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转基因聚合提高烟草耐旱性的研究

转基因聚合提高烟草耐旱性的研究

作者：宋英杰山东大学

学位级别：硕士

目前,水资源短缺是公认的全球性环境问题之一。干旱对世界作物产量的影响,在诸自然逆境中占据首位,其危害相当于其他自然灾害之和。已报道的提高植物对非生物逆境抗性的基因工程大多数是通过将单个目的基因转入植物,获得的转基因植物抗... 详细信息

目前,水资源短缺是公认的全球性环境问题之一。干旱对世界作物产量的影响,在诸自然逆境中占据首位,其危害相当于其他自然灾害之和。已报道的提高植物对非生物逆境抗性的基因工程大多数是通过将单个目的基因转入植物,获得的转基因植物抗逆性提高水平仍有待提高。由于植物的耐旱性是受多基因控制的复杂遗传性状,依赖于多个基因之间的相互作用,因此,转入单个耐旱相关基因只能部分提高植物的耐旱性。一般认为,将多个耐旱相关基因聚合到同一植物中有可能会大大提高转基因植物抵抗干旱胁迫的能力。来源于大肠杆菌的betA基因,编码胆碱脱氢酶,转入植物后可提高细胞甘氨酸甜菜碱含量;来自于盐芥的TsVP基因编码V-H-PPase,该基因过表达可提高液泡膜逆浓度梯度转运离子的能力。已有的基因工程研究表明,分别过量表达这两个基因都可以明显改善植物的耐旱性。本工作以分别转betA基因烟草(BL)、转TsVP基因烟草(TL)和通过有性杂交方法获得聚合有betA基因和TsVP基因betA×TsVP(BT)烟草为材料,RT-PCR结果和甘氨酸甜菜碱含量检测以及V-H-PPase水解活性的测定结果都表明,两个转基因稳定存在于转基因聚合的烟草植株中,并活跃表达。对转单基因植株和转基因聚合植株在植株和细胞水平上进行了耐旱性分析,主要结果如下: 在加有甘露醇的培养基上,转基因聚合株系(BT)表现出比转单基因株系和未转基因对照株系较高的种子萌发率,表明转基因聚合相比转单基因提高了烟草在种子萌发阶段的耐旱性。四叶期的烟草小苗进行持续干旱胁迫,在未转基因WT植株大部分已经枯萎死亡时,转单基因株系和转基因聚合株系植株大部分仍然存活,且转基因聚合株系的存活率和存活植株的鲜重最高,但未达到差异显著。干旱胁迫处理后,转TsVP基因植株和转基因聚合植株比WT植株和转betA基因植株生长快,具有旺盛的地上部分和发达的根系,其中转基因聚合植株的生物量最高。在正常生长条件下,转TsVP基因植株和转基因聚合植株的净光合速率显著高于WT和转betA基因植株的,而TsVP转基因植株和转基因聚合植株之间以及WT和转betA基因植株之间在光合能力上没有显著差异。干旱胁迫处理导致所有株系植株的光合活性下降,但转基因植株的净光合速率和Fv/Fm都比WT植株的高,表明转基因植株在干旱胁迫下仍保持较高的光合效率。其它光合作用参数的测定结果也表明转基因植株在干旱胁迫条件下比WT植株具有更好的光合能力,但转基因聚合植株与转单基因植株相比差异不显著。干旱胁迫前后,转TsVP基因植株和转基因聚合植株的可溶性总糖的含量比WT和转betA基因植株要高,且转基因聚合的植株最高。在干旱胁迫之后,转基因聚合植株和转单基因植株比WT植株脯氨酸含量高,各转基因植株之间差异不显著。转基因聚合株系中较高的糖和脯氨酸含量以及低的渗透势有利于烟草植株在干旱胁迫下水分吸收和叶片的水分保持。干旱使膜系统受到伤害,导致不同株系植株的叶片MDA含量和细胞电解质外渗率大幅度升高。WT植株的MDA含量和细胞电解质外渗值最大,而转基因聚合植株的最小,表明WT植株细胞受到的伤害最重,而转基因聚合细胞受害程度最小。在细胞学水平上对渗透胁迫下细胞活力和线粒体膜完整性的测定结果得出同样的结论,即在相同的胁迫条件下,转基因聚合株系受害程度低,原生质体活力高和线粒体膜完整性好。利用pH敏感的荧光探针BCECF-AM结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测了渗透胁迫对叶肉细胞细胞质和液泡pH值的影响。在10%PEG处理下,无论是细胞质还是液泡,转TsVP基因和转基因聚合植株的细胞,pH变化幅度较小。根据能斯特方程计算跨液泡膜的质子电势(△Ψ(H))。在胁迫前和胁迫后,转TsVP基因细胞和转基因聚合细胞中的△Ψ(H)值都要显著高于未转基因的和转betA基因细胞的。以上结果表明在含有外源TsVP基因的细胞中,V-H-PPase通过水解PPi来酸化液泡,从而维持了细胞中高的跨液泡膜质子电势。使转基因植株细胞在胁迫环境下维持了相对稳定的内环境,从而提高转基因植株的耐旱性。

关键词：转基因聚合烟草耐旱性 betA TsVP

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抗虫基因在转基因植株中聚合的初步研究

四川大学学报（自然科学版） 2002年第S1期39卷 50-54页

作者：马炳田王玲霞李平朱祯周开达四川农业大学水稻研究所中国科学院遗传与发育科学研究所北京100101 中国科学院遗传与发育科学研究所

以质粒 pBUSCK HPT ,pCUSBK HPT和pGNA HPT作抗虫基因供体 ,优良籼型三系恢复系SH5 2 7和广亲合系W 2 0 0 8为受体 ,采用基因枪转化法 ,获得了转修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (sck)、修饰的Bt毒蛋白基因 (sbk)和雪花莲凝集素基因 (gna... 详细信息

以质粒 pBUSCK HPT ,pCUSBK HPT和pGNA HPT作抗虫基因供体 ,优良籼型三系恢复系SH5 2 7和广亲合系W 2 0 0 8为受体 ,采用基因枪转化法 ,获得了转修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (sck)、修饰的Bt毒蛋白基因 (sbk)和雪花莲凝集素基因 (gna)的植株 .通过人工杂交 ,将外源基因聚合 .分子证据显示 ,作者获得了抗性基因聚合的材料 .蛋白活性测定表明 ,聚合基因的表达因载体结构相似而受到影响 ,但抗虫性却得到提高 .作者还讨论了聚合转基因在水稻育种中的作用和及其相关问题 .

关键词：修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因修饰的Bt毒蛋白基因雪花莲凝集素基因转基因聚合抗虫性水稻

转ZmPLC1-betA基因棉花的耐旱性研究

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转ZmPLC1-betA基因棉花的耐旱性研究

作者：吴伟山东大学

学位级别：硕士

干旱是全球普遍存在的自然灾害,它严重影响了作物的产量和品质。棉花是我国重要的经济作物,在我国国民经济中占有重要地位。伴随着人口增长以及粮食危机逐渐显现,棉花种植区逐渐向盐碱和干旱地区转移。由于不同棉花品种的耐旱性差异较大... 详细信息

干旱是全球普遍存在的自然灾害,它严重影响了作物的产量和品质。棉花是我国重要的经济作物,在我国国民经济中占有重要地位。伴随着人口增长以及粮食危机逐渐显现,棉花种植区逐渐向盐碱和干旱地区转移。由于不同棉花品种的耐旱性差异较大,因此利用基因工程手段培育抗旱棉花品种具有重要意义。非生物胁迫反应,尤其是干旱胁迫是涉及许多基因的复杂过程,许多基因都在植物干旱胁迫耐性中发挥了不可或缺的作用。这使得单纯的通过单基因转化提高植物胁迫耐性变得困难和缓慢。因此,将多种控制相关耐性性状的基因聚合于单一植株中,是未来获得具有较高水平胁迫耐性植株的一种新的策略。甘氨酸甜菜碱是植物重要的相容性物质,它在非生物胁迫下渗透的保护、生物大分子及生物膜结构及功能的维持、光合作用的保护和特定基因表达的诱导等方面起重要作用。甘氨酸甜菜碱在作物抗逆中发挥的作用已被广泛认识。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C是磷脂酰肌醇信号途径的关键“调控者”,并在胁迫信号转导、胁迫相关基因表达、渗透调节物质合成等过程中发挥重要作用。将磷脂酰肌醇磷脂酶C转入作物中也提高了转基因作物抗逆性。这两个基因在植物逆境抗性中发挥着不同的作用,功能具有较强的互补性,在作物中共表达可以协调作用进一步提高作物的抗逆性。本工作对已获得的聚合ZmPLC1基因和betA基因的转基因聚合棉花进行耐旱性研究。对转基因聚合棉花植株、转单基因棉花植株和野生型植株的苗期、蕾期和开花期进行了水分胁迫下的相关生理指标和农艺性状的测定,结果表明与野生型对照和转单基因对照株系相比,转基因聚合株系具有更高的干旱耐性。棉花幼苗在含有12%PEG6000的Hoagland营养液中处理24小时后,转基因植株与野生型对照相比具有更高的净光合速率和气孔导度以及更低的光系统Ⅱ损伤,能保持更高的相对含水量和更低的渗透势。而转基因聚合株系与转单基因株系相比具有更低的渗透势和光系统Ⅱ损伤以及更高的净光合速率,这表明与转单基因棉花幼苗相比,转基因聚合株系的棉花幼苗具有更高的渗透胁迫耐性。棉花蕾期干旱处理,随着干旱胁迫的进行,棉花植株叶片相对含水量逐渐下降,转基因棉花植株与野生型对照植株相比失水的速度较慢。干旱胁迫处理7天后,转基因聚合株系的相对含水量和超氧化物歧化酶活力显著高于转单基因植株和野生型对照。转基因聚合株系与转单基因株系和野生型株系相比还可以积累更多的渗透调节物质(甘氨酸甜菜碱、脯氨酸、可溶性多糖),维持更低的叶片饱和渗透势以及更低的膜损伤(表现为低的离子渗漏、丙二醛含量)。这些结果表明了转基因聚合株系在棉花蕾期时具有更高的干旱胁迫耐性。对各株系棉花花期干旱胁迫的农艺性状进行比较发现花期胁迫可以显著降低棉花的株高,减少开花数、结铃数和降低棉花产量。在花期干旱胁迫下,相比于野生型对照株系和转单基因对照株系,转基因聚合株系具有更高的籽棉和皮棉产量,其中转基因聚合株系CB-2的皮棉产量显著高于转单基因对照株系。苗期、蕾期和花期干旱胁迫的实验结果表明,将ZmPLC1基因和betA基因在同一植株中聚合表达可以进一步提高棉花的抗旱性。这也表明了通过基因聚合手段提高植物抗逆性是可行的。这对于棉花抗逆性应用和理论研究具有重要的意义,也为培育抗旱棉花新品种提供了优良的种质资源。

关键词：转基因聚合棉花耐旱性 ZmPLC1 betA

转ZmPIS基因及聚合betA/TsVP基因提高棉花耐旱性的研究

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转ZmPIS基因及聚合betA/TsVP基因提高棉花耐旱性的研究

作者：王娟山东大学

学位级别：硕士

干旱已成为限制全球农业生产的重要因素。随着人口增长和对生物能源的迫切需求,增加粮食和经济作物产量已成为当务之急,利用生物技术培育抗旱作物品种具有重要的战略意义。棉花是一种抗旱性较强的作物,适合在适度干旱条件下种植。不同... 详细信息

干旱已成为限制全球农业生产的重要因素。随着人口增长和对生物能源的迫切需求,增加粮食和经济作物产量已成为当务之急,利用生物技术培育抗旱作物品种具有重要的战略意义。棉花是一种抗旱性较强的作物,适合在适度干旱条件下种植。不同棉花品种的抗旱性差异较大,在缺水灌溉条件下无法获得较高产量,进一步提高棉花的抗旱性对于提高棉花产量和加强干旱、半干旱地区的开发利用具有重要意义。转ZmPIS基因棉花的耐旱性分析植物在进化过程中形成了对干旱应答的复杂机制,通过多种信号途径来做出相应的抗逆反应。研究表明,磷脂酰肌醇信号途径在植物生长、发育和对环境胁迫应答过程中发挥重要的作用。磷脂酰肌醇合成酶以CDP-DG和myo-inositol为底物生成磷脂酰肌醇。磷脂酰肌醇是真核细胞中主要磷脂成份之一,也是细胞中主要磷脂信号分子的前体。本工作对来自鲁棉研19的转ZmPIS基因T3棉花植株在苗期、蕾期和开花期进行了水分胁迫下的相关生理指标和耐旱性测定,结果表明转基因棉花一些株系的抗旱显著提高。5叶期棉花幼苗在含有12%PEG-6000的Hogland营养液中处理24小时后,野生型植株的叶片失水严重,植株严重萎蔫,而转基因株系叶片比较伸展,植株未发生萎蔫或萎蔫程度较轻。12%PEG-6000渗透胁迫后,转基因株系的净光合速率和气孔导度显著高于野生型对照。渗透胁迫降低了棉花幼苗细胞的溶质势,转基因植株细胞溶质势下降幅度较野生型对照显著,即转基因棉花细胞中积累了更多的溶质,增强了细胞吸取水分和持水能力,从而有利于植株保持正常形态和细胞膨压。棉花在花盆中生长至蕾期时,一次性浇足水后停止浇水,进行干旱胁迫处理。野生型植株在干旱胁迫第4天时,叶片已经开始萎蔫,含水量急剧下降。干旱胁迫至第8天,转基因植株叶片细胞膜离子渗漏率和丙二醛含量显著低于野生型植株,说明转基因植株叶片细胞的细胞膜损伤和膜脂过氧化程度都较轻。转基因植株叶片的叶绿素含量和净光合速率在干旱胁迫下也高于野生型对照。叶片可溶性糖含量、脯氨酸含量和细胞溶质势的测定结果表明,干旱胁迫前后,各株系可溶性糖与脯氨酸含量没有显著差异。干旱胁迫下转基因棉花的Ψs下降程度显著高于野生型对照,转基因棉花植株具有较强的渗透调节能力。开花期干旱试验结果表明干旱胁迫不伺程度地影响了各株系棉花植株的单株分支数、开花数和结铃数。开花期干旱胁迫后,转基因株系在单株分支数、开花数和结铃数上与野生型相比没有显著差异。但干旱胁迫导致野生型单株籽棉产量和皮棉产量分别下降了16.51%和23.53%,而其它三个转基因株系仅下降了10.33%-11.59%和15.89%-19.69%。值得注意的是,干旱胁迫后,转基因株系S3的单株籽棉产量和皮棉产量显著高于野生型（34.07%和30.77%）,而转基因株系S1和S2的籽棉产量和皮棉产量也比野生型高4.95%-1.0.44%和14.10%～15.38%。苗期、蕾期和花期耐旱性测定结果表明,外源ZmPIS基因的导入提高了转基因棉花在各个发育时期的耐旱性,且经过开花期的长期干旱胁迫后,转基因株系S3的单株籽棉产量显著高于野生型对照,这为培育抗旱棉花新品种提供了优良材料,对于棉花耐旱育种具有重要意义。此外,该工作为探讨渗透胁迫和磷脂酰肌醇信号传导途径的关系提供了有价值的参考资料。转基因聚合棉花BT （betA×TsVP）的耐旱性分析利用基因工程技术提高作物耐旱性是解决作物耐旱育种的有效途径之一。目前,通过向植物中转入耐逆相关基因可在一定程度上改善植物的耐逆性。然而,由于植物的耐逆性是受多基因控制的复杂遗传性状,依赖于多个基因之间的相互作用,是多种耐逆生理性状的综合体现,因此,转入单个耐旱相关基因只能部分提高植物的耐旱性。一般认为,将多个耐旱相关基因聚合到同一植物中有可能会大大提高转基因植物抵抗干旱胁迫的能力。来源于大肠杆菌的betA基因,编码胆碱脱氢酶,转入植物后可提高细胞甘氨酸甜菜碱含量;来自于盐芥的TsVP基因编码V-H+-PPase,该基因过表达可提高液泡膜逆浓度梯度转运离子的能力;已有的基因工程研究表明,分别过量表达这两个单基因都可以明显改善植物的耐旱性。本工作以分别转betA基因（BL）和转TsVP基因棉花（TL）植株为材料,通过有性杂交方法获得聚合有两个基因的棉花植株,即betA×TsVP （BT）。PCR检测和甘氨酸甜菜碱含量及V-H+-PPase水解活性的测定结果表明,betA和TsVP两个基因稳定存在于转基因聚合棉花植株中,并进行了活跃表达。在干旱胁迫下对转单基因植株和转基因聚合植株进行了生理生化测定,结果表明转基因聚合植株与转单基因植株相比具有较高的耐旱性。 5叶期棉花幼苗在含有12%PE

关键词：转基因聚合棉花耐旱性 ZmPIS betA TsVP

转ZmPLC1基因及聚合ZmPLC1/betA基因棉花耐盐性的研究

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转ZmPLC1基因及聚合ZmPLC1/betA基因棉花耐盐性的研究

作者：樊文菊山东大学

学位级别：硕士

盐胁迫是影响我国乃至世界范围内农作物产量和品质的主要非生物胁迫之一。棉花是我国重要的经济作物,在国民经济中占有重要地位。虽然棉花是一种耐盐性较强的作物,但不同棉花品种的耐盐性差异较大,即使抗性较强的品种在中度盐碱地种植,... 详细信息

盐胁迫是影响我国乃至世界范围内农作物产量和品质的主要非生物胁迫之一。棉花是我国重要的经济作物,在国民经济中占有重要地位。虽然棉花是一种耐盐性较强的作物,但不同棉花品种的耐盐性差异较大,即使抗性较强的品种在中度盐碱地种植,其产量也会受到很大影响。因此,利用基因工程手段培育耐盐抗逆性状的棉花品种,对于拓宽植棉区域和提高棉花产量具有重要意义。本工作对转ZmPLC1基因棉花和聚合ZmPLC1/betA基因棉花的耐盐性进行了初步研究。以转ZmPLC1基因棉花和野生型对照鲁棉研19为材料,利用水培和沙培的方法,比较研究了盐处理对棉花生理生化指标及脯氨酸代谢关键酶表达的影响,探讨了转入ZmPLC1基因对棉花耐盐性的影响。水培条件下,250mM NaC1处理7天后,与野生型对照相比,转ZmPLC1基因棉花叶色较绿,顶叶萎焉程度较低,光系统II的损伤程度更低,叶片的净光合速率和相对含水量更高,叶片保持更低的饱和渗透势。沙培条件下,通过对转ZmPLC1基因棉花及野生型对照的耐盐性分析发现,盐胁迫后,转ZmPLC1基因棉花叶片的相对含水量、净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、Fv/Fm、抗氧化酶活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量、离子含量（K+、Na+、Ca2+、C1-）显著高于野生型对照,离子渗漏和丙二醛含量显著低于野生型对照。RT-PCR和Real-Time PCR检测结果显示,盐胁迫后,转ZmPLC1基因棉花中ZmPLC1基因的表达量明显升高,且脯氨酸合成关键酶基因P5cs的表达高于野生型对照,脯氨酸降解中的关键酶基因ProDH的表达低于野生型对照。东营盐碱地实验发现,转ZmPLC1基因棉花的籽棉产量显著高于野生型对照。这些结果表明,转ZmPLC1基因棉花的耐盐性高于野生型对照。推测,ZmPLC1基因的异源表达不仅可以增强棉花中脯氨酸合成关键酶基因（P5cs）的表达,减弱脯氨酸降解关键酶基因（ProDH）的表达,促进脯氨酸等渗透物质的积累,还可能参与Ca2+调节的抗氧化防御和离子调节,保护光合系统,提高光合作用,从而提高转基因棉花的耐盐性。以聚合ZmPLC1/betA基因棉花（BC-1、BC-2、BC-3）、转betA基因棉花（B）、转ZmPLC1基因棉花（C）和野生型对照鲁棉研19（CK）为材料,比较盐处理对聚合ZmPLC1/betA基因棉花生理生化指标、甜菜碱含量、脯氨酸代谢关键酶表达的影响,初步了解ZmPLC1和betA基因共同作用的抗逆机制。 PCR和RT-PCR检测结果表明,betA和ZmPLC1基因稳定整合于基因聚合棉花植株中,且在棉花植株中进行活跃转录和表达。水培条件下,250mM NaCl处理7天后,与野生型对照和转单基因棉花相比,聚合ZmPLC1/betA基因株系棉花子叶边缘发黄程度较小,真叶萎焉程度较小,顶叶卷曲和萎焉程度较小。盐胁迫后,聚合ZmPLC1/beAt基因棉花叶片的相对含水量、光合作用参数、叶绿素荧光参数显著高于野生型对照和转单基因棉花,饱和渗透势显著低于野生型对照和转单基因棉花。沙培条件下,250mM NaCl处理21天后,与转单基因棉花和野生型对照相比,聚合ZmPLC1/betA基因株系棉花株高较高,叶片较大,叶片受损程度较小聚合ZmPLC1/betA基因棉花BC-3株系的叶片相对含水量、叶绿素含量、抗氧化酶活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量、甜菜碱含量、离子含量（K+、Na+、Ca2+Cl-）、K+/Na+比、叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、Fv/Fm显著高于转单基因棉花和野生型对照,离子渗漏、丙二醛含量和饱和渗透势显著低于转单基因棉花和野生型对照。 RT-PCR和Real-Time PCR检测结果显示,盐胁迫后,聚合ZmPLC1/betA基因棉花中ZmPLC1和betA基因的表达量明显升高,且显著高于转单基因棉花和野生型对照。RT-PCR检测结果显示,盐胁迫后,聚合ZmPLC1/betA基因棉花中脯氨酸合成关键酶基因P5cs的表达高于转单基因棉花和野生型对照,脯氨酸降解中的关键酶基因ProDH的表达低于转单基因棉花和野生型对照。东营盐碱地实验发现,聚合ZmPLC1/betA基因棉花的籽棉产量显著高于转ZmPLC1基因棉花、转betA基因棉花和野生型对照。这些结果表明,转单基因棉花和基因聚合棉花的耐盐性显著高于野生型对照,且基因聚合棉花的耐盐性显著高于转单基因棉花。推测,ZmPLC1和betA基因聚合可以更大程度地提高棉花叶片中的离子含量,维持细胞中的离子平衡;可以提高抗氧化酶活性,加强活性氧和自由基的清除,减缓盐胁迫对光合系统和细胞膜的损伤,降低离子渗漏和细胞中丙二醛含量;可以进一步减缓盐胁迫对棉花PSII反应中心的

关键词：转基因聚合棉花耐盐性 ZmPLC1 betA

聚合betA/TsVP/ZmPIS基因提高棉花耐旱性的研究

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聚合betA/TsVP/ZmPIS基因提高棉花耐旱性的研究

作者：陈修贵山东大学

学位级别：硕士

近年来,我国棉花的种植区域随着可利用耕地面积的减少越来越多的集中到干旱和半干旱地区,虽然棉花具有一定的耐旱性,但干旱仍然会严重影响棉花的产量。因此,培育耐旱性更强的棉花新品种对提高干旱地区棉花的产量具有重要意义。棉花的耐... 详细信息

近年来,我国棉花的种植区域随着可利用耕地面积的减少越来越多的集中到干旱和半干旱地区,虽然棉花具有一定的耐旱性,但干旱仍然会严重影响棉花的产量。因此,培育耐旱性更强的棉花新品种对提高干旱地区棉花的产量具有重要意义。棉花的耐旱性状受到多个基因的共同控制,因此,将多个耐旱基因聚合导入棉花可能会更显著地提高棉花的耐旱性。来源于大肠杆菌的betA基因,编码胆碱脱氢酶,转入植物后可提高细胞甘氨酸甜菜碱的含量;来自玉米的ZmPIS基因编码玉米磷脂酰肌醇信号途径的磷脂酰肌醇合成酶,磷脂酰肌醇信号途径在植物生长、发育和对环境胁迫应答过程中发挥重要的作用;来自于盐芥的TsVP基因编码液泡膜H+-PPase,该基因过表达可提高液泡膜逆浓度梯度转运离子的能力;已有的基因工程研究表明,分别过量表达这三个基因都可以明显改善植物的耐旱性。本实验研究了干旱胁迫下转基因聚合***和TsVP基因棉花在苗期、蕾期和花期的若干项相关生理生化指标的变化,并与转betA基因、转ZmPIS基因、转TsVP基因和野生型对照株系进行了比较分析,结果表明一些转基因聚合株系与转单基因株系和野生型对照株系相比表现出更好的耐旱性。对各株系在苗期和蕾期进行干旱胁迫处理,结果发现转基因聚合株系的净光合速率和气孔导度显著好于转单基因株系和野生型对照株系,其中一些转基因聚合株系叶片具有更高的相对含水量和更低的渗透势。蕾期干旱胁迫处理后,转基因聚合株系叶片的离子渗漏率和丙二醛含量显著低于各转单基因株系和野生型对照株系,说明转基因聚合株系在干旱胁迫下具有较轻的细胞膜损伤和膜脂过氧化程度。干旱胁迫前后,转基因聚合株系和转单基因株系的可溶性糖与脯氨酸含量没有显著差异,但一些转基因聚合株系叶片的SOD活性显著高于转单基因株系和野生型对照株系,表明转基因聚合株系能更好地清除干旱胁迫下植株体内积累的活性氧类物质,减轻细胞受到的伤害。开花期干旱实验结果表明干旱胁迫不同程度地影响了各株系的株高、单株分支数和单株结铃数,但各株系没有显著差异。干旱胁迫影响了各株系根的发育,野生型株系在干旱胁迫后根的干重降低,而转TsVP基因株系和3个转基因聚合株系根的干重却有不同程度的增加,并且转基因聚合株系3G-3根的干重与转TsVP基因株系没有显著差异,但与其他两个转单基因株系和野生型对照株系有显著差异。长期的干旱胁迫还导致各株系单株籽棉产量不同程度的下降,转基因聚合株系3G-1和3G-3的单株籽棉产量的下降幅度显著小于转单基因株系和野生型对照株系,而且转基因聚合株系3G-1和3G-3的单株籽棉产量显著高于转单基因株系和野生型对照株系。苗期、蕾期和花期干旱胁迫的实验结果表明,聚合betA、TsVP和ZmPIS基因可以进一步提高转基因棉花的耐旱性。

关键词：转基因聚合棉花耐旱性 betA TsVP ZmPIS

聚合betA/TsVP基因提高棉花耐盐性及共转化法获得基因聚合棉花的研究

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聚合betA/TsVP基因提高棉花耐盐性及共转化法获得基因聚合棉花的...

作者：郭宁山东大学

学位级别：硕士

棉花是我国重要的经济作物,是一种较耐盐碱大田作物,同时也是改良利用盐碱地的先锋作物之一。已有很多耐盐相关基因转化到了棉花当中,且不同程度的提高了转基因棉花的耐盐性。但目前耐盐基因工程的研究主要集中于单基因转化工作,对基因... 详细信息

棉花是我国重要的经济作物,是一种较耐盐碱大田作物,同时也是改良利用盐碱地的先锋作物之一。已有很多耐盐相关基因转化到了棉花当中,且不同程度的提高了转基因棉花的耐盐性。但目前耐盐基因工程的研究主要集中于单基因转化工作,对基因聚合提高棉花耐盐性的报道较少。由于作物的耐盐性是受多基因控制的复杂遗传性状,可能依赖于多个基因之间的协调作用。因此,将多个耐盐相关基因聚合到同一作物中有可能会进一步提高转基因植物对盐胁迫的耐受性。转基因聚合棉花BT (betA×TsVP)的耐盐性分析betA基因来源于大肠杆菌,编码的胆碱脱氢酶可以催化胆碱到甜菜碱的合成,转入该基因可提高转基因植物胞内甘氨酸甜菜碱含量;来自于盐芥的TsVP基因编码V-H+-PPase,该基因过表达可提高跨液泡膜逆浓度质子梯度,从而提高离子转运效率。已有研究表明,过量表达这两个单基因都可以明显改善植物的耐盐性。本工作以转betA基因(BL)和转TsVP基因棉花(TL)纯合株系为亲本,通过有性杂交方法获得了聚合有两个基因的棉花植株,即betA×TsVP(BT)。PCR检测和RT-PCR的测定结果表明,betA和TsVP两个基因稳定整合于基因聚合棉花植株中,并进行了活跃表达。甘氨酸甜菜碱含量及V-H+-PPase水解活性结果表明这两个基因很好的在聚合植株中行使各自的功能。盐胁迫下对转单基因植株和基因聚合植株进行了生理生化分析测定,结果表明转基因聚合植株在一些生理指标的测定结果上要好于转单基因植株,表现出更高的耐盐性。盐胁迫可以致使棉花叶片失水,使得植株出现萎蔫症状,棉花经盐胁迫处理14天后,各转基因株系棉花的长势优于对照植株且失水程度较轻。在胁迫处理第14天时,野生型对照植株的叶片相对含水量降低为71.12%,各转基因植株的叶片相对含水量降低为76.20-78.25%,其中转基因聚合株系BT1的叶片相对含水量(78.25%)最高。随着盐胁迫天数的增加,各株系叶片的渗透势表现出下降趋势。其中各转基因株系保持了低于野生型对照的渗透势,且转betA株系和转基因聚合株系BT1叶片细胞的渗透势达到显著差异水平。胁迫处理至第14天时,各转基因株系植株叶片的叶绿素含量在1.66～1.75 mgg-1FW之间,显著高于野生型植株叶片的1.29 mg g-1FW的叶绿素含量。此外,转基因聚合株系BT1的叶绿素含量显著高于转betA株系。随着胁迫天数的增加,各株系叶片的Pn和Gs值均呈现下降的趋势。盐胁迫处理第14天,转基因聚合株系的Pn值要高于转betA单基因植株。对于Gs而言,转基因聚合株系在胁迫处理后均高于野生型对照和转单基因株系。说明各株系植株叶片的净光合速率及气孔导度在高盐胁迫条件下均受到抑制,与野生型对照相比,各转基因植株的受抑制程度较轻,其中基因聚合株系BT1的受抑制程度还轻于转单基因株系。说明基因聚合进一步保护了盐胁迫条件下的植物光合系统,减缓光抑制损伤作用。盐胁迫处理后,各株系棉花叶片光系统II的Fv/Fm值呈现逐步下降的趋势,表明各株系的PSII反应中心都受到损伤。其中各转基因株系棉花的Fv/Fm值均高于对照植株,且转基因聚合株系BT1还显著高于转单基因株系。盐胁迫导致膜系统受到伤害,不同株系植株的叶片MDA含量和离子渗漏率表现出大幅度升高趋势。在盐胁迫处理7、14、21天时,各转基因株系的离子渗漏均低于野生型对照;并且在处理14天时达到显著差异水平,其中基因聚合株系的离子渗漏还显著低于BL株系。结果表明在相同的高盐胁迫条件下,基因聚合棉花株系的细胞膜受损程度低,细胞受伤害程度最小,保持了较好的膜稳定性。植物正常代谢过程和在各种环境胁迫下都产生大量的活性氧和自由基,自由基的积累可破坏细胞结构和功能。植物体内具有一系列抗氧化保护机制,以清除胞内的活性氧以免达到毒害水平。胁迫处理后野生型对照和各转基因植株的SOD活性上升,但在盐胁迫第7天后有所下降。在盐胁迫处理过程中,各转基因株系植株叶片的SOD活性显著高于野生型对照,其中基因聚合植株BT1的SOD活性在第7天时(2905.75 unit g-1 FW)显著高于转单基因植株BL(2610.05unitg-1 FW)和TL(2675.36 unit g-1 FW)。在盐胁迫处理14天时,除BL转基因株系外,各转基因株系显著高于野生型对照,但是彼此之间无显著差异。说明转基因株系细胞维持了更好的SOD活性,具有更强的氧自由基清除能力,从而更好的缓解细胞在胁迫环境下受到的氧化胁迫损伤。对于抗氧化酶POD和CAT来说,也有着同样的变化趋势。在盐处理过程中,转基因株系中的POD和CAT酶活始终高于野生型对照;胁迫处理第七天时,转基因聚合株系BT中两者的活性显著高于转单基因株系。盐胁迫通过

关键词：转基因聚合棉花耐盐性 ZmPIS betA TsVP