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逆锁键调控野生型和功能增强型ADAMTS13与VWF A2结构域的相互作用

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医用生物力学 2022年第5期37卷 888-894页

作者：龙泉杨俊贤肖波涛林蒋国华南理工大学生物科学与工程学院广州510006 广东省人民医院(广东省医学科学院)医学研究部广州510080

目的探究瞬时接触时间下野生型(wild⁃type,WT)和功能增强型(gain⁃of⁃function,GOF)金属蛋白酶ADAMTS13与VWF A2结构域的相互作用,阐明其动力学调控的分子机制。方法利用原子力显微镜测量在不同外力作用下WT和GOF ADAMTS13分子与VWF A2... 详细信息

目的探究瞬时接触时间下野生型(wild⁃type,WT)和功能增强型(gain⁃of⁃function,GOF)金属蛋白酶ADAMTS13与VWF A2结构域的相互作用,阐明其动力学调控的分子机制。方法利用原子力显微镜测量在不同外力作用下WT和GOF ADAMTS13分子与VWF A2的黏附频率、断裂力和分子键寿命,并利用Bell⁃Evans模型提取相关动力学参数。结果WT ADAMTS13与VWF A2结合的能障宽度为0.41 nm,0 N力下的解离速率为1.50 s^(-1);GOF ADAMTS13与VWF A2结合的能障宽度为0.29 nm,0 N力下的解离速率为3.28 s^(-1)。进一步利用AFM clamp模式测量在不同作用力下WT/GOF ADAMTS13⁃VWF A2复合物的分子键生存寿命和解离速率,发现两组复合物的结合均呈现“逆锁键”⁃“滑移键”转换的双相力学依赖特性。结论WT ADAMTS13⁃VWF A2相互作用的机械强度与力学稳定性高于GOF ADAMTS13⁃VWF A2,WT/GOF ADAMTS13与VWF A2结构域的相互作用具有“逆锁键”⁃“滑移键”转换的双相力学响应特性。研究结果有助于深入理解ADAMTS13与VWF的相互作用,为抗血栓药物的开发提供新思路。

关键词：血管性血友病因子原子力显微镜逆锁键滑移键

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利用光镊技术研究力作用下P-selectin/PSGL-1键的解离

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生物医学工程学杂志 2004年第z1期21卷 83-84页

作者：章燕霍波龙勉中国科学院力学研究所北京100080

采用光镊技术研究力作用下P-selectin/PSGL-1键的解离,得到了在较小的加载率(＜25 pN/s)下键解离的断裂力分布,发现键的最可几断裂力随加载率增加而增加;测量了较低的力范围(＜30 pN)内P-selectin/PSGL-1键解离的寿命,发现键的寿命随作... 详细信息

采用光镊技术研究力作用下P-selectin/PSGL-1键的解离,得到了在较小的加载率(＜25 pN/s)下键解离的断裂力分布,发现键的最可几断裂力随加载率增加而增加;测量了较低的力范围(＜30 pN)内P-selectin/PSGL-1键解离的寿命,发现键的寿命随作用力增加而下降,呈现一个从"滑移键"到"逆锁键"的过渡相.研究结论深化了力作用下受体/配体键的认识.

关键词： P-selectin/PSGL-1键逆锁键光镊断裂力寿命

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T细胞力学免疫学研究进展

医用生物力学 2024年第5期39卷 796-805页

作者：吴松芳娄继忠中国科学院生物物理研究所表观遗传调控与干预重点实验室北京100101

T细胞是获得性免疫的核心之一,T细胞受体(T cell receptor,TCR)对抗原的特异性识别是启动抗肿瘤、抗病毒免疫应答的关键过程。近年来的研究表明力在T细胞免疫反应中起着重要的调控作用,为力学免疫学这一新兴领域奠定了基础。本文重点讨... 详细信息

T细胞是获得性免疫的核心之一,T细胞受体(T cell receptor,TCR)对抗原的特异性识别是启动抗肿瘤、抗病毒免疫应答的关键过程。近年来的研究表明力在T细胞免疫反应中起着重要的调控作用,为力学免疫学这一新兴领域奠定了基础。本文重点讨论力协助TCR区分特异性抗原和自身非特异性抗原的机制,以及力在启动TCR跨细胞膜信号传导及触发T细胞激活过程中发挥的关键作用。总结了力学免疫学研究中新的生物物理单分子工具和先进的成像技术,这些工具的能够在分子和细胞尺度上深入揭示力作用的重要性。本文基于国内外专家团队的研究成果,并结合本团队研究工作,对力在T细胞功能中的作用进行总结探讨,为深入理解力学免疫学领域的前沿热点和探索新的研究方向提供系统框架。

关键词： T细胞受体逆锁键力学传导单分子力谱肿瘤免疫治疗力学免疫学

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整合素αvβ6与纤连蛋白相互作用的力调控机制

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中国组织工程研究 2019年第34期23卷 5462-5467页

作者：杨碧珊李娜李趣欢华南理工大学生命科学与工程学院

背景:整合素αvβ6在多种肿瘤细胞上高表达,能促进肿瘤细胞的异常增殖和恶性转移。整合素αvβ6通过与配体纤连蛋白的相互作用介导了肿瘤细胞的黏附与迁移,该过程不仅受到整合素αvβ6与纤维蛋白相互作用强弱的影响,也受到血流环境下剪... 详细信息

背景:整合素αvβ6在多种肿瘤细胞上高表达,能促进肿瘤细胞的异常增殖和恶性转移。整合素αvβ6通过与配体纤连蛋白的相互作用介导了肿瘤细胞的黏附与迁移,该过程不仅受到整合素αvβ6与纤维蛋白相互作用强弱的影响,也受到血流环境下剪应力的调节。因此,揭示整合素αvβ6和纤连蛋白相互作用的力-化学调控机制具有重要的理论意义和应用价值。目的:通过定量化力条件下整合素αvβ6与纤连蛋白的相互作用,揭示蕴含在黏附现象背后的力调控机制。方法:在不同剪切力下,驱使包被纤连蛋白RGD片段的微球在铺有整合素αvβ6的底板上黏附,观察和记录该黏附现象,获取黏附微球的瞬时速度和累积距离随时间变化的曲线,提取生存时间和解离速率参数。结果与结论:整合素αvβ6与纤连蛋白片段相互作用存在流动增强型现象,随着流体剪切力的增加,两者相互作用的键生存时间出现先增加后减少趋势。相反,随流体剪切力的增加,键解离速率出现先减小后增加趋势。该力依赖的生存时间和逆反应速率的双态性表明,整合素αvβ6与纤连蛋白片段介导的流动增强型现象是由逆锁键所调控的。

关键词：整合素αvβ6 纤连蛋白平行平板流动腔流体剪切力生存时间解离速率逆锁键黏附

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P-选择素与PSGL-1在血流剪应力下相互作用的分子结构基础

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P-选择素与PSGL-1在血流剪应力下相互作用的分子结构基础

作者：叶琳璐华南理工大学

学位级别：硕士

炎症反应是一个重要的生理过程也是人体抵御细菌入侵的第一道防线。在炎症反应时,随着整合素、选择素和趋化因子受体的相互作用,白细胞在募集到受损部位。而白细胞上的PSGl-1与内皮细胞上P-选择素(P-selectin)结合主导早期的炎症反应过... 详细信息

炎症反应是一个重要的生理过程也是人体抵御细菌入侵的第一道防线。在炎症反应时,随着整合素、选择素和趋化因子受体的相互作用,白细胞在募集到受损部位。而白细胞上的PSGl-1与内皮细胞上P-选择素(P-selectin)结合主导早期的炎症反应过程。研究力(剪切力)调控下的P-选择素与PSGL-1复合物的解离机制对于进一步了解炎症反应、血栓形成过程有十分重要的意义,同时也为下一步靶向药物的制药有着一定的指导作用。已有大量的研究证明P-选择素与PSGL-1复合物在血流剪应力的作用下发生由滑移-逆锁-滑移键调节的解离过程。但是对于P-选择素与PSGL-1完整的逆锁键机制仍然缺少解释。在论文中,结合现有的理论基础,针对该复合物应用了分子动力学模拟(Molecular dynamics simulation)进行原子水平的研究:利用分子动力学模拟对复合物进行平衡动力学模拟、5?/s的10ns恒速度拉伸动力学模拟以及基于恒速度拉伸动力学模拟的力谱图提取构象,并将该构象作为进行恒力拉伸动力学模拟的初始构象。对于27个不同的初始构象进行9个不同拉力下的50ns恒力拉伸动力学模拟实验。在对27组恒力拉伸模型轨迹研究中发现复合物存在三种不同的解离轨迹,分别是Binding、Stablebinding和Directlypulloff。并对于其中的Binding解离轨迹进行了深入的研究。通过数据整合,发现在Binding轨迹中可细分为三种解离轨迹,分别是Binding(notbreak)、Binding(strength)和Binding(break)。通过VMD观察发现在Binding(notbreak)和Binding(break)均有明显的构象轨迹变化,而在对于Binding(strength)轨迹的研究中并没有观察到明显的构象轨迹变化。综合三种Binding轨迹分析,本论文提供了对于逆锁键机制的完整解释,认为在力的作用下,PSGL-1上的硫酸化酪氨酸(sulfation tyrosine)和糖基(glycosylation)协同作用,延长P-选择素与PSGL-1复合物的生存时间。复合物结合面发生旋转,糖基与P-选择素switch3的结合被解离,但此时Tys10与P-选择素稳定结合,若处于PSGL-1柔软的Loop结构末端的Tys5与P-选择素间形成新的氢键,并且通过数据分析证实Tys5相比于Tys7和Tys10更易于产生新的氢键。此时,硫酸化酪氨酸与P-选择素间新的氢键为PSGL-1上糖基的空间旋转、形成新的结合位点提供了契机。当糖基与P-选择素间重新稳定结合时,复合物的生存时间会进一步的延长。此外,当糖基没有被拉离时,其有可能会发生短位移的旋转,从而与P-选择素的switch3结构产生新的氢键,最终提高了糖基与P-选择素间的氢键相互作用力。

关键词： P-选择素 PSGL-1 逆锁键分子动力学模拟糖基硫酸化酪氨酸

整合素α4β7-MAdCAM-1相互作用的力依赖机制

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整合素α4β7-MAdCAM-1相互作用的力依赖机制

作者：粟尤敏华南理工大学

学位级别：硕士

在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)中,由于免疫反应过度亢进,大量的淋巴细胞穿过肠粘膜涌入炎症部位,导致肠粘膜损伤。这一过程包含了整合素αβ与粘膜血管地址素细胞黏附分子-1(Mucosal adressin cell adhesion molecule-1... 详细信息

在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)中,由于免疫反应过度亢进,大量的淋巴细胞穿过肠粘膜涌入炎症部位,导致肠粘膜损伤。这一过程包含了整合素αβ与粘膜血管地址素细胞黏附分子-1(Mucosal adressin cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1)的相互作用介导的循环淋巴细胞黏附在高内皮静脉表面。淋巴细胞的黏附是一个多步级联过程,包括初始黏附、滚动黏附、稳定黏附和爬行,整合素αβ既参与稳定黏附,又涉及滚动黏附过程。在IBD中无论靶向整合素αβ或其配体MAdCAM-1都可以减少炎症的程度,从而达到治疗的效果。此外,整合素αβ及其配体之间的相互作用发生在血液环境中,因此该过程除了受内在化学因素的影响外,并受血流剪切应力环境影响。究竟血流环境如何调控整合素αβ-MAdCAM-1的相互作用?因此,本研究试图通过动力学测量来探索整合素αβ和MAdCAM-1之间相互作用的力依赖机制。本研究采用平行平板流动腔技术,模拟人体生理环境,驱动表达有整合素αβ的RPMI 8226细胞在不同剪切力条件下,在MAdCAM-1铺展的底板上黏附。利用不同二价金属离子Ca、Ca+Mg、Mg或Mn激活整合素αβ到不同的活性状态,研究RPMI 8226细胞黏附行为的变化。测量整合素αβ-MAdCAM-1相互作用的生存时间以及细胞的滚动速度。结果表明,在Ca或/和Mg离子溶液环境中,细胞的平均滚动速度随力的增大先减小后增大,存在流动增强黏附现象,而瞬时黏附的生存时间和滚动黏附的平均停留时间先增加而后降低,成负相关关系。该结果表明整合素αβ-MAdCAM-1相互作用存在力依赖的流动增强行黏附现象,并受逆锁键机制所调节。金属离子Mg和Mn激活整合素到中或高亲和力水平,使细胞趋向稳定黏附。进一步,利用原子力显微镜技术,研究整合素αβ和MAdCAM-1分子之间的相互作用。在不同二价金属离子溶液条件下,整合素αβ处于不同活性状态,测量分子对之间的黏附频率和生存时间。结果表明,整合素αβ与MAdCAM-1相互作用的生存时间随力的增加先增加后减少,是有逆锁键-滑移键的转换调节的双态曲线。此外,该过程也受离子调节,Ca离子条件下整合素αβ可能被激活但是亲和力比较低,在Mg离子和Mn离子条件下整合素αβ被激活到中等亲和力和高等亲和力状态。因此,整合素αβ与MAdCAM-1相互作用是力和金属离子依赖的黏附过程。综上,本研究探讨了整合素αβ与MAdCAM-1相互作用的流动增强型黏附,并存在逆锁键机制。整合素αβ-MAdCAM-1相互作用是引起炎症性肠病的关键免疫分子,因而本研究深化了淋巴细胞归巢,炎症性肠病等生理病理过程的理解,为免疫反应的干预和新抗炎治疗的发展提供了新视角。

关键词：整合素α4β7 MAdCAM-1 平行平板流动腔原子力显微镜流动增强型黏附逆锁键

血管性血友病因子与血小板相互作用的力—化学耦合研究

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血管性血友病因子与血小板相互作用的力—化学耦合研究

作者：雷咸斌华中科技大学

学位级别：硕士

血管性血友病作为一种非常常见的可遗传凝血异常疾病,主要是由于血管性血友病因子和血小板的病变所引起的。因此,研究血小板和血管性血友病因子之间的相互作用以及外力对相互作用的影响能帮助我们增加对血管性血友病的认识并改善治疗方... 详细信息

血管性血友病作为一种非常常见的可遗传凝血异常疾病,主要是由于血管性血友病因子和血小板的病变所引起的。因此,研究血小板和血管性血友病因子之间的相互作用以及外力对相互作用的影响能帮助我们增加对血管性血友病的认识并改善治疗方法。本文主要研究对象为血管性血友病因子的A1功能域和其配体血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)之间的相互作用,这两个分子是人体实现正常止血功能所不可或缺的。我们通过对合作方的单分子光镊实验数据进行分析来研究A1及其配体GPIbα之间的相互作用受外力的影响。实验过程中这对分子被施以不同形式的外力,而其在不同情况下的状态参数则被测量和记录下来。根据对分子施加的力的不同形式,实验主要可以分为恒定力实验(外力保持不变)和恒定速率实验(力随时间周期性变化)。我们采用Dudko-Hummer-Szabo方程和Serpe等人提出的断裂力-存活时间分布法对实验数据进行分析和研究,计算出该对分子形成的结合键在外力作用下的“寿命”,或者说能够持续存在的时间。我们发现,两种方法给出的结果非常一致,并且都显示这对分子形成的结合键在一定范围的外力作用下,会出现所谓逆锁键(catch bond)的现象。这个结果和Zhu C.等人之前的研究是一致的。我们还使用Harder等人基于双状态双路径模型发展出的理论公式对数据进行了拟合,并且也对Kim等人提出的flex-bond中所谓两条路径的转换过程给出了一种解释。

关键词：血管性血友病因子血管性血友病血小板糖蛋白单分子恒定力实验恒定速率实验逆锁键滑移键

力学信号调控的蛋白质功能动力学分子模拟研究

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力学信号调控的蛋白质功能动力学分子模拟研究

作者：李嘉晨南京大学

学位级别：硕士

细胞粘附是重要的细胞分子生物过程,在细菌生长繁殖、多细胞生命体的组织结构维持以及免疫反应等过程中起了关键作用。细胞粘附过程通常由细胞表面的受体蛋白与近邻细胞表面的配体小分子/蛋白质分子或细胞间质的非共价结合来实现。与通... 详细信息

细胞粘附是重要的细胞分子生物过程,在细菌生长繁殖、多细胞生命体的组织结构维持以及免疫反应等过程中起了关键作用。细胞粘附过程通常由细胞表面的受体蛋白与近邻细胞表面的配体小分子/蛋白质分子或细胞间质的非共价结合来实现。与通常的物理化学粘附不同,细胞粘附需要满足更为复杂的生物学要求,并受到多种因素的动态调控。特别是细胞粘附过程普遍依赖于拉力导致的粘附结合增强现象,即所谓的逆锁键(catch-bond)效应。这种力学信号调控下细胞粘附的重要生物学与医学意义促使人们开始思考细胞粘附过程对力学信号响应的物理基础以及逆锁键效应产生的微观分子机制,吸引了来自物理学、化学、以及生物学领域研究人员的广泛兴趣。目前,关于力学信号调控细胞粘附的研究主要采用实验手段,而相关的计算机模拟研究仍非常有限。本论文采用粗粒化分子模拟的方法研究力学信号调控下,白细胞表面受体蛋白CD44与配体分子结合微观物理机制。另外,单链DNA在相应结合蛋白上的折叠组装对转录、复制以及DNA修复至关重要,但相关分子机制仍不清楚。本论文也将探讨单链DNA在结合蛋白上的折叠组装过程,及其受机械外力的调控。具体内容如下:一、力信号调控的细胞粘附蛋白CD44逆锁键效应产生机制研究。免疫反应要求白细胞在感染位置富集。而白细胞在血管内壁的滚动是实现由血液向感染位置富集的关键步骤,并依赖于CD44介导的细胞粘附。人们发现,这种白细胞的滚动运动依赖于(血流等)流体环境下产生的拉力。在静态环境下,白细胞主要以自由运动为主,限制了其与血管壁的滚动粘附。而在一定的流速下,白细胞倾向于与血管壁粘附并发生滚动运动。人们猜测这种流体拉力导致的滚动运动可能与CD44介导的逆锁键效应有关,但相关的微观物理机制尚不清楚。本论文基于蛋白质能量面理论和多势阱模型,建立了一个描述机械力调控下蛋白质分子别构运动以及配体结合的粗粒化模型,并使用分子动力学模拟的方法研究了机械力作用下CD44的构象运动及其与配体分子的结合和解离过程。模拟结果发现,随着机械外力的增加,CD44的C端螺旋发生解折叠,并与CD44的核心结构域分离,进而导致CD44核心结构域的构象变化和配体分子亲核性的增强,表现出逆锁键效应。当机械外力继续增加时,配体分子亲和性降低。因此,本论文的分子模拟结果支持CD44受体蛋白逆锁键产生的别构机制,从而能够解释实验观测到的白细胞在流体环境下倾向于在血管内壁滚动的现象。相关结果对理解细胞免疫反应机制具有重要的参考意义。二、单链DNA在结合蛋白的折叠组装动力学及其力学调控研究。在转录、复制以及DNA修复过程产生的单链DNA(ssDNA)需要与其他蛋白(结合蛋白)结合才能维持稳定性,避免被水解破坏。人们发现,ssDNA与结合蛋白存在多种结合模型,并受到机械拉力、盐浓度等外部因素的调控,但相关的分子机制仍不清楚。本论文尝试建立了一个描述ssDNA与结合蛋白相互作用的粗粒化模型,并基于分子动力学模拟的方法研究了ssDNA在大肠杆菌单链DNA结合蛋白(SSB)以及复制蛋白A(PRA)上的折叠组装及其力学调控。分子模拟能够成功实现ssDNA的折叠组装,模拟所得到的复合体结构能够与实验结果很好的符合。另外,通过对自由能面的刻画,发现随着拉力的增加,ssDNA-SSB复合体在多种结合模式之间发生转变,在一定程度上解释了已有实验数据。本论文内容安排如下:第一章对力学信号调控的细胞粘附现象、ssDNA的结合组装动力学、分子模拟方法等作了综述;第二章给出了CD44与配体相互作用的粗粒化模型以及逆锁键效应产生机制的分子模拟结果;第三章给出了ssDNA与结合蛋白的相互作用粗粒化模型并讨论了ssDNA折叠与组装过程及其力学调控;第四章是论文总结和对相关研究的展望。

关键词：分子模拟自由能面别构逆锁键构象变化粗粒化模型单链DNA结合蛋白受体蛋白透明质酸单链DNA

vWF-A1A2A3介导的循环血小板的翻滚运动

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vWF-A1A2A3介导的循环血小板的翻滚运动

作者：杨小芳华南理工大学

学位级别：硕士

血管受损后，血管内皮下胶原暴露，血液中的假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)会迅速地结合到胶原分子上。结合了的vWF受到血流高剪应力的作用发生构象改变暴露血小板结合位点，从而捕获血液中循环的血小板，使血小板粘附到受... 详细信息

血管受损后，血管内皮下胶原暴露，血液中的假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)会迅速地结合到胶原分子上。结合了的vWF受到血流高剪应力的作用发生构象改变暴露血小板结合位点，从而捕获血液中循环的血小板，使血小板粘附到受损位点。血小板初步粘附是依赖于血小板表面糖蛋白GPIbα与vWF的A1结构域的相互作用。二者相互作用发生异常会导致机体凝血功能紊乱，引起出血性或者血栓性血管疾病。为深化理解血管性疾病的发病机理，本文以起始止血第一步的vWF分子的重要功能结构域A1A2A3三联体与血小板为研究对象，平行平板流动腔为研究手段，研究流体剪应力如何调控血小板膜分子GPIbα与vWF上的重要功能结构域A1A2A3之间的相互作用，从而推进关于正常生理条件下体内血流剪应力如何经由GPIbα/vWF介导来调控血小板的翻滚黏附、从而使血小板发挥止血功能的认识，并可能有助于对各种功能异常的vWF所导致的血小板凝血功能失常的疾病进一步研究。首先，我们采用脂质体转染方法，将实验室保存的vWF-A1A2A3质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1中进行vWF-A1A2A3的表达，稳定转染后扩大CHO-K1培养，收集CHO-K1培养液Opti-MEM I上清，通过浓缩、透析和亲和层析，纯化出vWF-A1A2A3蛋白。然后，采用流动腔实验技术，将提取纯化的健康志愿者血小板悬浮液在不同的流体剪应力(10dyn/cm2)环境下灌注到底板铺有200μg/ml vWF-A1A2A3流动腔中，使血小板的表面糖蛋白GPIbα与vWF-A1A2A3发生相互作用。记录血小板在流动腔中的行为，我们提取翻滚速度，翻滚速度分布，翻滚时间，翻滚时间分布，停留时间，停留频率，停留时间比率等动力学参数。我们发现血小板在vWF-A1A2A3的底板上翻滚的速度、翻滚时间、停留时间、停留频率和停留时间比率等参数均呈现非单调的双相力依赖的特性。血小板GPIbα-vWFA1A2A3相互作用经历了一个转化过程，随着流体剪应力的增大，翻滚速度、翻滚时间和停留频率均随之先减小后增大;而停留时间和停留时间比率趋势则刚好相反，其阈值也在8dyn/cm2左右，与翻滚速度和翻滚时间一致。其中剪应力对翻滚时间的影响不显著。实验结果揭示出血小板GPIbα-vWF-A1A2A3相互作用存在着流动增强型现象。当剪应力阈值水平之下，剪应力的增加可降低细胞滚动速度并增加滚动的稳定性。流体剪应力主要通过调节血小板在vWF-A1A2A3上的停留时间而非翻滚时间来影响其翻滚速度的，提示相应的力学调节机制与GPIbα/A1A2A3相互作用的粘附键从逆锁键向滑移键的转化过程相关。

关键词：血小板假性血友病因子流动腔流动增强型现象逆锁键