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超抗原sea-Fab’偶联蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究

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中华实验外科杂志 2004年第8期21卷 998-999页

作者：舒晓钢王国斌华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科武汉430022

目的探讨超抗原(SAg)金黄色葡萄球菌肠毒素A(sea)与抗人胃癌细胞单克隆抗体Fab’偶联蛋白的抗肿瘤活性。方法利用sea-Fab’激活效应细胞诱导的靶细胞凋亡指数检测。分别在靶细胞Walker-256加入sea-Fab’、sea,另设PBMC+Walker-256细... 详细信息

目的探讨超抗原(SAg)金黄色葡萄球菌肠毒素A(sea)与抗人胃癌细胞单克隆抗体Fab’偶联蛋白的抗肿瘤活性。方法利用sea-Fab’激活效应细胞诱导的靶细胞凋亡指数检测。分别在靶细胞Walker-256加入sea-Fab’、sea,另设PBMC+Walker-256细胞作为对照,作用时间分别为8、36和72h,观察该偶联蛋白的超抗原活性和激活T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。结果凋亡指数检测各处理组之间差异有非常显著性(Psea-Fab’组与sea组与效应细胞+靶细胞组之间差异有非常显著性(Psea-Fab’组与sea组差异有非常显著性(Psea-Fab’偶联蛋白比单独sea能更有效地激活T细胞的杀伤肿瘤细胞活性,以单克隆抗体为载体进行肿瘤导向治疗具有可行性。

关键词：偶联蛋白靶细胞超抗原sea 凋亡指数诱导肿瘤细胞凋亡 T细胞金黄色葡萄球菌肠毒素A 显著性载体

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不同T细胞亚群对超抗原sea反应性的差异

复旦学报（医学版） 2002年第6期29卷 437-439页

作者：张瑞华陈露秋储以微刘瑞梓王缨熊思东复旦大学医学院免疫学系上海200032 东京女子医科大学微生物学与免疫学教研室

目的　在体内和体外研究sea再次刺激后Vβ3+ CD4+ 和Vβ3+ CD8+ T细胞亚群的免疫反应 ,探讨CD4+ 和CD8+ T细胞亚群对超抗原sea反应性的差异。方法　分离小鼠超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(sea)应答性Vβ3+ CD4+ 和Vβ3+ CD8+ 两个T细胞亚... 详细信息

目的　在体内和体外研究sea再次刺激后Vβ3+ CD4+ 和Vβ3+ CD8+ T细胞亚群的免疫反应 ,探讨CD4+ 和CD8+ T细胞亚群对超抗原sea反应性的差异。方法　分离小鼠超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(sea)应答性Vβ3+ CD4+ 和Vβ3+ CD8+ 两个T细胞亚群 ,检测其对sea再次刺激的增殖反应及产生IL 2活性。结果　Vβ3+ CD4+ 和Vβ3+ CD8+ T细胞亚群对sea再次刺激所诱导的增殖反应以及产生IL 2活性的能力有显著差异 (P sea单次刺激时Vβ3+ CD4+ 和Vβ3+ CD8+ T细胞亚群反应性相似 ,再次刺激时Vβ3+ CD8+ 呈显著低反应性。

关键词： T细胞亚群超抗原sea 反应性差异

超抗原sea对小鼠脾淋巴细胞活化和增殖的影响

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中国急救医学 2007年第3期27卷 229-231页

作者：黄杨宋祖军张秀敏葛伟司少艳胡沛臻李侠郝路隋延仿解放军第四军医大学基础部病理学教研室西安710033 第四军医大学西京医院急诊科

目的观察超抗原sea体外对小鼠脾淋巴细胞活化和增殖的影响。方法sea体外诱导小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞、T细胞、B细胞的增殖能力,用流式细胞术检测淋巴细胞膜表型的变化,并测定脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的水平... 详细信息

目的观察超抗原sea体外对小鼠脾淋巴细胞活化和增殖的影响。方法sea体外诱导小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞、T细胞、B细胞的增殖能力,用流式细胞术检测淋巴细胞膜表型的变化,并测定脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的水平。结果不同浓度sea诱导脾淋巴细胞的增殖能力不同,在1～4d内的增殖变化也不完全一样,sea浓度为103ng/mL时,脾淋巴细胞的活化和增殖能力最强。sea对T细胞(无APC)和B细胞的增殖无明显影响。细胞培养上清中IL-2和INF-γ的水平显著升高,IL-4和IL-10含量低。结论在APC递呈作用下,sea能显著诱导初始CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖,促使TH0细胞向TH1细胞分化,分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子。

关键词：超抗原超抗原sea 淋巴细胞活化增殖

超抗原sea与抗人大肠癌单链抗体ND-1ScFv融合基因的构建、表达及活性分析

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超抗原SEA与抗人大肠癌单链抗体ND-1ScFv融合基因的构建、表达及...

作者：李莉中国医科大学

学位级别：硕士

前言大肠癌是发病率很高的恶性肿瘤之一，在我国已位居第四，并且呈逐年上升趋势。目前研究表明肿瘤表面抗原的调变，MHC抗原表达不足及细胞因子产生减少等多种因素造成肿瘤局部处于免疫抑制状态，肿瘤细胞可以逃避机体的一系列免疫监... 详细信息

前言大肠癌是发病率很高的恶性肿瘤之一，在我国已位居第四，并且呈逐年上升趋势。目前研究表明肿瘤表面抗原的调变，MHC抗原表达不足及细胞因子产生减少等多种因素造成肿瘤局部处于免疫抑制状态，肿瘤细胞可以逃避机体的一系列免疫监视机制而继续发生发展，这可能是肿瘤细胞难以控制的主要原因之一。因此，提高局部活化的免疫效应细胞数量，以逆转肿瘤局部的免疫抑制状态进而激发起强烈的抗肿瘤免疫反应，可能是机体得以排斥肿瘤的有效手段，这也是目前肿瘤免疫治疗的一个主要目的。在寻找有效的免疫反应激活剂用于抗肿瘤的研究中，超抗原以其强烈激活T淋巴细胞的特性而备受关注。超抗原是一类特殊的抗原分子，主要是一些细菌的毒素和病毒的产物，其不需要抗原提呈细胞的加工处理，可直接以完整的蛋白质形式与抗原提呈细胞膜上的MHC-Ⅱ类分子结合而被提呈到T细胞，与TCR的V片段特异性结合，形成MHC-Ⅱ-SAg-TCR-V复合体，激活大量的T细胞(包括CD4，CD8)并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用，这种作用被称为超抗原依赖细胞介导的细胞毒作用。目前，超抗原的这种特性已被广泛用于抗肿瘤的研究当中。其中，葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A sea)是一种已有较广泛研究基础的超抗原，诸多体内和体外实验已证实其具有明显的诱发抗肿瘤免疫反应的作用。从上述超抗原作用机制可见，sea的提呈与MHC-Ⅱ分子有极大的关系，然而并非所有肿瘤细胞都表达MHC-Ⅱ分子，且超抗原无抗肿瘤的特异性，MHC-Ⅱ类阳性的正常细胞也能成为其靶细胞而被杀伤，因此超抗原直接用于抗肿瘤有很多的限制。为了增强其对肿瘤的特异性，构建单克隆抗体与超抗原的融合蛋白使超抗原不再需要MHC-Ⅱ类分子的辅助，而通过单抗与表达相应抗原的肿瘤细胞特异性结合后，在肿瘤局部活化大量T细胞，释放多种细胞因子，杀伤肿瘤细胞，称为单抗导向的超抗原。近年来利用基因工程方法改造完整单抗得到的小分子片段如ScFv、Fab’等，保留和亲本抗体相似的活性，大大改善了完整单抗的缺点，且在基因水平上较为容易操作，已有很多研究利用sea和ScFv构建融合蛋白并表现出显著的杀伤肿瘤细胞活性。 ND-1是以人大肠癌细胞系CCL-187为免疫原制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体，该单抗对高中分化大肠癌组织具有高特异结合活性，利用基因工程将ND-1改造获得的小分子单链抗体ND-1ScFv已经体内外实验证实具有其亲本单抗ND-1相似的抗原特异性。在此基础上，本研究拟构建ND-1ScFv和sea的融合基因，并在大肠杆菌中进行功能性表达，以提高sea的大肠癌靶向杀伤作用。为大肠癌的免疫治疗提供新的途径。实验材料与方法以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板PCR扩增获得sea基因序列，PCR产物克隆入pMD18-T vector并转化*** JM109，测序鉴定单菌落;从鉴定正确的单菌落中提取质粒并以该质粒为模板PCR扩增linker-sea序列，扩增过程中引入编码5个氨基酸(GS)的linker序列及用于插入表达载体pQE30 ScFv的ScFv基因下游所需的SalⅠ／HindⅢ酶切位点，PCR产物克隆入T载体并转化，测序鉴定后，即获得克隆载体pMD18-T linker-sea。以质粒pET-28a(+)ND-1ScFv为模板PCR扩增ScFv序列，引入用于将其插入表达载体pQE30的酶切位点BamHⅠ和SalⅠ。PCR产物克隆入T载体并转化，测序鉴定提取质粒即为pMD18-T ScFv。将质粒双酶切克隆入表达pQE30载体并转化*** M15，从单菌落中提取质粒经相同双酶切鉴定，即获得表达载体pQE30ScFv。将质粒pMD18-T linker-sea和pQE30 ScFv经相同的双酶切，16℃过夜连接，转化*** M15，从单菌落中提取质粒双酶切鉴定，即获得融合蛋白的表达载体pQE30 ND-1ScFv-sea。在IPTG终浓度1mM、25℃、3小时的条件下，大量诱导表达ND-1ScFv-sea，裂解菌体收集包涵体，经变性溶解，Ni-NTA resin亲和层析柱纯化，复性;纯化后的ND-1ScFv-sea进行SDS-PAGE测定分子量及纯度。间接免疫荧光法检测融合蛋白与CCL-187细胞的特异性结合活性，MTT法测定其对CCL-187细胞的杀伤作用。实验结果以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板PCR扩增sea，产物经琼脂糖凝胶电泳在750bp附近显示一明显条带，与sea理论值771bp相符。产物测序结果回报，除设计的三处定点突变外，其余序列与原序列完全一致。以质粒pMD18-T sea为模板PCR扩增linker-sea，产物经琼脂糖凝胶电泳在750bp附近显示一明显条带，与li

关键词：超抗原sea 单克隆抗体大肠癌免疫治疗

超抗原sea的GPI锚定修饰和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达

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中国生物工程杂志 2003年第3期23卷 59-61页

作者：于继云陈兴蔡欣田蓉程绍辉许红莲王嘉玺军事医学科学院基础医学研究所北京100850 第四军医大学西京医院皮肤科西安710032

将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上 ,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。通过将从衰变加速因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与sea嵌合 ,获得了GPI修饰的sea分子 ,构建的真核表达载体pCI GPI-sea ,用脂质体方法... 详细信息

将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上 ,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。通过将从衰变加速因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与sea嵌合 ,获得了GPI修饰的sea分子 ,构建的真核表达载体pCI GPI-sea ,用脂质体方法转染到CHO dhfr-细胞中 ,并用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选 ,细胞免疫荧光分析证实 ,sea能够在细胞膜上表达。上述GPI锚定修饰的sea ,可用于进一步研究治疗性肿瘤疫苗。

关键词：肿瘤疫苗超抗原sea GPI-锚定蛋白细胞表面工程

超抗原sea基因表达及其对禽流感灭活苗的免疫增强作用研究

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超抗原SEA基因表达及其对禽流感灭活苗的免疫增强作用研究

作者：苏文中国农业科学院

学位级别：硕士

疫苗接种是防控高致病性禽流感传播蔓延的重要措施。我国利用反向遗传操作技术研制的禽流感疫苗能为免疫鸡提供良好的保护。然而，现用油乳剂灭活疫苗还存在免疫抗体产生较慢、肉鸡免疫后抗体效价不高等问题，因而有必要进一步提高现用... 详细信息

疫苗接种是防控高致病性禽流感传播蔓延的重要措施。我国利用反向遗传操作技术研制的禽流感疫苗能为免疫鸡提供良好的保护。然而，现用油乳剂灭活疫苗还存在免疫抗体产生较慢、肉鸡免疫后抗体效价不高等问题，因而有必要进一步提高现用灭活疫苗的免疫效果。金黄色葡萄球菌肠毒素A（sea）是一类具有超抗原性质的蛋白，其具有成为免疫增强剂的潜能。本研究构建了原核表达质粒pET-sea，通过优化表达条件，获得了可溶性重组sea（rsea）。体外鉴定表明该蛋白能刺激鸡外周血单核细胞（PBMC）大量增殖，具有良好的生物活性。为探讨rsea对灭活苗免疫效果的影响，本研究以最新研制的H5N1亚型重组禽流感病毒Re-6株为对象，制备极高（400μg/0.3mL）、高（100μg/0.3mL）、中（10μg/0.3mL）、低（1μg/0.3mL）、极低（0.1μg/0.3mL）rsea含量及不含rsea的AIV灭活疫苗。同时，我们也制备了以新城疫病毒LaSota株为疫苗毒株的高（100μg/0.3mL）、中（10μg/0.3mL）rsea含量及不含rsea的NDV灭活疫苗。 SPF鸡免疫后第7日，全部含rsea免疫组的HI抗体效价和CD4+/CD8+平均值均显著大于不含rsea免疫组（psea和不含rsea免疫组HI抗体平均效价分别为3.3log2和0，攻毒后分毒阳性数分别为4/8和8/8。免疫后第10日攻毒，含中剂量rsea免疫组鸡均不发病、不死亡且不排毒，而不含rsea免疫组鸡虽不死亡，但有3/8的鸡病毒分离为阳性。免疫后第21日，含rsea免疫组HI抗体平均峰值均大于或等于10log2，与不含rsea免疫组的8.8log2比较差异显著（psea，结果均为阴性。本试验表明，灭活疫苗中加入rsea能刺激SPF鸡产生更高的免疫抗体及更早的免疫保护反应。肉鸡免疫后第14日，含rsea高剂量和中剂量免疫组HI抗体平均效价分别为5.6log2和4.2log2，均显著高于不含rsea免疫组的2.9log2（psea高剂量组和中剂量免疫组HI抗体平均效价分别为8.5log2和8.0log2，显著高于不含rsea免疫组的6.8log2（psea高剂量免疫组的CD4+和CD4+/CD8+值均高于不含rsea免疫组(psea同样能刺激肉鸡产生良好的体液免疫和细胞免疫反应。含rsea的NDV油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡后，HI抗体平均效价显著高于不含rsea免疫组（psea免疫组的1.7log2（psea对NDV灭活疫苗也具有良好的免疫增强作用。综上所述，rsea能协助禽流感和新城疫等免疫抗原诱导机体产生快且强的体液免疫，同时也能激活细胞免疫，进而增强机体防病能力。因此，rsea可改善灭活疫苗的免疫效力，是一种安全有效的免疫增强剂。

关键词：禽流感灭活疫苗超抗原sea 免疫增强

装载超抗原sea基因的由前列腺特异性抗原和端粒酶逆转录酶启动子双调控靶向前列腺癌的溶瘤腺病毒载体的构建

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中华实验外科杂志 2010年第3期27卷 330-332页

作者：韩从辉郝林胡建鹏王涛贡震贺厚光董秉政张培影东南大学附属徐州医院(徐州市中心医院)泌尿外科江苏徐州221009 首都医科大学肿瘤中心东南大学肿瘤研究所

目的构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素（sea）基因的由前列腺特异性抗原（PSA）启动子及端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒SG504-sea。方法从前列腺癌组织基因组DNA中获得522bp大小的PSA启动子序列，将PSA... 详细信息

目的构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素（sea）基因的由前列腺特异性抗原（PSA）启动子及端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒SG504-sea。方法从前列腺癌组织基因组DNA中获得522bp大小的PSA启动子序列，将PSA启动子克隆到由hTERT启动子调控的特异性增殖溶瘤腺病毒载体SG502中，得到靶向前列腺癌细胞的双调控溶瘤腺病毒载体SG504。将已构建好的含有771bp大小sea基因片段的病毒骨架质粒PPE3-ccdb—sea与SGSIM用Lipofectamine 2000共转染至293细胞。共转染后9—14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，经鉴定正确的腺病毒命名为SG504-sea，即携带sea基因的双调控靶向前列腺癌的特异性溶瘤腺病毒。结果经聚合酶链反应（PCR）及酶切鉴定，sea基因成功克隆到病毒载体中，可以表达sea基因，且病毒滴度为2．0×10^10pfu／ml。结论成功构建表达超抗原sea基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG504-sea。

关键词：前列腺癌前列腺特异性抗原端粒酶逆转录酶超抗原sea 溶瘤腺病毒

双调控溶瘤腺病毒介导超抗原sea基因靶向膀胱肿瘤表达

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中华实验外科杂志 2010年第8期27卷 1131-1133页

作者：胡建鹏郝林张培影范涛董秉政贺厚光贡震韩从辉徐州医学院附属临床学院泌尿外科 221009

目的构建携带sea基因的选择性增殖腺病毒,体外实验观察sea基因的表达及其刺激淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能.方法构建一种由端粒酶（hTERT）和缺氧反应元件（HIF）双重启动的携带sea的选择性增殖腺病毒,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR... 详细信息

目的构建携带sea基因的选择性增殖腺病毒,体外实验观察sea基因的表达及其刺激淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能.方法构建一种由端粒酶（hTERT）和缺氧反应元件（HIF）双重启动的携带sea的选择性增殖腺病毒,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测sea在肿瘤细胞内mRNA表达,免疫荧光定位sea表达于肿瘤细胞,Western blot测定蛋白表达,显微镜下动态观测淋巴细胞与肿瘤细胞共培养.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素（IL）-4分泌.结果琼脂糖电泳252 bp处可见清晰条带;免疫荧光及Western blot用考马斯亮蓝染色显示在27 kDa附近可见蛋白清晰表达;淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48 h实验组肿瘤细胞明显少于对照组,ELISA检测IL-4分泌量实验组均高于对照组（t=2.585 P＜0.05）.结论携带sea基因的选择性腺病毒成功构建并表达目的基因,证明对肿瘤细胞的杀伤作用.

关键词：膀胱肿瘤溶瘤腺病毒超抗原sea

表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体的构建与鉴定(英文)

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现代生物医学进展 2010年第15期10卷 2839-2842页

作者：范涛郝林贺厚光梁清董秉政胡建鹏韩从辉徐州市中心医院泌尿外科江苏徐州221009

目的:构建表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体并鉴定。方法:采用PCR技术,从产sea的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得sea全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-sea。将鉴定正确的pCA13-sea与含有腺病毒右... 详细信息

目的:构建表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体并鉴定。方法:采用PCR技术,从产sea的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得sea全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-sea。将鉴定正确的pCA13-sea与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-sea。Ad-sea在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度。结果:经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,sea基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现sea基因的表达。结论:成功构建了表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体,为进一步研究该病毒对膀胱肿瘤靶向治疗的作用奠定了基础。

关键词：溶瘤腺病毒超抗原sea 肿瘤载体