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PCR-RFLP与多引物对PCR乙肝病毒基因分型方法的比较

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复旦学报（医学版） 2004年第5期31卷 534-537页

作者：彭亮丁静娟贵阳医学院附属医院感染科贵州省贵阳市550004

目的　PCR RFLP与多引物对PCR的乙肝病毒基因分型方法学比较。方法　自行设计利用限制性内切酶MboⅠ、BsTNⅠ、BsmAⅠ、HpaⅡ酶切S基因片段鉴定HBV基因型 (A～F)的PCR RFLP方法。分别利用该方法和多引物对PCR对贵州地区 14 9份HBsAg、HB... 详细信息

目的　PCR RFLP与多引物对PCR的乙肝病毒基因分型方法学比较。方法　自行设计利用限制性内切酶MboⅠ、BsTNⅠ、BsmAⅠ、HpaⅡ酶切S基因片段鉴定HBV基因型 (A～F)的PCR RFLP方法。分别利用该方法和多引物对PCR对贵州地区 14 9份HBsAg、HBVDNA阳性血清进行病毒基因分型。结果　 14 9份乙肝患者血清中PCR -RFLP方法成功分型 12 8份 (85 .91% ) ,多引物对PCR方法成功分型 10 8份 (72 .4 8% )。两种方法均能成功分型的标本 10 7份 ,其中B型 5 2份 ,C型 5 5份 ;两种方法分型结果完全一致。结论　本PCR RFLP基因分型方法与多引物对PCR方法的分型结果一致 ,但PCR RFLP方法的成功率及敏感度较高 ,图谱简单易读。

关键词：基因分型乙肝病毒 PCR-RFLP 引物临床应用 HBV基因型方法学比较限制性内切酶酶切 PCR方法

关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究

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Acta Genetica Sinica 2002年第12期29卷 1126-1131页

作者：姜涛刘越孔秀英贾继增中国农业科学院作物品种资源研究所农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室北京100081

细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷... 详细信息

细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷 ,并结合凝胶回收纯化技术 ,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上 ,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件 ,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间 ,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关键步骤。

关键词：细菌人工染色体 BAC 文库载体DNA 制备酶切脱磷凝胶回收纯化

贵州侗族、苗族和汉族人群乙型肝炎病毒基因型分布

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中华实验和临床病毒学杂志 2004年第3期18卷 230-233页

作者：丁静娟彭亮张权李忠唐光鹏贵阳医学院附院感染病科 550004 黔东南州医院传染科黔东南州疾病控制中心

目的　了解贵州侗、苗、汉族HBV感染者的基因型。方法　比较 12 7株各基因型HBV全序列S基因核苷酸序列 ,用DNA分析软件筛选出 3个限制性内切酶。设计 3条HBVS区引物并进行聚合酶链反应扩增 ,产物经MboⅠ、BstNⅠ或BsmAⅠ酶切 ,分析酶切... 详细信息

目的　了解贵州侗、苗、汉族HBV感染者的基因型。方法　比较 12 7株各基因型HBV全序列S基因核苷酸序列 ,用DNA分析软件筛选出 3个限制性内切酶。设计 3条HBVS区引物并进行聚合酶链反应扩增 ,产物经MboⅠ、BstNⅠ或BsmAⅠ酶切 ,分析酶切产物电泳图谱 ,建立区分HBV(A～F)基因型的方法。对贵州 16 6份侗、苗、汉族HBV感染者血清进行基因分型 ,5份PCR产物直接测序验证分型方法的准确、可靠。结果　S基因PCR RFLP分型结果准确 ,5份酶切鉴定结果经测序证实。 16 6份标本中 ,B基因型 138份 (83 13% ) ,C型 2 8份 (16 87% ) ,未发现B、C以外的其他基因型。侗族的 4 8例中 ,4 7例为B型 (97 92 % ) ,1例C型 (2 0 8% ) ,苗族的 5 2例中 ,4 9例为B型(94 2 3% ) ,3例C型 (5 77% ) ;6 6例汉族也以B基因为主 (6 3 6 4 % ,4 2 6 6 ) ,但C型有 2 4例 (36 36 % ) ,与侗、苗族HBV感染者相比 ,差异有显著意义 (χ2 =35 0 5 88,P <0 0 0 5 )。结论　贵州地区HBV基因型由B、C 2型构成 ,且以B基因型为主。汉族患者C型较多 ,而侗、苗族患者中B型是占绝对优势的基因型。

关键词： HBV感染乙型肝炎病毒基因型汉族 B基因患者 S基因 HBV基因型酶切贵州地区电泳图谱

利用LC-MS/MS法解析化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列

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中国新药杂志 2023年第3期32卷 301-310页

作者：胡馨月丁晓丽孙悦秦希月张慧李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室北京102629 吉林大学长春130015

目的:德谷胰岛素和地特胰岛素是以长链脂肪酸化学修饰为代表的第3代胰岛素类似物,有必要建立专属性强、灵敏度高的LC-MS/MS法测定化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列。方法:氨基酸序列测定方法的色谱参数为ACQUITY UPLC peptide BEH C1... 详细信息

目的:德谷胰岛素和地特胰岛素是以长链脂肪酸化学修饰为代表的第3代胰岛素类似物,有必要建立专属性强、灵敏度高的LC-MS/MS法测定化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列。方法:氨基酸序列测定方法的色谱参数为ACQUITY UPLC peptide BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7μm, 300A),流动相A为0.1%甲酸/水溶液,流动相B为0.1%甲酸/乙腈溶液,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1);质谱参数为MSE采集模式,碰撞能量为30~40 eV。结果:德谷胰岛素和地特胰岛素序列覆盖率良好,化学修饰位点的碎片离子y1&可检出,中高强度离子的离子强度RSD在15%之内,可有效区分与其他未修饰胰岛素的序列。结论:建立了重复性好、专属性强和耐用性好的脂肪侧链修饰型胰岛素类似物氨基酸序列LC-MS/MS方法,为该类产品序列结构的研究方法提供了借鉴意义。

关键词：脂肪侧链修饰型胰岛素类似物德谷胰岛素地特胰岛素 LC-MS/MS法氨基酸序列定位酶切

基于线粒体12S rRNA基因鉴别混合牛肉及制品的牛种来源

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遗传 2008年第8期30卷 1008-1014页

作者：陈冬柏凡周明亮张翔宇吴登俊四川农业大学动物科技学院雅安625014 四川省饲料工作总站成都610041

线粒体基因组具有种内高度保守性。它的12SrRNA基因同时具有抗腐蚀、耐高温的特点,而被用于饲料、鲜肉及肉制品的来源追踪和物种成分鉴别等研究。利用牦牛、普通牛、水牛作为研究材料,在牛线粒体12SrRNA基因通用引物扩增片段区域发现3... 详细信息

线粒体基因组具有种内高度保守性。它的12SrRNA基因同时具有抗腐蚀、耐高温的特点,而被用于饲料、鲜肉及肉制品的来源追踪和物种成分鉴别等研究。利用牦牛、普通牛、水牛作为研究材料,在牛线粒体12SrRNA基因通用引物扩增片段区域发现3种特异的酶切位点,可用于混合鲜牛肉及制品的牛种来源的鉴别。结果显示:牦牛12SrRNA扩增片段被酶切为203bp和250bp,普通牛为134bp和318bp,水牛为86bp和367bp,通过测序验证了特异性位点和酶切的正确性;对样品经过不同温度(100℃、120℃、140℃、160℃和180℃)处理均能扩增到目的条带,但条带从120℃开始变淡。该方法在鲜牛肉及制品的牛种来源鉴别上具有简单、快速、廉价等优点。

关键词： 12S rRNA 酶切牛线粒体基因内源参照基因

融合基因IFN-α1b/CSPⅡ原核表达载体的构建及在大肠埃希菌中的表达

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2005年第1期23卷 43-47页

作者：陈慧红余新炳高兴政北京大学医学部寄生虫学教研室北京100083 中山大学中山医学院寄生虫学教研室广州510089

目的　构建融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体并予以表达。　方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从人基因组DNA中扩增出IFN α1b基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b。利用PCR法从恶性疟原虫基因组... 详细信息

目的　构建融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体并予以表达。　方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从人基因组DNA中扩增出IFN α1b基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b。利用PCR法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出环子孢子蛋白Ⅱ区 (CSPⅡ )基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体pGEX 4T 1/CSPⅡ 。用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ将IFN α1b从原核重组质粒 pGEX 4T 1/IFN α1b中切下 ,克隆入经相同酶切的原核重组质粒pGEX 4T 1/CSPⅡ 中 ,构建融合基因的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ。融合基因IFN α1b/CSPⅡ经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,在大肠埃希菌中进行初步表达。　结果　构建的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b、pGEX 4T 1/CSPⅡ和 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ经PCR和酶切鉴定与预期结果一致。证实融合基因IFN α1b/CSPⅡ拼接成功并正确地克隆入原核表达载体。在大肠埃希菌中表达出融合蛋白IFN α1b/CSPⅡ ,该融合蛋白经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析与理论预测值相符。经蛋白质印迹法 (Westernblotting)鉴定具有免疫原性。　结论　构建了融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体。

关键词： IFN-α 原核表达载体融合基因大肠埃希菌 b/C 融合蛋白重组质粒克隆酶切 IPTG

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

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四川大学学报（医学版） 2004年第6期35卷 761-763页

作者：丁鹏冯忠堂王廷华董坚杨志敏路华路钢昆明医学院神经科学研究所昆明650031 昆明医学院第一附属医院中心实验室昆明医学院第一附属医院神经外科

目的　克隆大鼠脑组织中神经生长因子 (NGF) β亚基前体的全长序列 ,构建其真核表达载体 p EGFP-NGF。方法　采用 RT- PCR方法扩增 NGFβ亚基前体的全长序列 ,克隆入载体 p MD18- T,转化大肠杆菌 JM10 9,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴... 详细信息

目的　克隆大鼠脑组织中神经生长因子 (NGF) β亚基前体的全长序列 ,构建其真核表达载体 p EGFP-NGF。方法　采用 RT- PCR方法扩增 NGFβ亚基前体的全长序列 ,克隆入载体 p MD18- T,转化大肠杆菌 JM10 9,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析 ;利用高保真 Taq酶自重组质粒 p MD18- T/ NGF中扩增目的基因NGF,将目的基因与真核表达载体 p EGFP- N1行双酶切 ,T4连接酶连接 ,转化大肠杆菌 DH- 5 α,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果　 p MD18- T/ NGF测序结果与 Gen Bank的序列完全一致 ,p EGFP- NGF行限制性内切酶 H ind 、Bam H 酶切 ,可见酶切片断与插入基因长度相符。结论　成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子 (NGF) β亚基前体的全长序列 ,并构建其真核表达载体 p EGFP- NGF,为从分子水平开展 NGF转基因相关研究奠定了基础。

关键词： NGF 真核表达载体神经生长因子 EGFP 大鼠克隆脑组织酶切全长序列目的基因

HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第1期19卷 28-31页

作者：侯俊貌盼勇洪世雯胡燕杨健洋沈宏辉朱雷解放军第三○二医院病毒研究室北京100039

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌... 详细信息

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌BL2 1,经IPTG诱导 ,表达p2 4抗原。利用固定化金属离子 (Ni2 + )配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白。并运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳、WesternBlot(WB)及ELISA法分别对插入基因片段的正确性、表达产物的活性及特异性进行检测。结果　PCR产物约为 6 90bp ,与预期p2 4抗原全基因片段大小一致。重组质粒T-p2 4和pRSET-p2 4经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,其插入的外源基因片段均为 6 90bp。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS PAGE电泳 ,均可见一条约 2 4× 10 3的外源基因表达带 ,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA试验 ,证明基因工程表达的p2 4抗原具有较高的特异性及活性。结论　成功构建了HIVp2 4表达载体pRSET-p2 4 ,并在原核细胞中高效表达。

关键词： HIV 核心抗原高效表达纯化特异性活性原核系统表达载体酶切外源基因表达

用PCR-RFLP技术检测皮肤感染性肉芽肿组织中的分支杆菌

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北京大学学报（医学版） 2004年第5期36卷 462-465页

作者：蔡林张建中北京大学人民医院皮肤科北京100044

目的 :探讨用聚酶链反应 -限制性片段长度多态性分析 (PCR -RFLP)方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中的分支杆菌。方法 :皮肤感染性肉芽肿患者的组织标本 5份 ,提取组织DNA进行巢式PCR扩增 ,对PCR产物分别用HhaⅠ、MboⅠ、BstUⅠ 3种... 详细信息

目的 :探讨用聚酶链反应 -限制性片段长度多态性分析 (PCR -RFLP)方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中的分支杆菌。方法 :皮肤感染性肉芽肿患者的组织标本 5份 ,提取组织DNA进行巢式PCR扩增 ,对PCR产物分别用HhaⅠ、MboⅠ、BstUⅠ 3种限制性内切酶进行酶切 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,进行RFLP分析 ,并与培养结果进行比较。结果 :从 2份临床诊断为游泳池肉芽肿的组织标本中检测出海分支杆菌 ,从 1份诊断为皮肤感染性肉芽肿的标本中检测出结核分支杆菌 ,此 3例结果与培养鉴定结果完全一致。另两份标本分别检测出结核分支杆菌和偶发分支杆菌。结论 :用PCR -RFLP方法可以快速鉴定皮肤感染性肉芽肿中的分支杆菌 ,可协助临床进行疾病的早期诊断和及时治疗。

关键词：皮肤感染肉芽肿结核分支杆菌组织标本诊断 PCR-RFLP技术培养鉴定 PCR产物限制性内切酶酶切