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补体膜攻击复合物对肾小管上皮细胞亚溶破损伤效应的研究

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补体膜攻击复合物对肾小管上皮细胞亚溶破损伤效应的研究

作者：张瑞第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是肾脏疾病进展至终末期肾衰的共同通道,以细胞外基质(extracellurmartix,ECM)在肾脏间质组织中过度积聚为特征。肾小管上皮细胞(human kidney proximal tubular cell... 详细信息

研究背景与目的肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是肾脏疾病进展至终末期肾衰的共同通道,以细胞外基质(extracellurmartix,ECM)在肾脏间质组织中过度积聚为特征。肾小管上皮细胞(human kidney proximal tubular cells,HKCs)在结构上与肾间质紧密相连,是间质损伤的核心细胞;HKCs的损伤及损伤后反应是引TIF的主要因素之一。补体系统是体内重要的天然免疫防御系统,当病原微生物或炎性介质存在时可被激活,最终通过末端成分组装成C5b-9(n)),即补体膜攻击复合物(membrane attackcomplex,MAC)。非致死剂量的MAC(sublytic MAC,sMAC)可沉积于多种有核细胞,刺激细胞发生代谢改变,分泌炎性介质,并诱导细胞因子、粘附分子及其它功能蛋白的表达,这些效应统称为sMAC的亚溶破刺激效应。肾脏是免疫损伤的主要靶器官之一,大多数肾小球肾炎患者的肾小球及肾小管区均发现有sMAC沉积物,并与肾脏的损伤密切相关,因此研究补体活化后产生的sMAC对肾脏细胞的亚溶破刺激效应具有重要意义。目前,sMAC对内皮细胞、淋巴细胞、肾小球细胞等多种有核细胞的亚溶破刺激效应已有报道,但对HKCs产生的亚溶破刺激效应报道甚少。HKCs与其它肾脏固有细胞比较,其补体调节蛋白表达较弱,因此,HKCs更易遭受补体复合物介导的免疫损伤。 Ⅳ型胶原(CollagenⅣ,ColⅣ)是小管间质区ECM重要组份之一,部分来源于肾小管上皮细胞;已有研究证明某些损伤因素的刺激可导致肾小管上皮细胞ColⅣ表达增加;此外有研究显示,在有C及MAC沉积的肾小管间质损伤区,同时亦有ColⅣ堆积,但相关研究尚不深入;基于以上分析,推测sMAC可能对HKCs产生刺激效应并影响HKCs对ColⅣ的表达,参与TIF的发生机制。本研究以HKCs为靶细胞,提取人血清补体优球蛋白C,体外组装sMAC,建立HKCs亚溶破模型;观察并检测sMAC对HKCs的亚溶破效应及其对ColⅣ表达的影响,探讨sMAC和HKCs在肾间质纤维化发病机制中的意义,为肾间质纤维化的临床防治提供新的思路。方法 1.采用酵母多糖激活红细胞沉降率＞30mm/h的病人血清,提取C,微量板孔法判定补体C活性,分离及提纯C;梯度稀释纯化C,以新鲜正常人血清(NHS)作为C～C来源,微量溶血法滴定C,观察不同稀释度对豚鼠红细胞的溶血活性。 2.体外组装sMAC,激光共聚焦显微镜(Laser confocal microscopy,LSCM)、倒置荧光显微镜在形态上证实MAC在细胞膜上的正确组装;CCK-8细胞活力实验检测MAC对HKCs亚溶破量-效关系并确立MAC的最适亚溶破剂量。 3.倒置相差显微镜观察sMAC刺激HKCs后不同时相点细胞形态学变化。脱落细胞计数及台盼兰拒染法检测细胞粘附力及细胞活力的改变。流式细胞仪检测sMAC刺激HKCs后ColⅣ表达的时-效和量-效关系。结果 1.血沉高于30 mm/h的病人血清经酵母多糖活化后,用微量板孔法测定补体C活性,有36孔出现溶血;其溶血活性与C呈剂量依赖关系。 2.分离提纯的补体优球蛋白C能与正常人血清(NHS)中C～C补体终末成分体外正确组装成MAC,建立亚溶破模型。CCK-8细胞活力实验确立MAC对HKCs最适亚溶破剂量为C1:480,1:40 EDTA—NHS;在该剂量刺激下,激光共聚焦和倒置荧光显微镜观察sMAC在HKCs膜表面大量沉积,同时细胞形态没有发生明显改变,细胞膜完整性好;流式细胞仪显示细胞表面也有MAC沉积。提示所加入的MAC是亚溶破剂量的MAC,细胞能够抵抗MAC的溶细胞作用。 ***刺激HKCs后镜下脱落细胞计数见细胞粘附力下降、脱落明显,台盼兰拒染法见细胞活力未受影响,流式细胞技术检测ColⅣ的表达显著增高,且与sMAC刺激剂量及刺激时间呈正相关(p＜0.05)。结论 1、采用酵母多糖法成功提取了补体优球蛋白C56。 2、体外成功组装了HKCs补体膜攻击复合物亚溶破模型,确立了HKCs最适亚溶破剂量:C1:480,1:40 EDTA—NHS。 3、亚溶破剂量的MAC可刺激HKCs活化,导致HKCs对ColⅣ的合成增加,提示补体活化可诱导细胞外基质的合成,是导致TIF发生的可能机制之一。

关键词：补体膜攻击复合物 IV型胶原 C56 肾小管上皮细胞肾小管间质纤维化

抗人补体膜攻击复合物新抗原单克隆抗体的制备及鉴定

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免疫学杂志 2002年第6期18卷 465-467页

作者：王更银陈兴白云周镜然李烛姜曼白求恩国际和平医院输血科河北石家庄050082 第三军医大学免疫学教研室重庆400038

目的　研制针对人补体膜攻击复合物 (MAC)新抗原的特异性单克隆抗体。方法　在兔红细胞表面组装人MAC ,分离纯化RBC膜蛋白。以初步纯化的MAC免疫Balb c小鼠 ,取免疫小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合 ,采用免疫斑点杂交的方法分别以纯... 详细信息

目的　研制针对人补体膜攻击复合物 (MAC)新抗原的特异性单克隆抗体。方法　在兔红细胞表面组装人MAC ,分离纯化RBC膜蛋白。以初步纯化的MAC免疫Balb c小鼠 ,取免疫小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合 ,采用免疫斑点杂交的方法分别以纯化的单一补体成分C5、C6、C7、C8、C9和MAC同时进行阴性和阳性筛选。结果　获得了 2株仅与MAC反应而不与各单体成分反应的单克隆抗体。进一步以体外组装的补体终末复合物进行鉴定 ,证实所获单克隆抗体可特异性识别MAC复合物中C9分子暴露出的新抗原。经ELISA法测定 ,2株杂交瘤细胞的培养上清液和腹水效价分别为 1× 1 0 -3 ,1× 1 0 -3和 1× 1 0 -6,1× 1 0 -7;单克隆抗体的重链均属小鼠IgG1亚类 ,轻链均为κ型。结论　获得了 2株特异性识别MAC新抗原的单克隆抗体。

关键词：补体膜攻击复合物新抗原单克隆抗体制备鉴定

氯胺-T氧化C5、体外组装补体膜攻击复合物及其鉴定

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第三军医大学学报 2002年第10期24卷 1229-1230页

作者：周镜然朱锡华白云姜曼黎万玲第三军医大学基础医学部全军免疫学研究所重庆400038

目的　利用氧化的方法在无酶解反应发生的情况下获得活化形式的C5 ,进而实现以纯化的补体终末成分体外组装补体膜攻击复合物 (MAC)。方法　以蛋氨酸氧化剂氯氨 T与纯化的C5相互作用后 ,加入C6组装具溶血活性的C5 6复合物。以此复合物与... 详细信息

目的　利用氧化的方法在无酶解反应发生的情况下获得活化形式的C5 ,进而实现以纯化的补体终末成分体外组装补体膜攻击复合物 (MAC)。方法　以蛋氨酸氧化剂氯氨 T与纯化的C5相互作用后 ,加入C6组装具溶血活性的C5 6复合物。以此复合物与NHS或纯化的后续终末补体成分组装MAC ,检测复合物的溶血活性。结果　反应性溶破实验证实 ,氯胺 T氧化C5与C6组装形成功能C5 6复合物 ,后者可与NHS或纯化的补体终末成分C7～C9体外组装具溶血活性的MAC ,并且所形成的C5 6复合物在 2 4h达到最大的溶血活性 ,48h仍保持稳定。结论　氯胺 T在不裂解C5的条件下产生了C5b样活性分子 ,该分子能与C6组装形成稳定的活性复合物 ,并可与其它补体终末成分组装产生活性MAC。

关键词： C5 补体膜攻击复合物补体终末成分氯氨-T

体外组装补体膜攻击复合物建立肾小管上皮细胞亚溶破模型

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重庆医学 2007年第5期36卷 386-388页

作者：张静波陈永文周镜然张瑞李景怡姜曼黎万玲袁发焕吴玉章第三军医大学新桥医院肾内科重庆400037 第三军医大学全军免疫研究所重庆400038

目的体外组装补体膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC），建立肾小管上皮细胞HK一2亚溶破模型，为进一步探讨小管间质的免疫性损伤效应奠定基础。方法用酵母多糖激活急性期患者血清制备补体优球蛋白C56，以新鲜正常人血清（NH... 详细信息

目的体外组装补体膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC），建立肾小管上皮细胞HK一2亚溶破模型，为进一步探讨小管间质的免疫性损伤效应奠定基础。方法用酵母多糖激活急性期患者血清制备补体优球蛋白C56，以新鲜正常人血清（NHS）作为C7～C9来源，体外组装sMAC建立HK-2亚溶破模型，LDH检测评价细胞亚溶破剂量，激光共聚焦显微镜（LSCM）鉴定sMAC沉积，流式细胞仪检测sMAC对HK-2表面HLA-DR分子表达的影响。结果确定C56 1：480，NHS 1：20为HK-2最适亚溶破量；LSCM显示sMAC沉积于HK-2细胞表面；不同时相观察sMAC刺激后HK-2细胞HLA—DR表达量逐渐升高，HLA—DR比对照组显著增加（P〈0．01）。结论成功建立了肾小管上皮细胞补体膜攻击复合物亚溶破模型，补体活化可能导致TEC本身参与了免疫炎症效应。

关键词：补体膜攻击复合物亚溶破模型肾小管上皮细胞

体外组装补体膜攻击复合物对肾小管上皮细胞Ⅳ型胶原合成的影响

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重庆医学 2007年第5期36卷 389-390页

作者：张瑞张静波陈永文周镜然袁发焕第三军医大学新桥医院肾内科重庆400037 第三军医大学全军免疫研究所重庆400038

目的探讨补体膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）对肾小管上皮细胞HK-2细胞外基质成分Ⅳ型胶原表达的影响。方法以纯化的c56及新鲜正常人血清（the normal human serum，NHS）作为C7～C9来源，体外组装sMAC建立HK-2亚溶破模... 详细信息

目的探讨补体膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）对肾小管上皮细胞HK-2细胞外基质成分Ⅳ型胶原表达的影响。方法以纯化的c56及新鲜正常人血清（the normal human serum，NHS）作为C7～C9来源，体外组装sMAC建立HK-2亚溶破模型，通过流式细胞仪检测MAC刺激后的Ⅳ型胶原表达情况，荧光显微镜检测MAC的沉积。结果MAC刺激后的HK-2与对照组比较Ⅳ型胶原和合成增多（P〈0．05）。结论亚溶破剂量的MAC能使HKC的Ⅳ型胶原表达上调，可能是引起肾小管间质纤维化细胞外基质增多的原因之一。

关键词：补体膜攻击复合物小管间质纤维化 Ⅳ型胶原

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血小板膜补体复合物沉积及其异常活化的研究

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中华血液学杂志 2015年第6期36卷 515-519页

作者：孟银苹付蓉刘惠王一浩李丽娟刘春燕张田丁少雪李丽燕阮二宝瞿文王化泉王晓明王国锦刘鸿吴玉红宋嘉邢莉民关晶邵宗鸿天津医科大学总医院血液内科 300052

目的通过检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）伴或不伴再生障碍性贫血（AA）患者血小板膜补体复合物（C5b-9）、血小板活化分子（CD62p）表达及血清可溶性C5b-9（sC5b-9）水平探究PNH血栓形成的病理机制.方法用ELISA方法检测25例PNH/... 详细信息

目的通过检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）伴或不伴再生障碍性贫血（AA）患者血小板膜补体复合物（C5b-9）、血小板活化分子（CD62p）表达及血清可溶性C5b-9（sC5b-9）水平探究PNH血栓形成的病理机制.方法用ELISA方法检测25例PNH/PNH-AA患者血清sC5b-9、补体C3和C4水平,并以30名健康志愿者作为正常对照;采用流式细胞术检测PNH/PNH-AA患者与正常人血小板PNH克隆数（CD59-CD61＋/CD61＋）、血小板膜C5b-9沉积率（C5b-9＋CD61＋/CD61＋）以及血小板活化标志分子CD62p表达率（CD62p＋CD61＋/CD61＋）,并进行相关性分析.结果 ①PNH/PNH-AA组患者血清sC5b-9水平为390.27（265.73～676.87）μg/L,显著低于正常对照组的540.39（344.20～1 576.78）tg/L（P＜0.01）.②PNH/PNH-AA组患者血小板PNH克隆数[50.58（23.29～81.60）％]显著高于正常对照组[23.57（15.58～29.02）％]（P＜0.01）;PNH/PNH-AA组患者PNH克隆血小板膜C5b-9沉积率[（17.53±6.27）％]与患者正常血小板[（11.33±5.03）％]及正常对照组血小板[（10.88±3.58）％]相比均显著增高（P＜0.01）.③PNH/PNH-AA组患者PNH克隆血小板CD62p表达率[（61.98±11.71）％]与患者正常血小板[（43.76±11.30）％]及正常对照组血小板[（38.23±8.07）％]相比均显著升高（P＜0.01）;PNH/PNH-AA组患者正常血小板膜CD62p表达率比正常对照组血小板显著增高（P＜0.05）.④血小板膜C5b-9沉积率与CD62p表达率呈显著正相关（r=0.449,P=0.002）.结论 PNH/PNH-AA患者血小板锚连蛋白（CD59）缺失导致补体复合物C5b-9沉积于异常血小板膜并使其激活,这一过程可能参与PNH血栓的形成.

关键词：血红蛋白尿,阵发性补体膜攻击复合物血栓形成

膜攻击复合物C5b-9在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的表达

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中华临床医师杂志（电子版） 2014年第12期8卷 107-109页

作者：饶艳邓少剑何志恩柯剑娟王焱林陈永权广州市番禺区中医院麻醉科 511400 广州市中山大学中山眼科中心武汉大学中南医院麻醉科安徽省芜湖市皖南医学院附属弋矶山医院麻醉科

目的：探讨膜攻击复合物C5b-9在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的表达。方法健康雄性SD大鼠60只，180～200 g，随机分为5组（n＝12）：假手术组（S组）、全肝再灌组1 h组（I/R 1 h组）、3 h组（I/R 3 h组）、6 h组（I/R 6 h组）和24 h组（I/R... 详细信息

目的：探讨膜攻击复合物C5b-9在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的表达。方法健康雄性SD大鼠60只，180～200 g，随机分为5组（n＝12）：假手术组（S组）、全肝再灌组1 h组（I/R 1 h组）、3 h组（I/R 3 h组）、6 h组（I/R 6 h组）和24 h组（I/R 24 h组）。制备大鼠全肝缺血再灌注模型，再灌注1、3、6、24 h末，取血测定谷丙转氨酶（ALT）和总胆红素（TBIL）浓度。取肝脏组织，检测C5b-9 mRNA和C5b-9蛋白的表达。结果与对照组比较，I/R各组大鼠ALT和TBIL水平均明显升高，I/R 3 h组达到高峰（P＜0.05）；I/R各组C5b-9的mRNA表达和C5b-9蛋白含量均有显著升高，且随着缺血再灌注时间的延长而逐渐升高，其中I/R 24 h组最高（P＜0.05）。结论补体C5b-9参与肝缺血再灌注的损伤，尤其是在再灌注24 h时达到高峰。

关键词：肝再灌注损伤补体膜攻击复合物

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补体攻膜复合物与Heymann肾炎

国外医学（生理病理科学与临床分册） 2001年第1期21卷 57-59页

作者：李兆丽张东生邓红东南大学医学院病理教研室江苏南京210009

Heymann肾炎是研究人类膜性肾病的经典动物模型 ,补体攻膜复合物与Heymann肾炎的发病密切相关 ,在Heymann肾炎的发病中 ,插入肾小球上皮细胞膜的补体攻膜复合物可造成细胞的亚溶解性损伤 ,进而介导血栓素A2 、活性氧和转化生长因子 β... 详细信息

Heymann肾炎是研究人类膜性肾病的经典动物模型 ,补体攻膜复合物与Heymann肾炎的发病密切相关 ,在Heymann肾炎的发病中 ,插入肾小球上皮细胞膜的补体攻膜复合物可造成细胞的亚溶解性损伤 ,进而介导血栓素A2 、活性氧和转化生长因子 β等炎症介质的释放 ,通过不同的作用机制导致肾小球滤过屏障的损伤和蛋白尿的产生。

关键词： HEYMANN肾炎补体膜攻击复合物转化生长因子β

肌萎缩呈束周分布的青少年肌炎的临床与病理特点

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中华神经科杂志 2015年第9期48卷 776-780页

作者：刘智陈琳任海涛赵燕环中国医学科学院北京协和医院神经科 100730

目的研究肌肉活体组织检查（简称活检）出现束周萎缩的青少年肌炎患者的临床及肌肉病理特点.方法对21例肌肉活检病理以束周萎缩为病理特征的青少年肌炎患者的临床资料和病理改变进行回顾性分析.结果临床表现：21例中11例确诊为青少... 详细信息

目的研究肌肉活体组织检查（简称活检）出现束周萎缩的青少年肌炎患者的临床及肌肉病理特点.方法对21例肌肉活检病理以束周萎缩为病理特征的青少年肌炎患者的临床资料和病理改变进行回顾性分析.结果临床表现：21例中11例确诊为青少年皮肌炎（典型皮疹）,9例为可能的青少年皮肌炎（不典型皮疹）,1例为混合结缔组织病.21例中19例有肌肉无力表现.9例肌酸激酶正常,4例轻度升高（3倍以下）,8例明显升高（3倍以上）,其中11例确诊的皮肌炎患者中10例肌酶正常或轻微升高.6例患者合并肺间质病变,11例抗核抗体阳性.2例合并EB病毒感染,1例巨细胞病毒感染.肌肉病理：21例均可见束周萎缩,其中4例束周萎缩形态学不典型,但相应束周肌纤维还原型辅酶、乳酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶染色异常;12例免疫组织化学染色中9例显示膜补体攻击复合物染色阳性.比较分析发现肌酸激酶升高程度与肌纤维坏死相关,与束周萎缩无明显相关;膜补体攻击复合物沉积的标本中束周萎缩、局灶损伤及线粒体异常的病理改变更突出.结论肌肉萎缩呈束周分布现象主要见于典型或不典型皮肌炎,可能与免疫复合物沉积和小血管异常有关.

关键词：皮肌炎肌萎缩补体膜攻击复合物线粒体活组织检查