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动物双歧杆菌乳亚种V9连续传代过程中遗传稳定性评价

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中国食品学报 2023年第9期23卷 12-22页

作者：刘凯龙黄天刘晓晔玉霞姚国强内蒙古农业大学、乳品生物技术与工程教育部重点实验室、农业农村部奶制品加工重点实验室、内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室呼和浩特010018

目的:以具有优良益生特性的动物双歧杆菌乳亚种V9为研究对象,对其连续传代过程中的遗传稳定性进行研究。方法:动物双歧杆菌乳亚种V9在TPY培养基中连续培养100代,对其0,25,50,75,100代的菌体形态、碳水化合物利用情况以及结合比较基因组... 详细信息

目的:以具有优良益生特性的动物双歧杆菌乳亚种V9为研究对象,对其连续传代过程中的遗传稳定性进行研究。方法:动物双歧杆菌乳亚种V9在TPY培养基中连续培养100代,对其0,25,50,75,100代的菌体形态、碳水化合物利用情况以及结合比较基因组学进行综合分析。结果:动物双歧杆菌乳亚种V9在连续传代过程中不同代时的菌体形态、碳水化合物利用情况均无显著差异(P>0.05),并以动物双歧杆菌乳亚种V9原始基因组作为参考序列,研究发现不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9的基因组大小和GC含量与原始基因组均无显著差异(P>0.05),系统发育树结果表明不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9与原始基因组亲缘关系较近,通过识别SNP突变位点发现不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9基因组保守,均未发现稳定遗传的突变位点,进一步进行碳水化合物代谢活性酶注释,结果发现不同代时菌株具有相似的碳水化合物代谢相关基因,遗传特征高度相似。结论:本研究从表型特性和基因组层面综合评估了动物双歧杆菌乳亚种V9的遗传稳定性,可为其进一步开发研究及产业化提供保障。

关键词：动物双歧杆菌乳亚种V9 连续传代遗传稳定性

鼠李糖乳杆菌Probio-M9连续传代过程中的遗传稳定性

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中国食品学报 2023年第11期23卷 24-35页

作者：黄天刘凯龙刘晓晔姚国强孙天松内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室呼和浩特010018

目的:探究鼠李糖乳杆菌Probio-M9在连续传代过程中的遗传稳定性。方法:以鼠李糖乳杆菌Probio-M9为研究对象,对其传代过程中第0,25,50,75,100代的菌株形态变化、碳水化合物利用能力以及菌株代谢特性进行比较,同时应用比较基因组学分析其... 详细信息

目的:探究鼠李糖乳杆菌Probio-M9在连续传代过程中的遗传稳定性。方法:以鼠李糖乳杆菌Probio-M9为研究对象,对其传代过程中第0,25,50,75,100代的菌株形态变化、碳水化合物利用能力以及菌株代谢特性进行比较,同时应用比较基因组学分析其在连续培养100代过程中基因组水平的变化。结果:鼠李糖乳杆菌Probio-M9在连续培养100代过程中,其菌体形态、碳水化合物利用能力等表型特征及代谢特性均无显著性(P>0.05)变化,表型特征稳定。同时以鼠李糖乳杆菌Probio-M9原始菌株基因组作为参考序列,对不同代时15株菌进行测序,基因组大小及GC含量表明15株连续培养的菌株与鼠李糖乳杆菌Probio-M9原始菌株基因组均无明显差异。系统发育关系表明15株菌与原始基因组具有较近的亲缘性。从识别到的SNP位点来看,每两个代时菌株间均未发现稳定遗传的突变位点,且菌株共线性良好,从基因组水平编码基因的突变水平证实了鼠李糖乳杆菌Probio-M9在连续培养100代过程中具有稳定表型特征及代谢特性。结论:鼠李糖乳杆菌Probio-M9在连续传代过程中具有良好的遗传稳定性,为其进一步开发研究以及产业化提供了理论基础。

关键词：鼠李糖乳杆菌Probio-M9 连续传代表型代谢比较基因组学遗传稳定性

4株志贺菌无抗生素压力下连续传代90次的耐药表型及CRISPR／Cas系统变化

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中华流行病学杂志 2017年第2期38卷 235-239页

作者：张冰洪丽娟段广才梁文娟杨海燕郗园林郑州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室 450001 新乡医学院分子诊断与医学检验技术河南省协同创新中心 453003

目的分析无抗生素压力下连续传代90次的4株志贺菌耐药表型及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）基因变化。方法对临床分离的4株耐药谱不同的志贺菌进行无抗生素压力连续传代90次，传代结束后用琼脂稀释法检... 详细信息

目的分析无抗生素压力下连续传代90次的4株志贺菌耐药表型及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）基因变化。方法对临床分离的4株耐药谱不同的志贺菌进行无抗生素压力连续传代90次，传代结束后用琼脂稀释法检测传代前、后志贺菌最小抑菌浓度；用PCR对CRISPR位点进行扩增并测序，CRISPR Finder和Clustal X 2.1分析CRISPR位点的变化。结果经无抗生素压力传代90次后，4株志贺菌对某些抗生素的敏感性有不同程度的增加：mel-sf1998024/zz对氨苄西林、头孢氨苄、头孢噻肟、氯霉素的耐药性降低，mel-s2014026/sx对诺氟沙星、甲氧苄啶的耐药性降低，mel-sf2004004/sx对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟、氯霉素、甲氧苄啶的耐药性降低，mel-sf2013004/bj对氯霉素的耐药性降低；志贺菌mel-sf1998024/zz和mel-sf2013004/bj经无抗生素压力传代后，CRISPR3位点3＇的重复-间隔序列丢失，其中间隔序列匹配基因的编码产物是Cas蛋白。结论志贺菌在无抗生素压力下，可降低或丢失对某些抗生素的耐药性。部分志贺菌CRISPR3位点的结构发生了变化，CRISPR3位点与cas基因可能存在共进化。

关键词：志贺菌属抗药性无抗生素压力连续传代 CRISPR/Cas系统

连续传代时感染斜纹夜蛾核多角体病毒不同分离株的毒力变化

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江苏农业学报 2007年第1期23卷 71-73页

作者：郭慧芳方继朝王节萍刘宝生钟万芳江苏省农业科学院植物保护研究所江苏南京210014

自然界中的核多角体病毒（NPV）和颗粒体病毒（GV）普遍存在多种分离株，同种病毒不同分离株往往在致病性和作用速度上存在差异。如从美国、亚洲、大洋洲、欧洲和非洲等地实夜蛾属（Heliothis spp）害虫中分离出来的NPV作用速度不同；... 详细信息

自然界中的核多角体病毒（NPV）和颗粒体病毒（GV）普遍存在多种分离株，同种病毒不同分离株往往在致病性和作用速度上存在差异。如从美国、亚洲、大洋洲、欧洲和非洲等地实夜蛾属（Heliothis spp）害虫中分离出来的NPV作用速度不同；北美、欧洲和亚洲的舞毒蛾NPV杀虫活性相差达3000倍；从西班牙、泰国和美国甜菜夜蛾中分离出来的NPV致病力也存在差异，但差异较小。虽然关于不同分离株致病力比较方面的研究较多，但这种比较往往只是关注一代病毒对宿主的致病力差异，未涉及不同分离株病毒在同种活体宿主中连续传代时致病力差异的变化，并且也未研究不同分离株的毒力与所用的宿主地理种群之间的关系。而上述这些方面的研究可为充分发掘利用昆虫病毒不同分离株多态性提供重要依据。[第一段]

关键词：感染斜纹夜蛾核多角体病毒分离株连续传代毒力

基于高通量测序的连续传代富集土壤可培养菌菌群变化规律研究

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生态与农村环境学报 2023年第1期39卷 123-135页

作者：文昌丽曹伟伟唐雪莲赵雯淑贾仲君孟磊海南大学热带作物学院海南海口570228 中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室江苏南京210008 中国科学院大学北京100049

利用高通量测序技术研究连续传代富集过程中,固体和液体牛肉膏蛋白胨可培养土壤细菌多样性的变化规律,量化可培养菌占水稻土本底微生物群落的比例。通过设置常规营养和1/10低营养处理,包括常规牛肉膏蛋白胨固体培养(NA)、液体培养(NB),... 详细信息

利用高通量测序技术研究连续传代富集过程中,固体和液体牛肉膏蛋白胨可培养土壤细菌多样性的变化规律,量化可培养菌占水稻土本底微生物群落的比例。通过设置常规营养和1/10低营养处理,包括常规牛肉膏蛋白胨固体培养(NA)、液体培养(NB),低营养固体培养(1/10 NA)和低营养液体培养(1/10 NB),开展连续传代富集10次,获得第1、3、5、7、10代细菌培养物并提取DNA,同时直接提取水稻土中所有微生物基因组DNA并对16S rRNA基因进行高通量测序,分析水稻土可培养菌群落变化规律及其占本底土著微生物的比例。结果表明,水稻土本底微生物多样性Chao指数为4806,在连续传代培养10次过程中,降幅最高为98.9%,其中,固体和液体可培养微生物Chao指数以第1代为最低,分别为49.7和142.0,低营养1/10固体和液体培养下,Chao指数分别为75.1和531.0。高通量测序16S rRNA基因后发现水稻土本底土著微生物共713属,连续10次传代富集培养过程中,固体和液体常规培养基中分别检测到52属和600属,低营养1/10固体和液体培养下,分别为62属和597属,可培养菌占比最高分别为8.7%和83.7%。连续第1、3、5、7和10次传代培养过程中,固体培养基每代独有微生物属分别为7、2、3、4和3属,液体培养基独有属则分别为5、1、102、44和24属,低营养1/10培养也得到了类似结果。假单胞菌属(Pseudomonas)是水稻土连续10次传代过程中绝对的优势类群,特别在固体培养基中相对丰度变幅范围为97.70%~99.47%,与水稻土本底土壤中相对丰度相比,增幅最高为74倍。低营养1/10固体条件下,随着传代次数的增加,杆菌属(Bacillus)和代尔夫特菌属(Delftia)成为优势类群,在第10代的相对丰度最高分别为18.07%和13.82%。液体连续传代10次过程中,假单胞菌属也是绝对优势类群,但与固体可培养菌相比略下降为45.48%~55.99%,梭菌属(Clostridium)则是第2大优势类群,其相对丰度范围为23.58%~42.40%,而赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)则保持相对稳定的增长趋势,其相对丰度范围为1.46%~6.74%。相反,低营养1/10液体培养下,梭菌属和赖氨酸芽孢杆菌属随着培养代数增加而急剧降低,假单胞菌属则成为绝对优势菌,而类芽孢杆菌属(Paenibacillus)则呈现随着传代次数增加而增加的趋势。上述结果表明,水稻土本底微生物多样性最多达可培养菌的96.7倍,连续传代富集培养过程中,水稻土可培养微生物Chao指数先增加后降低,固体和液体培养分别获得74和662属,可培养菌占水稻土所有微生物比例分别为10.4%和92.8%。在固体和液体传代培养过程中,假单胞菌属均占据绝对优势地位,液体可培养微生物多样性明显高于固体。低营养1/10固体和液体培养条件下,可培养微生物类群显著增加,第1代出现的部分微生物类群逐渐被某些优势菌替代,表明连续传代富集培养过程中,在不同代际均富集了生理代谢特征具有明显差异的类群,连续传代富集并不会导致种群结构同质化和单一化。

关键词：微生物可培养法连续传代固液体培养基氮素营养高通量测序

外周血单个核细胞中肺炎衣原体的分离、培养及连续传代

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微生物学通报 2010年第11期37卷 1650-1655页

作者：金前孙书明王卫群周颖余竹元浙江省立同德医院呼吸科浙江杭州310012 复旦大学附属金山医院呼吸科上海200540 复旦大学附属金山医院心内科上海200540 复旦大学附属中山医院免疫室上海200032

开发一种分离并增殖肺炎衣原体(Cpn)的简易方法极具意义。该方法先分离血液标本中的外周血单个核细胞(PBMC),用PEG使Cpn-Ag阳性的PBMC裂解释放出Cpn,然后与人喉表皮癌细胞(Hep-2)一起离心,继续培养Hep-2细胞,再将Hep-2细胞冻融破碎后,... 详细信息

开发一种分离并增殖肺炎衣原体(Cpn)的简易方法极具意义。该方法先分离血液标本中的外周血单个核细胞(PBMC),用PEG使Cpn-Ag阳性的PBMC裂解释放出Cpn,然后与人喉表皮癌细胞(Hep-2)一起离心,继续培养Hep-2细胞,再将Hep-2细胞冻融破碎后,放入到新的Hep-2细胞中进行离心,以完成Cpn的1次传代,然后以同样的方法进行2-4次传代。分别用微量免疫荧光法(MIF)及PCR法检测Hep-2细胞中的Cpn-Ag和CpnDNA,并用FITC标记的属特异性衣原体脂多糖单克隆抗体检测实验分离以及进口菌株传代后的包涵体形成单位数量。结果显示MIF法检测Cpn感染后的Hep-2细胞,其胞内Cpn-Ag强阳性;MIF法检测1次传代及2次传代的Hep-2细胞,其胞内Cpn-Ag亦均强阳性,3次传代为阳性,而4次传代为阴性;PCR法检测2次传代后CpnDNA阳性。该简化方法可以实现PBMC中Cpn的分离,分离菌株传代4次后出现退化(优于进口菌株),但该方法仍可实现进一步的培养及传代。

关键词：肺炎衣原体单个核细胞连续传代

粉纹夜蛾单粒包埋核型多角体病毒在同源细胞系中连续传代的研究(英文)

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Insect Science 2000年第2期7卷 147-154页

作者：李国勋,李天龙,RobertR.Granados 河北农业大学!保定071001 中国河北农业大学!保定071001 中国 BoyceThompsonInstitute!Ithaca NY14853 USA

本文研究了粉纹夜蛾单粒包埋核型多角体病毒 (TnSNPV)在同源细胞连续传代及测定病毒特性的变化。结果表明 ,TnSNPV病毒的分子量为 115.8kbp。感染细胞 8小时后病毒开始复制 ,4 0h达到最大量。在整个传代期间 ,芽生病毒 (BV)对Tn 5B1 4... 详细信息

本文研究了粉纹夜蛾单粒包埋核型多角体病毒 (TnSNPV)在同源细胞连续传代及测定病毒特性的变化。结果表明 ,TnSNPV病毒的分子量为 115.8kbp。感染细胞 8小时后病毒开始复制 ,4 0h达到最大量。在整个传代期间 ,芽生病毒 (BV)对Tn 5B1 4细胞一直有很强的侵染力 ,大约可保持在 5.0logT CID50 /mL的侵染力。但随着传递代数的增加 ,多角体产量及对幼虫的侵染力明显下降 ;电镜观察结果发现 ,来自传代早期 (10代前 )的病毒克隆产生正常的多角体 ,内含大量的病毒粒子 ,而来自传代后期(15代以后 )的病毒克隆多为无粒子的多角体 ;内切酶分析和DNA杂交结果表明 ,分离的病毒克隆株与野生型病毒的基因组同源 ,通过连续传代后 ,发生某些DNA片段的缺失。因此 ,这些特性的改变是导致对幼虫毒力下降和产量降低的主要因素。

关键词：粉纹夜蛾核型多角体病毒连续传代 DNA杂交病毒的复制

植物乳植杆菌P-8连续传代过程中遗传稳定性分析

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微生物学通报 2023年第9期50卷 4154-4167页

作者：王可欣刘晓晔李伟程刘凯龙黄天孙志宏张和平内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室内蒙古呼和浩特010018 农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古呼和浩特010018 内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室内蒙古呼和浩特010018

【背景】植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)P-8是一株具有优良益生特性的乳酸菌,探究其短期连续传代过程中的遗传稳定性对评估其加工生产的稳定性有着重要的指导作用。【目的】研究植物乳植杆菌P-8在37℃恒温环境下、MRS培... 详细信息

【背景】植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)P-8是一株具有优良益生特性的乳酸菌,探究其短期连续传代过程中的遗传稳定性对评估其加工生产的稳定性有着重要的指导作用。【目的】研究植物乳植杆菌P-8在37℃恒温环境下、MRS培养基中连续传代100代过程中的遗传稳定性。【方法】在MRS培养基、37℃恒温环境下将植物乳植杆菌P-8连续传代100代,测定不同代菌株(第0、25、50、75和100代)的菌体形态和碳水化合物利用能力,并利用二代、三代测序相结合的技术完成不同代菌株全基因组测序,通过比较基因组学综合分析其在连续传代100代过程中的遗传稳定性。【结果】植物乳植杆菌P-8在连续培养100代过程中,其菌体形态和碳水化合物利用能力均无明显变化。以植物乳植杆菌P-8的原始菌株基因组作为参考,比较分析了不同代菌株的基因组稳定性,发现菌株均有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点存在,但数量较少(SNP位点0.05)。【结论】植物乳植杆菌P-8在MRS培养基中、37℃恒温环境下连续传代100代期间具有良好的遗传稳定性,为该菌株的产业化应用奠定了遗传学基础。

关键词：植物乳植杆菌P-8 连续传代比较基因组学遗传稳定性

小鼠胰腺干细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养(英文)

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第40期13卷 7964-7968页

作者：岑妍慧广西中医学院组织学与胚胎学教研室广西壮族自治区南宁市530001

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题。目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-... 详细信息

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题。目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成。材料:SPF级新生昆明小鼠20只,孕14d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心。方法:取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,Ⅴ型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养。取孕14d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108L-1接种于24孔板中,传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞。取原代培养5d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达。分别于传代后2,3,4,5d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达。结果:原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态。结论:以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态。

关键词：胰腺干细胞胚胎成纤维细胞饲养层连续传代