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人野生型S100A10原核表达载体的构建、蛋白表达纯化及鉴定

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中国实验诊断学 2019年第3期23卷 535-537页

作者：王德利尹显贵杨华李赫吉林大学生命科学学院吉林长春130012 中国人民解放军联勤保障部队第964医院吉林长春130062 吉林大学口腔医学院吉林长春130021

S100A10又被称为p11,属于S100家族成员,是一种钙离子结合蛋白,在细胞内外发挥多种功能与膜联蛋白A2(ANXA2)形成异源四聚体AIIt中被发现。在生理状态下AIIt定位在细胞的内膜及外膜上,其中外膜上的AIIt为纤溶酶原(plasminogen)和组织纤溶... 详细信息

S100A10又被称为p11,属于S100家族成员,是一种钙离子结合蛋白,在细胞内外发挥多种功能与膜联蛋白A2(ANXA2)形成异源四聚体AIIt中被发现。在生理状态下AIIt定位在细胞的内膜及外膜上,其中外膜上的AIIt为纤溶酶原(plasminogen)和组织纤溶酶原激活剂(tPA)提供锚定位点,是调控肿瘤细胞迁移与转移的关键蛋白复合体,被认为是肿瘤治疗的一个潜在靶点。

关键词：原核表达载体蛋白表达纯化人野生型组织纤溶酶原激活剂肿瘤细胞迁移钙离子结合蛋白鉴定蛋白复合体

辣椒疫霉病无毒基因RXLR128001克隆与蛋白表达纯化

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山东农业大学学报（自然科学版） 2016年第1期47卷 25-29页

作者：王晓梅张钟文杨楠吉林农业大学农学院吉林长春130118

本文从强致病辣椒疫霉菌SD33分离克隆了1个效应分子RXLR128001基因,利用生物信息学软件BLAST and Signal P4.1 Server,分析了该效应分子的基因序列结构。在此基础上进行了该基因大肠杆菌(Escherichia coli)表达与纯化,界定了适宜该基因... 详细信息

本文从强致病辣椒疫霉菌SD33分离克隆了1个效应分子RXLR128001基因,利用生物信息学软件BLAST and Signal P4.1 Server,分析了该效应分子的基因序列结构。在此基础上进行了该基因大肠杆菌(Escherichia coli)表达与纯化,界定了适宜该基因高效表达的诱导条件,经过亲和层析和离子交换层析,获得了RXLR128001基因较高纯度的蛋白,以利于后续晶体的培养与优化研究。

关键词：辣椒疫霉效应蛋白基因克隆蛋白表达纯化

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丹参茉莉酸甲基转移酶蛋白表达和纯化的研究

药学学报 2016年第10期51卷 1643-1650页

作者：姚娜郑汉荆礼马利刚申业陈敏中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室培育基地北京100700 安徽中医药大学药学院安徽合肥230038 河南中医学院河南郑州450016

茉莉酸甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)是茉莉酸生物合成途径中的关键酶,能够催化茉莉酸甲基化形成茉莉酸甲酯。本研究将丹参茉莉酸甲基转移酶基因(SmJMT1)c DNA构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌B... 详细信息

茉莉酸甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)是茉莉酸生物合成途径中的关键酶,能够催化茉莉酸甲基化形成茉莉酸甲酯。本研究将丹参茉莉酸甲基转移酶基因(SmJMT1)c DNA构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约66 kDa,与预测的蛋白分子质量相同;同时对影响蛋白表达的4个因素:诱导时间、诱导温度、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导前菌液的浓度进行优化,结果表明当诱导前菌液的A600在0.8左右时,加入0.4 mmol·L^(-1)IPTG,20℃诱导培养8 h后SmJMT1蛋白的表达量较高。蛋白质印迹检测显示,anti-GST抗体可以特异性地识别SmJMT1蛋白,证实丹参SmJMT1蛋白在大肠杆菌中表达成功;Q-TOF检测数据检索分析表明,SmJMT1蛋白属于甲基转移酶亚家族。丹参中茉莉酸甲基转移酶SmJMT1的成功表达和纯化对研究茉莉酸生物合成途径及茉莉酸对药用植物次生代谢调控奠定了一定基础。

关键词：丹参茉莉酸甲基转移酶蛋白表达纯化蛋白质印迹 Q-TOF

GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

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上海交通大学学报（医学版） 2012年第5期32卷 580-584页

作者：张珍珍尹延青周嘉伟乐卫东上海交通大学医学院附属瑞金医院神经科上海200025 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所上海200031

目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回... 详细信息

目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用。结果酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMP1融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMP1融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用。结论获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用。

关键词： p43/AIMP1 蛋白表达纯化 GST pull-down 神经中间丝轻链蛋白

人源γ-分泌酶的重要亚基nicastrin蛋白表达与纯化

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基因组学与应用生物学 2015年第5期34卷 909-916页

作者：齐佩瑾吴更微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

γ-分泌酶是具有天冬氨酸内切酶活性跨膜蛋白复合物,与阿尔茨海默症的病理特征的β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)生成有关。Nicastrin(NCT)是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白,具有709个氨基酸。它是γ-分泌酶的重要组分,具有募集和结合γ-分... 详细信息

γ-分泌酶是具有天冬氨酸内切酶活性跨膜蛋白复合物,与阿尔茨海默症的病理特征的β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)生成有关。Nicastrin(NCT)是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白,具有709个氨基酸。它是γ-分泌酶的重要组分,具有募集和结合γ-分泌酶底物的功能,参与γ-分泌酶的组装过程。本研究中,利用昆虫杆状病毒表达系统表达人源NCT全长和胞外结构域,得到了纯度较好的蛋白,用于晶体初筛。由于nicastrin自身高度糖基化,使用Endo H和PNGase F去糖基化酶进行体外脱糖基作用,使得蛋白均一度提高,纯化到较稳定的胞外结构域蛋白,为下一步对人源nicastrin蛋白进行结构生物学研究奠定了基础。

关键词： γ-分泌酶 Nicastrin 蛋白表达纯化去糖基化

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药物靶标G蛋白偶联受体的蛋白表达与纯化

药物靶标G蛋白偶联受体的蛋白表达与纯化

作者：杨小丽浙江大学

学位级别：硕士

G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor,GPCR)是人体内重要的细胞表面受体膜蛋白,参与了众多生理和病理功能,是最大的一类药物靶标蛋白。解析GPCR与小分子药物的复合物蛋白三维结构将有助于靶向GPCR的药物发现。但是GPCR作为一类膜... 详细信息

G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor,GPCR)是人体内重要的细胞表面受体膜蛋白,参与了众多生理和病理功能,是最大的一类药物靶标蛋白。解析GPCR与小分子药物的复合物蛋白三维结构将有助于靶向GPCR的药物发现。但是GPCR作为一类膜蛋白,体外表达量低、稳定性差、很难解析结构,因此需要对GPCR进行大量的表达和纯化筛选,以获得表达量高、纯度高、均一性好、热稳定性好的GPCR蛋白,为GPCR蛋白结构解析奠定重要的基础。组胺(Histamine)是人体内重要的活性物质,通过四种组胺GPCR亚型(HR、HR、HR、HR)来介导不同的生理和病理反应。其中,HR主要表达于胃部,与胃酸分泌相关。缓激肽是激肽释放酶-激肽系统的重要组成部分,包含两种缓激肽GPCR亚型(B1R和B2R)。B1R在肿瘤组织细胞中大量表达,B1R拮抗剂有治疗肿瘤的潜力。但是,组胺受体HR和缓激肽受体B1R的蛋白结构还没有被解析,限制了靶向这些GPCR的药物发现。本课题的研究目的是通过对组胺受体HR和缓激肽受体B1R进行蛋白表达和纯化,用于蛋白三维结构解析,从而阐明这些重要的GPCR药物靶标的蛋白结构,揭示药物作用于这些GPCR的分子机制,为靶向这些GPCR的药物发现提供重要的科学依据。本课题通过一系列GPCR蛋白表达与纯化,包括对蛋白进行N/C末端截断筛选、融合蛋白类型及融合位点筛选、定点突变筛选,对蛋白表达和纯化条件进行筛选,成功获得了表达量较高、纯度较高、均一性较好、热稳定性较好的组胺受体HR和缓激肽受体B1R的蛋白,为接下来的GPCR蛋白结构解析奠定了重要的基础。

关键词： G蛋白偶联受体药物靶标蛋白表达纯化组胺受体缓激肽受体

EML3与H3K4M融合蛋白表达质粒的构建及蛋白的表达与纯化

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中国科技论文在线精品论文 2024年第1期17卷 79-90页

作者：王卓文刘艳丽苏州大学药学院江苏苏州215000

目的:研究获得N端/C端融合组蛋白H3K4M小肽的EML3融合蛋白的方法。方法:将组蛋白H3(aa1~15)小肽编码区融合进表达EML3 Agenet结构域重组质粒中,得到N端/C端融合表达H3K4M的质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经扩大培养,加入IPTG后在15... 详细信息

目的:研究获得N端/C端融合组蛋白H3K4M小肽的EML3融合蛋白的方法。方法:将组蛋白H3(aa1~15)小肽编码区融合进表达EML3 Agenet结构域重组质粒中,得到N端/C端融合表达H3K4M的质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经扩大培养,加入IPTG后在15℃条件下诱导6×His标签EML3融合蛋白的表达。经镍柱亲和层析及凝胶过滤层析进行纯化后,通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度。结果:通过质粒单点突变、质粒酶切、PCR克隆以及同源重组连接,成功构建EML3 N/C端融合组蛋白H3K4M的重组质粒,测序证实序列正确,而且重组质粒可在大肠杆菌中成功诱导融合蛋白的表达。其中EML3C端融合组蛋白H3K4M可通过凝血酶酶切从而得到游离的H3K4M小肽以及EML3 Agenet结构域蛋白。结论:成功构建EML3融合组蛋白H3K4M重组质粒,并诱导表达及纯化得到高纯度的EML3融合蛋白。

关键词：微生物药物学组蛋白H3K4M小肽 EML3 Agenet结构域融合蛋白质粒构建蛋白表达纯化

组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达纯化及酶活力分析

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复旦学报（医学版） 2012年第4期39卷 342-347页

作者：郭雪刘意杨慧蓉徐彦辉复旦大学生物医学研究院结构生物学实验室上海200032 复旦大学生命科学学院结构生物学实验室上海200433

目的筛选能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的组蛋白去甲基化酶JARID1B(jumonji AT-richinteractive domain 1B)的截短体。方法通过Bac-to-Bac系统制备含目的基因的杆粒(bacmid),转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒基因组,并感染Hi5昆虫细... 详细信息

目的筛选能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的组蛋白去甲基化酶JARID1B(jumonji AT-richinteractive domain 1B)的截短体。方法通过Bac-to-Bac系统制备含目的基因的杆粒(bacmid),转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒基因组,并感染Hi5昆虫细胞表达目的蛋白,用Ni-NTA亲和层析,离子交换层析和分子筛纯化目的蛋白。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time offlight mass spectrometer,MALDI-TOF)分析截短体的酶活力。结果去除C-端两个PHD结构域的截短体JARID1B1-825能够在昆虫细胞Hi5中得以大量表达(1L细胞含10mg蛋白),经Ni-NTA亲和层析,阴离子交换层析和分子筛三步纯化,获得纯度大于90%的目的蛋白,MALDI-TOF质谱分析显示JARID1B1-825仍拥有去组蛋白甲基化修饰的酶活性。结论筛选到了能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的JARID1B的截短体,对其后续的功能研究和药物开发具有重要的意义。

关键词：组蛋白去甲基化酶 JARID1B 昆虫细胞表达系统蛋白表达纯化

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

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基础医学与临床 2008年第11期28卷 1192-1196页

作者：龚燕华王旭吴旭东强伯勤彭小忠袁建刚中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得... 详细信息

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究。

关键词：多梳蛋白神经系统多梳蛋白1 蛋白表达纯化多克隆抗体