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细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究

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南方医科大学学报 2006年第10期26卷 1394-1399,1407页

作者：李海玉郭爱华刘志锋刘瑜刘靖华邓鹏李志杰刘亚伟姜勇南方医科大学病理生理教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带His标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-HE(pET14b-His-EGFP)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(CPP)、连接子、核定位信号(... 详细信息

目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带His标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-HE(pET14b-His-EGFP)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(CPP)、连接子、核定位信号(NLS)序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP);经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中,荧光显微镜下观察并进行Westernblot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果酶切、测序证实载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核,并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体,建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统,为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。

关键词：细胞穿透肽增强型绿色荧光蛋白核定位信号蛋白转导内化

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞

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中国医学科学院学报 2007年第1期29卷 93-97,I0011页

作者：董晓王家宁黄永章郭凌郧孔霞郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所湖北十堰442000

目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时... 详细信息

目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200μmol/L时对细胞仍无毒性。结论PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。

关键词：细胞穿透肽蛋白转导增强型绿色荧光蛋白人脐静脉内皮细胞缺血再灌注损伤

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人结直肠癌SW480细胞

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癌症 2007年第2期26卷 216-219页

作者：董晓王家宁黄永章郭凌郧孔霞郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所湖北十堰442000

背景与目的:细胞穿透肽是近年来发现的一类能介导大分子物质跨膜转导的小分子肽段,本实验研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人结直肠癌细胞SW480的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的... 详细信息

背景与目的:细胞穿透肽是近年来发现的一类能介导大分子物质跨膜转导的小分子肽段,本实验研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人结直肠癌细胞SW480的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白与体外培养的人结直肠癌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入SW480细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和SW480细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人结直肠癌细胞。

关键词：细胞穿透肽蛋白转导绿色荧光蛋白结直肠肿瘤 SW480细胞

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蛋白转导功能域在肿瘤疫苗领域的应用前景

第四军医大学学报 2004年第21期25卷 2014-2016页

作者：郭晓彤张积仁李立文第一军医大学珠江医院肿瘤中心广东广州510282 第四军医大学西京医院全军骨科研究所陕西西安710033

蛋白转导技术是近些年迅速发展起来的一种跨膜转运技术 .应用该技术可以将多种药物 ,包括化合物、多肽、核酸等 ,高效地转运到细胞内 ,其过程不依赖于能量和受体 ,而是由在生理pH条件下带正电荷的、富含碱性氨基酸残基的多肽序列即蛋白... 详细信息

蛋白转导技术是近些年迅速发展起来的一种跨膜转运技术 .应用该技术可以将多种药物 ,包括化合物、多肽、核酸等 ,高效地转运到细胞内 ,其过程不依赖于能量和受体 ,而是由在生理pH条件下带正电荷的、富含碱性氨基酸残基的多肽序列即蛋白转导功能域所介导 .目前蛋白转导技术已经不仅仅是一种可以提高药物进入细胞效率的药物转运技术 ,而且被广泛用做肿瘤基因治疗的辅助手段来增强对肿瘤组织的杀伤效率 .最近研究表明 ,HIV 1TAT ,HSV 1VP2 2和果蝇触角足同源蛋白等的蛋白转导功能域尚可引导与之融合表达或共价结合的抗原进入MHCI类分子依赖的抗原提呈途径 ,并显著提高抗原特异性CTL的产生水平 ,其作用机制涉及介导抗原在细胞内和细胞间播散、增强抗原表达水平、促进CTL表位的加工和释放并提高抗原表位向细胞表面的提呈等 .这些资料表明蛋白转导功能域可以显著提高肿瘤疫苗的免疫效能 ,激发机体产生高水平的抗原特异性CTL ,从而对肿瘤组织产生最大的免疫杀伤效应 .

关键词：蛋白转导肿瘤,疫苗应用前景

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HIV-1TAT蛋白转导肽的研究进展

中国生物工程杂志 2010年第10期30卷 66-73页

作者：吴永红张成岗军事医学科学院放射与辐射医学研究所蛋白质组学国家重点实验室北京100850

TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1,HIV-1)编码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽,属于蛋白转导域家族的一员。长期研究发现其全长及11个碱性氨基酸富集区的核心肽段(YGRKKRRQRRR)不仅能够在... 详细信息

TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1,HIV-1)编码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽,属于蛋白转导域家族的一员。长期研究发现其全长及11个碱性氨基酸富集区的核心肽段(YGRKKRRQRRR)不仅能够在包括蛋白质、多肽及核酸等多种外源生物大分子的跨膜转导过程中具有重要作用,而且能够携带这些外源生物大分子通过活体细胞的各种生物膜性结构(如细胞膜和血脑屏障等)并发挥生理功能,但其跨膜转导机制仍不明确。新近研究还发现TAT核心肽段在促进外源蛋白高效表达过程中也具有重要作用,能够显著增加外源蛋白高效、可溶性表达的水平,显示了TAT蛋白转导肽的新功能。以TAT蛋白转导肽跨膜转导作用的长期研究背景为基础,分别从TAT蛋白转导肽的结构特点、其跨膜转导作用的影响因素及其作用机制等方面进行了系统综述,进一步结合TAT蛋白转导肽的最新研究进展分别从药物研发、机制探索及新功能的开发等方面展望了后续研究方向与应用价值,不仅为深入阐述TAT蛋白转导肽的跨膜转导作用的功能意义提供了参考依据,而且为TAT蛋白转导肽在微生物工程及蛋白质工程等领域的潜在应用价值提供了重要参考信息。

关键词： TAT 蛋白转导肽碱性氨基酸蛋白转导外源蛋白表达

TAT蛋白转导结构域介导的BCR/ABL融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运

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第三军医大学学报 2002年第4期24卷 421-424页

作者：梁英民蒋珊珊孙强刘利刘强陈任安李巧娥韩骅第四军医大学唐都医院血液内科西安710038 第四军医大学基础医学部遗传与发育生物学教研室西安710033

目的　探讨HIV 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL(TATPTD BCR ABL)融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运和通过血脑屏障作用。方法　在大肠杆菌中表达PTD BCR ABL融合蛋白 ,经Ni NTA树脂亲合层析 ,纯化后的融合蛋白经... 详细信息

目的　探讨HIV 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL(TATPTD BCR ABL)融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运和通过血脑屏障作用。方法　在大肠杆菌中表达PTD BCR ABL融合蛋白 ,经Ni NTA树脂亲合层析 ,纯化后的融合蛋白经小鼠尾静脉注射体内 ,用免疫组织化学方法对小鼠组织细胞内的PTD BCR ABL融合蛋白进行检测。结果　①表达和纯化了分子量为 2 3× 10 3的PTD BCR ABL融合蛋白 ;②在接受融合蛋白的小鼠肝、脾、肾及心肌组织的细胞内检测到了PTD BCR ABL融合蛋白 ;③接受融合蛋白的小鼠脑组织细胞中可以检测到融合蛋白的存在。结论　PTD可在体内介导较大分子量的融合蛋白进入组织细胞和通过血脑屏障。

关键词：蛋白转导组织细胞血脑屏障 TAT蛋白 BCR/ABL融合蛋白跨膜转运

TAT蛋白转导域介导BCR/ABL融合蛋白通过小鼠血脑屏障的作用

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第3期18卷 244-247页

作者：梁英民蒋姗姗韩骅孙强刘利郝淼旺邓中荣陈任安刘强第四军医大学唐都医院血液科陕西西安710038 第四军医大学基础部遗传与发育生物学教研室

目的　探讨HIV - 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR/ABL(TATPTD -BCR/ABL)融合蛋白通过血脑屏障的作用。方法　在大肠杆菌中表达PTD -BCR/ABL融合蛋白。将经Ni-NTA树脂亲和层析纯化的融合蛋白 ,经尾静脉注射小鼠体... 详细信息

目的　探讨HIV - 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR/ABL(TATPTD -BCR/ABL)融合蛋白通过血脑屏障的作用。方法　在大肠杆菌中表达PTD -BCR/ABL融合蛋白。将经Ni-NTA树脂亲和层析纯化的融合蛋白 ,经尾静脉注射小鼠体内 ,用免疫组织化学染色法 ,对小鼠脑组织细胞内的PTD -BCR/ABL融合蛋白进行检测。结果　①表达和纯化了相对分子质量 (Mr)为 2 3× 10 3 的PTD -BCR/ABL融合蛋白 ;②将其经静脉注射到小鼠体内 ,在小鼠脑组织细胞中可检测到PTD -BCR/ABL融合蛋白。结论　PTD可在体内介导较大Mr的融合蛋白通过血脑屏障。

关键词：蛋白转导融合蛋白血脑屏障小鼠