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微生物学报 2020年第9期60卷 1985-1998页

作者：黄珊珊马丽媛王红梅刘学端中国地质大学(武汉)环境学院湖北武汉430074 中南大学生物冶金教育部重点实验室湖南长沙410083 中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室湖北武汉430074

【目的】通过对酸性矿山环境中嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、钩端螺旋菌属(Leptospirillum)、硫化杆菌属(Sulfobacillus)、酸原体属(Acidiplasma)和铁质菌属(Ferroplasma)的100株冶金微生物基因组中CRISPR-Cas系统的结构特征和同源关系进行生物信息学分析,在基因组水平上解析冶金微生物基于CRISPR系统对极端环境的适应性免疫机制。【方法】从NCBI网站下载基因组序列,采用CRISPR Finder定位基因组中潜在的CRISPR簇。分析CRISPR系统的组成结构与功能:利用Clustal Omega对重复序列(repeat)分类;将间隔序列(spacer)分别与nr数据库、质粒数据库和病毒数据库比对,获得注释信息;根据Cas蛋白的种类和同源性对酸性矿山环境微生物的CRISPR-Cas系统分型。【结果】在100株冶金微生物基因组中共鉴定出415个CRISPR簇,在176个cCRISPR簇中共有80种不同的重复序列和4147条间隔序列。对重复序列分类,发现12类重复序列均能形成典型的RNA二级结构,Cluster 10中的重复序列在冶金微生物中最具有代表性。间隔序列注释结果表明,这些微生物曾遭受来自细菌质粒与病毒的攻击,并通过不同的防御机制抵抗外源核酸序列的入侵。冶金微生物细菌的大部分CRISPR-Cas系统属于I-C和I-E亚类型,而古菌的CRISPR-Cas系统多为I-D亚类型,两者基于CRISPR-Cas系统的进化过程中存在显著差异。【结论】酸性矿山环境微生物的CRISPR结构可能采用不同免疫机制介导外源核酸序列与Cas蛋白的相互作用,为进一步揭示极端环境微生物的适应性进化机理奠定了基础。

关键词：酸性矿山环境 CRISPR-Cas 系统重复序列间隔序列适应机制

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安徽铜陵酸性矿山环境酵母菌多样性以及酵母菌AMDX1-5和AMDY2-5的鉴定和性质研究

安徽铜陵酸性矿山环境酵母菌多样性以及酵母菌AMDX1-5和AMDY2-5的...

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作者：崔丹丹南京大学

学位级别：硕士

本文开展了安徽铜陵酸性矿山环境中酵母菌的多样性及特定酵母菌的系统鉴定和性质的研究。从安徽铜陵狮子山酸性矿山环境中采集酸矿水、酸矿水底泥以及尾砂样品,采用四种培养基(YE、Fe、FeT、FeS)进行培养,经过分离纯化获得39株酵母菌。... 详细信息

本文开展了安徽铜陵酸性矿山环境中酵母菌的多样性及特定酵母菌的系统鉴定和性质的研究。从安徽铜陵狮子山酸性矿山环境中采集酸矿水、酸矿水底泥以及尾砂样品,采用四种培养基(YE、Fe、FeT、FeS)进行培养,经过分离纯化获得39株酵母菌。通过ITS和D1/D2序列、同源性分析,MEGA5.0制作系统进化树,表明分离得到的39株中酵母菌主要来自于Rhodotorula、Rhodosporidium、 Candida、Cryptococcus属,其中有一株酵母菌AMDX1-5经过同源性分析,与其最相似的菌株是一株霉菌Zymoseptoria brevis,但与Zymoseptoria brevis形态特征完全不同,因此酵母菌AMDX1-5可能为一个新种。菌株AMDX1-5在YPD培养基中的特征如下：菌落大小为1mm,菌落为圆形,边缘完整,表面光滑,菌落凸起,不粘稠,不透明,菌落颜色为浅粉色。菌体单细胞,椭圆形,无性繁殖,繁殖方式为芽殖。在pH1.5不可以生长,在pH为2.0-8.0均可生长,最适生长pH值为4.0。在5℃-30℃下均可生长,在37℃下不能生长,最适生长温度为25℃。在盐度为0%-3%下均可生长,最适生长盐度为0%。可以利用葡萄糖、麦芽糖、ONPG作为碳源生长,但不能利用半乳糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、果糖、纤维二糖、棉子糖、蜜二糖、松三糖、葡萄糖胺、甘露糖、阿拉伯糖等,可以利用硝酸盐和亚硝酸盐,但作用不明显,具有淀粉酶活性,不具有脲酶活性。菌株AMDY2-5在YPD培养基中的特征如下：菌落大小为1.5-2mm,菌落为圆形,边缘完整,表面光滑,菌落凸起,较粘稠,不透明,菌落颜色为白色。菌体单细胞,圆形,无性繁殖,繁殖方式为芽殖。在pH1.5不可以生长,在pH为2.0-8.0均可生长,最适生长pH值为4.0。在5℃-30℃下均可生长,在37℃下不可以生长,最适生长温度为25℃。在盐度为0%-3%下均可生长,最适生长盐度为0%。可以利用麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、葡萄糖胺、甘露糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖作为碳源生长,但不能利用ONPG、核糖、木糖、鼠李糖、乳糖、果糖、棉子糖、蜜二糖、松三糖等,可以利用硝酸盐,不具有淀粉酶活性,具有脲酶活性,鉴定为白色隐球酵母(Cryptococcus metallitolerans)。对菌株AMDX1-5以及AMDY2-5的耐酸性进行了研究,短时间内酸性应激表明,AMDX1-5在酸应激的初期对酸有着很强的耐受能力,但随着酸应激时间的延长,AMDX1-5对酸的应激能力下降。而AMDY2-5在酸应激的初期对酸耐受能力很弱,但随着酸应激时间的延长,AMDY2-5对酸的应激能力增强。pH2与pH4下酵母菌的生长情况表明,AMDX1-5在pH为2的培养基中的生物量一直低于在pH4中的生物量。AMDY2-5在pH为2的培养基中的第一天的生物量显著低于在pH4中第一天的生物量,但生长速度几乎保持一致。胞内pH实验表明,在培养基pH2.0-8.0的范围内,AMDX1-5的胞内pH调节能力较差,只有在pH3.0、4.0、5.0、6.0的液体培养基中,胞内pH为中性,而AMDY2-5的胞内pH调节能力很强,都呈中性。

关键词：酸性矿山环境酸矿水底泥尾砂酵母菌 AMDX1-5 AMDY2-5 耐酸性

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安徽铜陵酸性矿山环境中微生物功能群多样性分析及铁还源功能菌NJU-T2的鉴定和性质研究

安徽铜陵酸性矿山环境中微生物功能群多样性分析及铁还源功能菌NJ...

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作者：罗蕾南京大学

学位级别：硕士

本文详细研究了安徽铜陵酸性矿山环境中微生物功能群多样性及铁还原功能菌NJU-T2的鉴定和性质。从安徽铜陵狮子山杨山冲酸性矿山环境中采集尾砂样品及酸性矿山排水,利用Overlay分离技术,采用YE、Feo、FeSo、FeTo四种选择性培养基筛选纯... 详细信息

本文详细研究了安徽铜陵酸性矿山环境中微生物功能群多样性及铁还原功能菌NJU-T2的鉴定和性质。从安徽铜陵狮子山杨山冲酸性矿山环境中采集尾砂样品及酸性矿山排水,利用Overlay分离技术,采用YE、Feo、FeSo、FeTo四种选择性培养基筛选纯化得到多株细菌。经16S rDNA序列同源性分析,利用MEGA5.0制作系统进化发育树图,结果表明分离得到的微生物主要属于Acidithiobacillus、Acidosphaera、Acidocella、Acidiphilium等属,主要分为4个功能群：嗜酸性异养菌、嗜酸性自养菌、中度嗜酸性铁氧化细菌、嗜酸性铁还原细菌。这些微生物功能群在酸性矿山环境中对于维系酸矿水的形成、发展起到至关重要的作用,主要表现在以下方面：嗜酸性自养菌参与酸矿水中铁、硫元素的氧化,是酸矿水中的主要生产者;嗜酸性自养菌将硫化物矿物中低价态硫氧化为硫酸根,获得能量将二氧化碳固定为有机物,并能产生生长因子等物质,供酸矿水中其他微生物生长利用;嗜酸性异养菌主要参与酸矿水中三价铁的异化还原和维持寡营养状态;嗜酸性铁还原细菌主要参与Fe3+的还原,通过与铁氧化细菌的协同作用,可以实现酸矿水中Fe2+和Fe3+之间铁元素之间的动态平衡,从而使得酸矿水成为一个相对稳定的生态系统。利用多相系统分类方法对从尾砂样品中分离得到的菌株NJU-T2进行了鉴定。NJU-T2主要特征如下：菌落呈白色,近圆形,边缘整齐,表面干燥。菌体杆状,无芽孢,革兰氏阴性,菌体大小(长×宽)：1.0-3.0μm×0.2-0.3μm,菌体呈滑行运动;NJU-T2为好氧菌;生长盐度范围为0-3.5%,最适生长盐度为0%;在pH2.0-6.0均可生长,最适生长pH值为2.5;在4℃-40℃均可生长,最适生长温度为30℃：能够在FeTo、Fe3TSB、Waksman培养基上生长,但不能在MA、NA、TSB、R2A、Starky-Na2S2O3培养基上生长;不含Fexirubin色素;可利用血清菊糖和水杨素作为碳源生长,但不能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、核糖、鼠李糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、麦芽糖、木糖、乳糖等;不能利用硝酸盐及亚硝酸盐,不能使明胶液化,不具淀粉酶、脲酶活性;NJU-T2的16S rDNA序列与已报道的菌种Acidithiobacillus ***-2 (DQ675569.1)和Acidithiobacillus thiooxidans strain WJSo(AY495961.1)的16S rRNA基因序列的同源性均为100%。对NJU-T2的平板培养和液体培养实验均证实,NJU-T2具有在有氧条件下还原Fe3+的能力。实验表明,NJU-T2在pH为2.5,温度为30℃条件下生长最好,最适还原Fe3+浓度为10mmol/L。NJU-T2能还原Fe3+,为铁氧化菌提供了初始能源Fe2+,维持了整个酸性环境系统中的铁平衡,同时NJU-T2具有硫氧化的功能,NJU-T2能够氧化单质硫,将NJU-T2置于Fe3TSB液体培养基中培养,可以发现随着时间的变化,培养液的pH值降低并检测有硫酸的产生。

关键词：酸性矿山环境酸矿水尾砂微生物功能群 Overlay分离技术荧

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安徽铜陵酸性矿山环境微生物功能群分析及典型功能菌NJU-T1的鉴定和性质研究

安徽铜陵酸性矿山环境微生物功能群分析及典型功能菌NJU-T1的鉴定...

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作者：邢辉南京大学

学位级别：硕士

本文研究了安徽铜陵酸性矿山环境中微生物功能群多样性及典型功能微生物的系统鉴定和性质。从安徽铜陵狮子山酸性矿山环境中采集得到酸性矿山排水、酸性矿山排水底泥及尾砂样品,采用可培养与不可培养两种微生物研究技术对铜陵狮子山酸... 详细信息

本文研究了安徽铜陵酸性矿山环境中微生物功能群多样性及典型功能微生物的系统鉴定和性质。从安徽铜陵狮子山酸性矿山环境中采集得到酸性矿山排水、酸性矿山排水底泥及尾砂样品,采用可培养与不可培养两种微生物研究技术对铜陵狮子山酸性环境微生物多样性进行研究分析,可培养研究主要采用MPN计数及YE、Feo、FeSo、FeTo四种选择性培养基进行培养计数,利用Overlay分离技术,筛选纯化得到14株细菌。经16S rRNA基因测序、同源性分析,利用MEGA5.0制作系统进化发育树图,结果表明分离得到的14株微生物主要属于Acidithiobacillus、Acidosphaera、Acidocella、Acidiphilium等属,可分为4个功能群：嗜酸性异养菌、嗜酸性自养菌、中度嗜酸性铁氧化细菌、中度嗜酸性铁还原细菌。嗜酸性异养菌主要与酸矿水中三价铁的异化还原和寡营养状态的维持有关;嗜酸性自养菌与酸矿水中铁、硫元素的氧化有关,是酸水中的生产者;嗜酸性自养菌将硫化物矿物中低价态硫氧化成硫酸根,产生的能量可以将二氧化碳固定为有机物,并产生生长因子等物质,供酸矿水中其他微生物生长利用;通过嗜酸性铁还原细菌与铁氧化细菌的协同作用,可以实现酸矿水中Fe2+和Fe3+、酸矿水和酸矿水底泥之间铁元素的动态平衡,从而使得酸矿水成为一个相对稳定的生态系统。利用多相系统分类法对从尾砂中分离得到的菌株NJU-T1进行系统生物学鉴定。NJU-T1特征如下：菌落呈白色,近圆性,边缘整齐,表面干燥。菌体单细胞,无芽孢,呈杆状,革兰氏阴性,菌体大小(长×宽)：1.0-3.0μm×0.2-0.3μm,菌体呈滑行运动;NJU-T1不能在厌氧条件下生长,为好氧菌;生长盐度为0-5%,最适生长盐度为0%;在pH2.0-6.0均可生长,最适生长pH值为4.5～5.0;在5-40℃均可生长,最适生长温度为30℃;能够在FeTo、FeSo、Feo培养基上生长,但不能在MA、NA、TSA、R2A培养基中生长;不含Fexirubin色素;可利用阿拉伯糖和水杨素作为碳源生长,但不能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、核糖、鼠李糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、麦芽糖、木糖、乳糖等;不能利用硝酸盐及亚硝酸盐,不能使明胶液化,不具淀粉酶、脲酶活性;菌体细胞主要脂肪酸成分有18:1w7c,16:1w7c/16:1w6c,16:0,14:03OH/16:1iso I和12:0;NJU-T1所含主要醌类物质为甲基萘醌MK-7;系统进化树图表明,NJU-T1与Acidithiobacillus caldus、Thermophilic bacterium同源性较近,同源性均为95%,综上形态观察、生理生化性质以及16S rRNA基因序列同源性分析结果表明,该菌株可能属于Acidithiobacillus属的一个新典型种。对NJU-T1进行了性质研究,平板培养和液体培养实验均证实,NJU-T1具有在有氧条件下还原Fe3+的能力。实验表明,NJU-T1在pH为4.5,温度为30℃条件下生长最好,最适还原Fe3+浓度为5mmol/L,还原铁的作用位点可能是位于细胞外膜上。NJU-T1能还原Fe3+,为铁氧化菌提供了初始能源Fez+,维持了整个酸性环境系统中的铁平衡。

关键词：酸性矿山环境酸矿水尾砂底泥 Overlay分离技术微生物功能群荧光计数 DGGE TRFLP NJU-T1 多相分类铁还原

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安徽铜陵酸性矿山环境中微生物群落构成调查

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中学生物学 2014年第4期30卷 33-35页

作者：李旭谢世鹏胡聪聪吕铖徐清萌邢辉南京师范大学附属中学

生物兴趣小组对酸性矿山环境的微生物群落进行了调查分析,利用FeO、改良NA培养基两种选择性培养基从铜陵狮子山尾矿区采集的酸性矿山废水和尾砂样品中分离纯化得到8株微生物,通过对其形态特征观察和16S rRNA基因序列分析,得到的8株微生... 详细信息

生物兴趣小组对酸性矿山环境的微生物群落进行了调查分析,利用FeO、改良NA培养基两种选择性培养基从铜陵狮子山尾矿区采集的酸性矿山废水和尾砂样品中分离纯化得到8株微生物,通过对其形态特征观察和16S rRNA基因序列分析,得到的8株微生物可分为Acidiphilium、Acidisphaera等5个属微生物。

关键词：酸性矿山环境微生物培养调查

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