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PEP-1-SOD1融合蛋白转导入小鼠海马组织的能力及时间关系

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第四军医大学学报 2009年第13期30卷 1184-1187页

作者：董敏席刚明张正洪王家宁郧阳医学院附属人民医院神经内科湖北十堰442000 湖北中医学院湖北武汉430000 郧阳医学院附属人民医院临床研究所湖北十堰442000

目的:研究PEP-1介导铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD1)转导入小鼠海马组织的能力及时间关系.方法:健康雄性昆明小鼠随机分为SOD1组及PEP-1-SOD1组,分别经腹腔注射SOD1蛋白及PEP-1-SOD1融合蛋白200μg,于注射后1,2,4,8,24h等5个时间点分... 详细信息

目的:研究PEP-1介导铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD1)转导入小鼠海马组织的能力及时间关系.方法:健康雄性昆明小鼠随机分为SOD1组及PEP-1-SOD1组,分别经腹腔注射SOD1蛋白及PEP-1-SOD1融合蛋白200μg,于注射后1,2,4,8,24h等5个时间点分别取小鼠海马组织进行检测(n=5).Western Blot测定PEP-1-SOD1蛋白的表达;免疫荧光组织化学方法测定PEP-1-SOD1在海马组织的分布;黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性.结果:PEP-1-SOD1组注射后1h,小鼠海马组织在Mr约26×103处出现目的蛋白条带,4h达高峰,24h仍有蛋白转导;SOD1组未发现目的蛋白.免疫荧光检测发现PEP-1-SOD1组海马组织中出现特异性绿色荧光;SOD1组未发现绿色荧光.PEP-1-SOD1组酶活性于注射后1h升高至(61.7±2.9)×103U/g,4h达峰值(82.6±4.2)×103U/g,之后开始下降,24h仍明显高于SOD1处理组(P转导进入小鼠海马组织,4h达高峰,并保持活性至少达24h.

关键词： PEP-1肽铜锌-超氧化物歧化酶蛋白转导

重组Cre融合蛋白的表达及蛋白转导效率研究

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重组Cre融合蛋白的表达及蛋白转导效率研究

作者：田进海西北农林科技大学

学位级别：硕士

蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域（proteintransductiondomain,PTD）的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过... 详细信息

蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域（proteintransductiondomain,PTD）的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递。TAT蛋白转导域（TAT-PTD）是源自人类免疫缺陷病毒HIV1蛋白的一段碱性氨基酸多肽,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,在药物转运和疾病治疗等领域有着巨大的应用潜力。来源于噬菌体P1的Cre/loxP系统目前已被广泛用于原核、真核生物体内与体外DNA重组方面的研究，并且在基因功能的鉴定、特定基因的删除、染色体工程、基因捕获以及外源基因的整合等方面发挥着巨大功能。为了获得穿膜效率高的Cre融合蛋白，将Cre基因克隆至原核表达载体pET-28a（+），使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段和来源于SV40大T抗原的核定位信号NLS序列，插入到Cre重组酶编码区DNA的C-末端或者N-末端，组成不同构象的重组表达子。将其转化大肠杆菌BL21（DE3），进行IPTG诱导使得重组Cre融合蛋白表达，利用组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白，用包含Cre功能检测元件的293-C31-L2GFP细胞系，对纯化出的融合蛋白进行活性检测，观察各个融合蛋白的作用效果，并用流式细胞仪检测效率。结果表明: 1、以质粒pCAG-Cre-IP为模板，用PCR的方法扩增出Cre基因的开放阅读框序列。利用基因重组技术将目的基因克隆到pMD19-T载体上，转化感受态大肠杆菌（DH5α），测序正确后连接于原核表达载体pET-28a（+）多克隆位点，构建含有Cre、TAT及NLS序列的11个原核表达载体。 2、利用0.7mM IPTG在28℃条件下诱导7h，11个原核表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）进行原核诱导表达，用组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白并进行Western blot鉴定，最后得到高纯度的Cre融合蛋白。 3、细胞穿膜实验结果表明，在11个重组表达子中，His-NLS-TAT-Cre （HNTC）融合蛋白的穿膜效率最高，核定位效果理想，可作为哺乳动物染色体水平上基因操作的工具。

关键词： Cre/loxP系统 Cre穿膜蛋白蛋白转导原核表达

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蛋白转导在基因治疗中的应用

国际生物医学工程杂志 2006年第4期29卷 250-254页

作者：熊符张成于美娟中山大学干细胞与组织工程中心广州510080

蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细... 详细信息

蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递。PTD这种能携带融合蛋白自由进入细胞的独特功能为人类一些疾病的基因治疗提供了一种新的运载工具,在基因治疗中有着美妙的应用前景。

关键词：蛋白转导蛋白转导域基因治疗

蛋白转导技术在新生儿缺氧缺血性脑病中应用研究进展

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中华全科医学 2011年第10期9卷 1602-1604页

作者：陈辉唐久来徐家丽陈前芬吴德安徽医科大学儿科学教研室安徽省合肥市230000 蚌埠医学院儿科学教研室安徽省蚌埠市233000 蚌埠医学院病理生理学教研室安徽省蚌埠市233000

新生儿缺氧缺血性脑损伤是我国新生儿急性死亡和慢性神经系统后遗症的重要原因之一。目前新生儿缺氧缺血性脑药物治疗效果不佳,主要原因是药物无法通过血脑屏障。蛋白质转导结构域(prote in transduction domain,PTD)是指一类能携带其... 详细信息

新生儿缺氧缺血性脑损伤是我国新生儿急性死亡和慢性神经系统后遗症的重要原因之一。目前新生儿缺氧缺血性脑药物治疗效果不佳,主要原因是药物无法通过血脑屏障。蛋白质转导结构域(prote in transduction domain,PTD)是指一类能携带其他生物大分子(蛋白多肽、DNA、寡核苷酸等)穿过多种哺乳动物细胞并使其在细胞内积聚的小分子阳离子多肽。PTD能携带生物大分子物质透过血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB),这为我们研究、治疗中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)疾病提供了新的思路。本文就PTD的结构特征、转导过程、与物质连接方式、CNS疾病治疗现状等方面来阐述PTD在新生儿缺氧缺血性脑病中的应用前景。

关键词：蛋白转导 HIBD 血脑屏障

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蛋白转导技术在胰腺干细胞分化中的应用

国际外科学杂志 2009年第9期36卷 623-626页

作者：马杰房林同济大学附属第十人民医院普外科上海200072

蛋白转导是将具有生物学活性的目的片段与蛋白转导结构域相连接，然后导入细胞中并发挥其生物学效应的一项技术。蛋白转导结构域是一种小分子多肽，不仅具有穿透细胞膜的功能，同时也能够保持其融合蛋白的活性。蛋白转导技术是一项新兴... 详细信息

蛋白转导是将具有生物学活性的目的片段与蛋白转导结构域相连接，然后导入细胞中并发挥其生物学效应的一项技术。蛋白转导结构域是一种小分子多肽，不仅具有穿透细胞膜的功能，同时也能够保持其融合蛋白的活性。蛋白转导技术是一项新兴的生物学技术，自从这项技术发明以来，被广泛的应用到了细胞基因调控的各个方面。本文以Tal、Pdx-1、Beta2／NeuroD转导蛋白为例，综述蛋白转导技术在胰腺干细胞分化中的应用。

关键词：蛋白转导胰腺干细胞分化

新型蛋白转导域PTD4的细胞内转导及其组织分布

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生物技术通讯 2016年第5期27卷 607-613页

作者：史若诗姚万军唐哨群柯昌斌刘菊英武汉大学人民医院麻醉科湖北武汉430000 湖北医药学院第一临床学院麻醉系湖北十堰442000 十堰市太和医院麻醉科麻醉与疼痛研究所湖北十堰442000

目的:合成新型蛋白转导域PTD4,研究其细胞内穿膜效应及在体组织分布。方法:设计并采用固相合成法合成新型蛋白转导域PTD4,用FAM(羧基荧光素)进行标记,采用高效液相色谱仪(HPLC)和质谱仪测定其纯度与相对分子质量;采用荧光倒置显微镜和... 详细信息

目的:合成新型蛋白转导域PTD4,研究其细胞内穿膜效应及在体组织分布。方法:设计并采用固相合成法合成新型蛋白转导域PTD4,用FAM(羧基荧光素)进行标记,采用高效液相色谱仪(HPLC)和质谱仪测定其纯度与相对分子质量;采用荧光倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察其在细胞内的穿膜情况;采用裸鼠活体成像观察穿膜肽在体内的组织分布及代谢特性,并切片观察各组织器官的分布情况。结果:合成了新型蛋白转导域PTD4,纯度为95.76%,相对分子质量为1776.5;PTD4在体外的穿膜效应有时间与浓度依赖性,约24 h代谢完毕,且共聚焦显微镜细胞层扫证实穿膜肽进入胞内;尾静脉注射的PTD4在裸鼠体内可迅速分布于各组织器官,但组织分布不均一,且有时间与浓度依赖性,6 h后荧光强度下降了大半,且腹腔注射方法不如尾静脉注射的穿膜效率高。结论:采用Fmoc固相肽合成法可成功合成蛋白转导域PTD4;PTD4能高效穿透细胞膜,穿膜效应呈时间与浓度依赖性;PTD4在体内能迅速分布于各组织细胞。

关键词：蛋白转导细胞穿膜肽组织分布固相合成

Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应

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中国肿瘤生物治疗杂志 2006年第3期13卷 162-166页

作者：曹利民王炜煜赵晓蓉叶庆雷萍刘静代维朱荫昌司进沈关心华中科技大学同济医学院免疫学系武汉430030 华中科技大学同济医学院同济医院普外科武汉430030 江苏省寄生虫病防治研究所无锡214064

目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝... 详细信息

目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。

关键词： HIV-1 Tat HSV1-TK 蛋白转导肝癌基因治疗

TAT-NEP1-40融合蛋白的表达、纯化及蛋白转导功能的鉴定

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科学技术与工程 2006年第12期6卷 1602-1604页

作者：苟兴春金卫林李容鞠躬第四军医大学全军神经科学研究所西安710032 上海交通大学神经科学研究所上海200240

为大量获得高纯度具有蛋白转导功能并可以穿过血脑屏障的融合蛋白TAT-NEP1-40,将构建好的表达载体pTAT-NEP1-40转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达后。将融合蛋白进行纯化和复性,鉴定蛋白转导功能。带有重组质粒pTAT-NEP40的大肠杆菌经IPTG... 详细信息

为大量获得高纯度具有蛋白转导功能并可以穿过血脑屏障的融合蛋白TAT-NEP1-40,将构建好的表达载体pTAT-NEP1-40转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达后。将融合蛋白进行纯化和复性,鉴定蛋白转导功能。带有重组质粒pTAT-NEP40的大肠杆菌经IPTG诱导后,主要以包涵体形式表达,融合蛋白的分子量大小为14kD,其表达量占菌体总蛋白量的31.59%,纯化后目的蛋白纯度达95.6%,通过免疫组化染色显示融合蛋白可以穿过血脑屏障进入脑组织。上述结果表明利用pTAT-NEP1-40重组质粒,可以成功地表达TAT-NEP1-40;纯化后该蛋白具有穿过血脑屏障的功能,为NEP1-40功能的进一步研究提供了基础。

关键词： NEP1-40 蛋白转导包涵体 Nogo-66

人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导肽与人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白质3F/3G串联锌结合域的融合表达

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汕头大学医学院学报 2010年第2期23卷 84-88页

作者：王革非彭程张驰曾祥兴李康生汕头大学医学院微生物学与免疫学教研室广东省高校免疫病理学重点实验室广东汕头515041 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科湖北武汉430030

目的:分析载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白质3F和3G(APOBEC3F/3G)的蛋白基序,获得具有细胞转导潜力的抗病毒基序融合蛋白。方法:用MotifScan软件对APOBEC3F/3G进行生物信息学分析,找出APOBEC3F/3G中的锌结合域(ZBRs)。通过PCR及多... 详细信息

目的:分析载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白质3F和3G(APOBEC3F/3G)的蛋白基序,获得具有细胞转导潜力的抗病毒基序融合蛋白。方法:用MotifScan软件对APOBEC3F/3G进行生物信息学分析,找出APOBEC3F/3G中的锌结合域(ZBRs)。通过PCR及多步酶切克隆得到APOBEC3F/3G的3个串联ZBRs基因片段,并将其与人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白转导域基因克隆至原核表达载体(pET32a),转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。结果:酶切和测序鉴定,得到含有HIV-TAT和3个ZBRs基因的重组质粒;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析,融合蛋白在BL21(DE3)中获得表达,占菌体总蛋白的20%。结论:获得含HIV-TAT和3个ZBRs的融合表达重组蛋白,为进一步研究APOBEC3F/3G抗病毒机制,也为其在抗病毒治疗中的应用打下基础。

关键词：载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白质3F/3G 锌结合域蛋白转导