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在Klebsiella oxytoca中构建不依赖辅酶b12的1，3-丙二醇合成途径

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在Klebsiella oxytoca中构建不依赖辅酶B12的1，3-丙二醇合成途径

作者：郑学瑞山西大学

学位级别：硕士

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,简记1,3-PD)是一种重要的化工原料的中间产物,是工业生物技术领域研究的重要产品之一。最主要的用途是作为一种重要的单体原料,其可以合成多种重要的化工产品如:聚酯、聚醚和聚氨酯。其中,作为单体与对苯二... 详细信息

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,简记1,3-PD)是一种重要的化工原料的中间产物,是工业生物技术领域研究的重要产品之一。最主要的用途是作为一种重要的单体原料,其可以合成多种重要的化工产品如:聚酯、聚醚和聚氨酯。其中,作为单体与对苯二甲酸合成新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT),具有许多优良特性如:生物可降解性、安全无毒等,这是许多其它合成塑料所不具有的。1,3-PD主要用于增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成,也用于食品、化妆品和制药等行业。目前用于生物合成1,3-PD的菌种主要有Clostridium pasteurianum、Clostridiumbutyricum、Clostridium freundii、Klebsiella pneumoniae和Klebsiella oxytoca等。本实验室前期关于***的研究较多,其为兼性厌氧细菌,遗传操作较为方便简单;该菌可耐受较高浓度甘油与1,3-PD,具有较高的1,3-PD生产率和得率;该菌还可直接以废弃甘油为底物进行1,3-PD生产。目前,该菌厌氧发酵甘油生产1,3-PD的途径已比较清楚,一个关键问题是:催化该途径第一步反应的二醇脱水酶需要在辅酶b的辅助下才具有催化活性,但是很容易失活,因此成为关键性限速酶,限制了1,3-PD的生物合成。为解决这一问题,本研究拟利用基因工程手段将来源于Clostridium butyricumDSM 10702的的甘油脱水酶(一种二醇脱水酶的同工酶,但催化过程不依赖于辅酶b)导入***中,以提高1,3-PD合成效率。本研究以实验室前期构建的1,3-PD高产菌*** DA-1Hb为出发菌,初步研究了上述策略的可行性。首先,对出发菌的形态、分子特性和生理生化特性进行了重新鉴定,并对该菌进行了遗传稳定性和发酵特性的研究。其次,对购自德国微生物菌种保藏中心的菌株Clostridium butyricum DSM 10702利用16S rDNA进行了鉴定,证实其为丁酸梭菌。第三,利用基因工程手段扩增了*** DSM 10702基因组中的甘油脱水酶基因及其激活因子序列,为避免有毒中间产物3-羟基丙醛积累,同时扩增了位于同一操纵子(1,3-PD操纵子)上的1,3-PD脱氢酶基因(编码1,3-PD合成途径的第二个酶)。通过连接到T vector测序,发现该操纵子与Genbank报道的***的1,3-PD操纵子序列(序列号AY112989)具有96.07%的同源性,进一步扩增和测序研究发现该差异性源于菌种间差异。随后,利用含不同启动子的表达载体构建了表达质粒,并电转化到*** DA-1Hb中,筛选获得了携带不同表达质粒的重组产酸克雷伯氏菌。初步摇瓶发酵实验发现,携带有表达质粒pIPK的重组菌*** PK的1,3-PD产量提高52.7%。对表达质粒在重组菌*** PK中进行了重组质粒稳定性研究表明:重组菌PK的质粒稳定性良好,在前80代保持了100%的稳定性,从80代开始LbK平板结果显示质粒稳定性略微下降,但是仍然保持在较高的水平。本研究通过基因工程手段在***中构建了不依赖辅酶b的1,3-PD合成途径,并对质粒的稳定性及重组菌进行了初步发酵研究,对促进生物法合成1,3-PD的工业化进程具有重要意义。另外,该不依赖于辅酶b的甘油脱水酶的1,3-PD操纵子的成功克隆,将为应用于体外酶催化转化过程提供依据。

关键词：二醇脱水酶甘油脱水酶辅酶b12 1,3-丙二醇产酸克雷伯氏菌丁酸梭菌

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依赖辅酶b12的甘油脱水酶生物信息学分析

生物信息学 2007年第3期5卷 109-112页

作者：洪燕张燎原李雯君夏启容方柏山华侨大学工业生物技术高等学校重点实验室福建泉州362021

用生物信息学的方法对依赖辅酶b_(12)型甘油脱水酶的各个亚基结构进行了分析,并对其功能进行了探讨。通过对底物未结合时与底物结合后的酶分子构象变化进行分析,探讨了底物的结合对各个亚基的影响。

关键词：甘油脱水酶辅酶b12 亚基底物

辅酶b_(12)模型化合物生成与解离电化学研究(Ⅱ)

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物理化学学报 1994年第9期10卷 831-837页

作者：郑国栋阎雁王英黄楚宝高德安庆大吉林大学化学系长春130023 湖南大学化工系长沙410082 大连轻工业学院大连116034

用电化学方法研究了钴卟啉与多种直键溴代烷的相互作用，表明Ⅰ价钴卟啉可以与溴代烷形成有σ钴-碳键的输酶b12模型化合物．计算了Ⅰ价钴卟啉与各种直键溴代烷的加合速率常数．详细讨论了直键烷烃的链长与模型化合物生成速率及烷基钴卟... 详细信息

用电化学方法研究了钴卟啉与多种直键溴代烷的相互作用，表明Ⅰ价钴卟啉可以与溴代烷形成有σ钴-碳键的输酶b12模型化合物．计算了Ⅰ价钴卟啉与各种直键溴代烷的加合速率常数．详细讨论了直键烷烃的链长与模型化合物生成速率及烷基钴卟啉负离子稳定性的关系．讨论了几种模型化合物的优劣．

关键词：辅酶b12 模型物生成解离电化学

碱退式辅酶b_(12)类似物的合成和光谱性质

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化学学报 1996年第10期54卷 1030-1036页

作者：罗来斌燕红唐雯霞陈慧兰南京大学化学系南京210093 南京大学配位化学国家重点实验室南京210093

本工作用改进的方法合成了一类新的辅酶Ｂ１２碱退式类似物－含２＇－脱氧核苷啉醇酰胺。它们分别是２＇，５＇－二脱氧尿苷钴啉醇酰胺－二脱氧腺苷钴啉醇酰胺（２＇ｄＡｄｏＣｂｉ），２＇５＇－二脱氧胞苷钴啉醇酰胺（２＇ｄＣｙｔＣ... 详细信息

本工作用改进的方法合成了一类新的辅酶Ｂ１２碱退式类似物－含２＇－脱氧核苷啉醇酰胺。它们分别是２＇，５＇－二脱氧尿苷钴啉醇酰胺－二脱氧腺苷钴啉醇酰胺（２＇ｄＡｄｏＣｂｉ），２＇５＇－二脱氧胞苷钴啉醇酰胺（２＇ｄＣｙｔＣｂｉ）以及５＇－脱氧胞苷钴啉醇酰胺。研究了它们的ＵＶ－Ｖｉｓ和＾１ＨＮＭＲ光谱性质，并且和相应钴胺素的有关性质作了比较。

关键词：辅酶b12 钴啉醇酰胺脱氧核苷碱退式光谱性质

辅酶b_(12)模型化合物研究 Ⅹ.Costa型模型化合物的合成、表征及电化学性质研究

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无机化学学报 1996年第2期12卷 161-166页

作者：刘君罗来斌向平陈慧兰南京大学化学系配位化学国家重点实验室南京210093

合成了以 N,N′-双 (2 ,3-丁二酮 - 2 -亚胺 - 3-肟 )丙二胺为平面配体的烷基钴 Schiff碱一肟类 (Costa型 )模型化合物 [RCo(DO) (DOH) pn(H2 O) ] X,(R=n- C3 H7,n- C4H9,i- C4H9,n-C5H1 1 ,c- C6H1 1 ,CH2 C6H5.X=Cl O4-,PF-6)。用元素分析、紫外可见光谱和 1 H NMR进行了表征 ,并用循环伏安法研究了 [RCo(DO) (DOH) pn.H2 O] .Cl O4(R为上述六种烷基 )化合物的电化学性质 ,表明随烷基 R推电子能力增强 ,其氧化还原电位变负。

关键词：辅酶b12 烷基钴配合物循环伏安法钴-碳键

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辅酶b_(12)及其模型化合物

化学通报 1989年第6期 1-8页

作者：陈慧兰南京大学化学系

辅酶b12，即5’-脱氧腺苷钴胺素，是一个天然存在的有机金属化合物。它与维生素b12，即氰钴胺素组成和结构相似，但生理功能不同，维生素b12是一种抗恶性贫血的药物，而辅酶b12在生物体内多种代谢过程中起着重要作用。

关键词：辅酶b12 5’-脱氧腺苷钴胺素分子重排反应结构作用机理模型体系钴-碳键能模型化合物有机金属化合物

光声量热法测定辅酶b_(12)的光解量子产率

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物理化学学报 1997年第3期13卷 193-195页

作者：傅少伟罗来斌陈慧兰吴宗森张淑仪南京大学声学研究所南京大学化学系南京 210093 南京大学化学系

A photoacoustic detection system consisted of a piezoelectric cylindrical tube trans-ducer is applied to measure the photolysis of Coenzyme b12 (5’-deoxyadenosylcobalamin, AdoCbl)in methanol to obtain the quantum yield, φ. The value of 0.20±0.05 is in agreement with that obtained in aqueous solution by other authors with an optical method.

关键词：光解量子产率光声量热辅酶b12

辅酶b_(12)模型化合物的研究——Ⅰ.双水杨醛缩乙二亚胺烷基钴(Ⅲ)配合物Co-C键的性质

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无机化学学报 1991年第4期7卷 373-378页

作者：陈慧兰陈冠菁李玉梅唐雯霞戴庆平南京大学化学系南京大学配位化学所南京210008 南京大学分析中心南京210008

本工作合成、表征了一系列辅酶b_(12)模型化合物RCo(Salen)L,其中R=CH_3,C_2H_5,n和i-C_3H_7,n和i-C_4H_9,研究了上述配合物固体和溶液的Co-C键稳定性,结果表明:固体配合物Co-C键断裂的温度受烷基位阻影响,它们具有以下顺序:CH_3>C_2H_5... 详细信息

本工作合成、表征了一系列辅酶b_(12)模型化合物RCo(Salen)L,其中R=CH_3,C_2H_5,n和i-C_3H_7,n和i-C_4H_9,研究了上述配合物固体和溶液的Co-C键稳定性,结果表明:固体配合物Co-C键断裂的温度受烷基位阻影响,它们具有以下顺序:CH_3>C_2H_5>n-C_3H_7≈n-C_4H_9≈i-C_4H_9≈i-C_3H_7.此外还确定了影响配合物Co-C键在溶液中稳定性的因素.

关键词：钴配合物辅酶b12 模型化合物

辅酶b_(12)模型化合物的研究(Ⅲ)——一类新型烷基钴Schiff碱配合物的合成及Co—C键稳定性

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高等学校化学学报 1991年第4期12卷 431-435页

作者：陈慧兰陈冠菁缪炳文唐雯霞南京大学化学系配位化学研究所210008

合成与表征了一系列烷基钻Schiff碱配合物RCo(Sb)L(R为甲,乙,丙,正丁和异丁基;L为水;Sb为双水杨醛缩二甲基丁二胺),它们是一类尚未见报道的新的辅酶b_(12)模型化合物。该配合物的溶液很不稳定,加热或光照促使Co—C键断裂,轴向烷基和平... 详细信息

合成与表征了一系列烷基钻Schiff碱配合物RCo(Sb)L(R为甲,乙,丙,正丁和异丁基;L为水;Sb为双水杨醛缩二甲基丁二胺),它们是一类尚未见报道的新的辅酶b_(12)模型化合物。该配合物的溶液很不稳定,加热或光照促使Co—C键断裂,轴向烷基和平伏面配体对Co—C键稳定性均有影响。经紫外、可见分光光度法及自旋捕集ESR法确定了热分解和光分解反应的产物和超精细分裂常数。

关键词：辅酶b12 模型化合物钴西佛碱