞骨形成增加是由于PTH过代偿作用的结果。本研究进一步阐述了CaSR和1,25(OH)D在调节钙磷平衡,甲状旁腺细胞生长和PTH产生以及软骨内成骨和成骨细胞骨形成中的相互作用的机制,为后续研究和临床相关疾病的诊治提供了实验和理论依据。

关键词：钙敏感性受体 1α羟化酶甲状旁腺素钙磷平衡骨骼代谢

血管内皮生长因子165通过抑制钙敏感性受体减少缺血/再灌注心肌细胞凋亡

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中国临床药理学与治疗学 2011年第1期16卷 26-32页

作者：章斌许智惠陶正贤南京医科大学第一附属医院心胸外科南京医科大学第一附属医院心内科

目的:探讨血管内皮生长因子165(vascu-lar endothelial growth factor 165,VEGF165)在缺血/再灌注损伤中的抗细胞凋亡作用及与钙敏感性受体(calciumsensing receptor,CaSR)表达下调的关系。方法:新生鼠心肌细胞在模拟心肌缺血状态下孵育... 详细信息

目的:探讨血管内皮生长因子165(vascu-lar endothelial growth factor 165,VEGF165)在缺血/再灌注损伤中的抗细胞凋亡作用及与钙敏感性受体(calciumsensing receptor,CaSR)表达下调的关系。方法:新生鼠心肌细胞在模拟心肌缺血状态下孵育2 h,然后在标准培养液中再培养24 h,从而建立一个模拟心肌缺血/再灌注模型。通过末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL法)检测心肌细胞凋亡。CaSR mRNA表达通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定。通过免疫印迹法(Westernblot)测定促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2含量。结果:模拟的缺血/再灌注后CaSR mRNA的表达(I/R组:2.6±0.4;对照组:1.0±0.3,P<0.01)和TUNEL阳性细胞增加(I/R组:15.3%±2.5%;对照组:2.9%±1.4%,P<0.01)。GdCl3、CaSR mRNA的表达(GdCl3组:4.5±0.6;I/R组:2.6±0.4,P<0.01)及TUNEL阳性细胞进一步增加(GdCl3组:25.4%±2.6%;I/R组:15.3%±2.5%,P<0.01),同时上调了Bax表达(GdCl3组:1.93±0.28;I/R组:1.50±0.21,P<0.01),下调了Bcl-2的表达(GdCl3组:0.82±0.18;I/R组:1.71±0.30,P<0.01)。VEGF165组Bax表达减少(GdCl3+VEGF165组:1.12±0.23;GdCl3组:1.93±0.28,P<0.05)和Bcl-2的表达增加(GdCl3+VEGF165组:2.56±0.54;GdCl3组:0.82±0.18,P<0.05),TUNEL阳性细胞减少(GdCl3+VEGF165组:11.8%±1.9%;GdCl3组:25.4%±2.6%,P<0.05),CaSR mRNA的表达下调(GdCl3+VEGF165组:1.5±0.4;GdCl3组:4.5±0.6,P<0.01)。结论:VEGF165通过抑制CaSR,促进Bcl-2和抑制Bax的表达来减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。

关键词：血管内皮生长因子钙敏感性受体凋亡心肌细胞缺血/再灌注

吡那地尔预处理对缺氧/复氧大鼠心肌细胞钙敏感性受体的影响

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临床麻醉学杂志 2012年第8期28卷 804-806页

作者：邓胜利喻田姚刚张琳罗果遵义医学院麻醉学系遵义市563003 遵义医学院附属医院麻醉科遵义医学院实验室中心遵义市563003

目的探讨吡那地尔预处理对缺氧/复氧后心肌细胞钙敏感性受体(calcium-sensingreceptor,CaSR)的影响。方法通过离体大鼠心脏灌注装置,分离成年大鼠心肌细胞随机分为四组,其中正常组(N组)常规培养,另三组缺氧45min、复氧60min制作缺氧/复... 详细信息

目的探讨吡那地尔预处理对缺氧/复氧后心肌细胞钙敏感性受体(calcium-sensingreceptor,CaSR)的影响。方法通过离体大鼠心脏灌注装置,分离成年大鼠心肌细胞随机分为四组,其中正常组(N组)常规培养,另三组缺氧45min、复氧60min制作缺氧/复氧模型;C组不做预处理;吡那地尔组(P组)和格列苯脲组(G组)在缺氧前用吡那地尔30μmol/L预处理15min;G组在吡那地尔处理前用格列苯脲50μmol/L处理5min。采用RT-PCR及Westernblot方法检测心肌细胞CaSR基因及蛋白表达情况。结果 C、P、G组CaSR基因表达水平及蛋白表达量明显高于N组(P敏感性钾通道的开放有关。

关键词：吡那地尔缺氧/复氧模型心肌细胞钙敏感性受体

CaSR抑制剂Calhex231通过PTH-AR途径参与创伤失血性休克大鼠血管低反应性的调节

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中国病理生理杂志 2021年第1期37卷 60-65页

作者：彭小勇胡弋薛明英李涛刘良明杨光明陆军特色医学中心野战外科研究部战伤休克与输血研究室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的:探讨钙敏感性受体(CaSR)抑制剂Calhex231(Cal)是否通过甲状旁腺素(PTH)-肾上腺素受体(AR)途径参与创伤失血性休克大鼠血管低反应性的调节。方法:检测Cal对创伤失血性休克大鼠血PTH水平的影响,并观察外源给予PTH对正常和休克大鼠血... 详细信息

目的:探讨钙敏感性受体(CaSR)抑制剂Calhex231(Cal)是否通过甲状旁腺素(PTH)-肾上腺素受体(AR)途径参与创伤失血性休克大鼠血管低反应性的调节。方法:检测Cal对创伤失血性休克大鼠血PTH水平的影响,并观察外源给予PTH对正常和休克大鼠血压的影响;Western blot法检测Cal对大鼠肠系膜上动脉(SMA)以及外源给予PTH对大鼠原代血管平滑肌细胞(VSMC)中2种AR亚型(α1-AR和β1-AR)蛋白表达水平的影响。结果:创伤失血性休克后大鼠血PTH水平显著升高,Cal治疗能够显著降低血PTH水平(P<0.01)。外源给予PTH能显著降低正常大鼠血压。在组织水平上,Cal能提高创伤失血性休克大鼠SMA中α1-AR蛋白表达水平(P<0.05);在细胞水平上,外源给予PTH能使大鼠原代VSMC中α1-AR蛋白表达水平降低,Cal能拮抗PTH降低α1-AR蛋白表达的作用(P<0.05)。结论:CaSR抑制剂Cal可通过降低血PTH水平、上调血管α1-AR蛋白表达水平而发挥改善休克后血管低反应性的作用。

关键词：钙敏感性受体 Calhex231 甲状旁腺素肾上腺素受体血管低反应性

CaSR在大鼠血管收缩/舒张反应性调节中的作用

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局解手术学杂志 2016年第9期25卷 629-632页

作者：彭小勇李涛刘良明杨光明第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的研究钙敏感性受体(Ca SR)激动剂对大鼠肠系膜动脉收缩和舒张反应性的影响、以及内皮在其中的作用。方法采用内皮完整和内皮去除的大鼠肠系膜动脉,观察Ca SR特异性激动剂cinacalcet对血管基础张力和预收缩的血管张力的影响、以及不... 详细信息

目的研究钙敏感性受体(Ca SR)激动剂对大鼠肠系膜动脉收缩和舒张反应性的影响、以及内皮在其中的作用。方法采用内皮完整和内皮去除的大鼠肠系膜动脉,观察Ca SR特异性激动剂cinacalcet对血管基础张力和预收缩的血管张力的影响、以及不同剂量cinacalcet预处理对去甲肾上腺素(NE)诱导的血管收缩反应性和乙酰胆碱诱导的舒张反应性的影响。结果Ca SR激动剂cinacalcet对静息状态下内皮完整和内皮去除的血管基础张力均无明显影响。在内皮完整的血管环,cinacalcet对预收缩血管有明显的舒张作用,并呈剂量依赖性;内皮去除取消了cinacalcet的舒张作用。Cinacalcet预处理30 min,使内皮完整的血管的收缩反应性明显降低,而对舒张反应性无明显影响。对去除内皮的血管环,cinacalcet预处理对血管收缩/舒张反应性均无明显影响。结论 Ca SR在血管收缩反应性调节中有重要作用,并有明显的内皮依赖性。

关键词：钙敏感性受体 cinacalcet 内皮收缩反应性舒张反应性