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藻酸盐凝胶三维培养条件下体外定向诱导骨髓间充质干细胞成软骨

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第21期13卷 4041-4044页

作者：朱丽明崔颖辽宁医学院辽宁省锦州市121001 辽宁医学院附属第一医院耳鼻喉科辽宁省锦州市121001

背景:目前有关诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究不少,但选用何种生长因子调节以及如何保证其持续高效刺激尚处于探索阶段。目的:实验以软骨源性形态发生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein1,CDMP1)和转化生长因子... 详细信息

背景:目前有关诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究不少,但选用何种生长因子调节以及如何保证其持续高效刺激尚处于探索阶段。目的:实验以软骨源性形态发生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein1,CDMP1)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)作为主要诱导因子,通过三维培养微环境诱导,观察独立及联合应用时,促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的能力。设计、时间及地点:体外观察实验,于2007-04/2008-04在辽宁医学院附属医院耳鼻喉实验室完成。材料:选择辽宁医学院附属第一医院自然流产或咪嗦流产的12～20周胚胎,胚胎的使用经孕妇同意。实验经医院医学伦理委员会批准。方法:无菌条件下取出胚胎股骨,用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化人胚骨髓间充质干细胞,体外培养传代。采用特定的诱导培养液使骨髓间充质干细胞向软骨分化,按培养基内添加生长因子的不同分成4组:①联合诱导组:无血清的软骨诱导液+CDMP1(300μg/L)+TGF-β1(10μg/L)。②TGF-β1诱导组:无血清的软骨诱导液+TGF-β1(10μg/L)。③CDMP1诱导组:无血清的软骨诱导液+CDMP1(300μg/L)。④对照组:无血清的软骨诱导液。先进行单层细胞培养10d,再置于藻酸盐凝胶中继续培养11d。主要观察指标:①于培养21d后倒置显微镜观察细胞在凝胶球中的生长和增殖情况。②二甲基亚甲基蓝比色法测定各组标本的铵聚糖含量。③免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达。结果:第21天后,倒置显微镜观察藻酸盐凝胶呈现透明胶冻状,有黏性。加入不同生长因子的藻酸盐凝胶,细胞呈散在分布于凝胶介质中,呈现"悬浮"状态。第21天时联合诱导组铵聚糖含量、Ⅱ型胶原表达阳性率高于其他3组,差异有显著性意义(P<0.05);TGF-β1诱导组、CDMP1诱导组铵聚糖含量、Ⅱ型胶原表达阳性率高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞在三维培养条件下,TGF-β1和CDMP1联合作用促进骨髓间充质干细胞成软骨的作用明显。

关键词：藻酸盐凝胶骨髓间充质干细胞生长因子细胞诱导

藻酸盐凝胶对糖尿病大鼠创面组织中组织蛋白酶S表达影响的研究

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中国糖尿病杂志 2020年第11期28卷 861-865页

作者：唐颖赵晓彤陈明卫荚泽国李雪婷罗莉章诗琪方朝晖安徽医科大学第一附属医院内分泌科合肥230032 安徽省中医药科学院中医药糖尿病防治研究所

目的探讨藻酸盐凝胶对DM大鼠创面组织中组织蛋白酶S(Cat S)表达影响及Cat S在藻酸盐凝胶促进DM大鼠创面愈合过程中的作用。方法建立DM大鼠皮肤缺损模型,将大鼠分为正常对照(Con)组、模型组(Mod)和藻酸盐组(Alg),每组各12只。Con组伤口... 详细信息

目的探讨藻酸盐凝胶对DM大鼠创面组织中组织蛋白酶S(Cat S)表达影响及Cat S在藻酸盐凝胶促进DM大鼠创面愈合过程中的作用。方法建立DM大鼠皮肤缺损模型,将大鼠分为正常对照(Con)组、模型组(Mod)和藻酸盐组(Alg),每组各12只。Con组伤口涂抹生理盐水,Mod组伤口涂抹生理盐水,Alg组伤口涂抹藻酸盐凝胶。观察3组创面愈合情况,RT⁃PCR和和Western blot检测创面愈合过程中Cat S mRNA及Cat S蛋白表达水平。结果与Con组比较,Mod、Alg组2、4、6 d时创面面积较大,创面愈合率较低(P藻酸盐凝胶可降低DM大鼠创面组织中Cat S表达,促进创面愈合。

关键词：藻酸盐凝胶糖尿病创面大鼠组织蛋白酶S

骨髓基质细胞/藻酸盐凝胶复合修复骨缺损的研究

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中华实验外科杂志 2003年第11期20卷 1031-1032,F003页

作者：李光辉夏仁云陈超华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

目的　探讨骨髓基质细胞 (BMSCS)复合藻酸盐凝胶修复骨缺损的效果。方法　将体外培养的骨髓基质细胞与藻酸盐凝胶复合 ,实验组、对照组和空白组分别经皮注射BMSCS/藻酸盐凝胶复合物、BMSCS悬液和生理盐水 ,比较 3者修复骨缺损的疗效。... 详细信息

目的　探讨骨髓基质细胞 (BMSCS)复合藻酸盐凝胶修复骨缺损的效果。方法　将体外培养的骨髓基质细胞与藻酸盐凝胶复合 ,实验组、对照组和空白组分别经皮注射BMSCS/藻酸盐凝胶复合物、BMSCS悬液和生理盐水 ,比较 3者修复骨缺损的疗效。结果　实验组术后 12周时全部骨愈合 ,对照组有 2例未愈合 ,空白组无 1例愈合。结论　BMSCS/藻酸盐凝胶复合物有明显促进骨缺损修复的作用。

关键词：骨髓基质细胞藻酸盐凝胶修复骨缺损复合物动物模型

耻骨联合软骨细胞与藻酸盐凝胶复合物体内培养研究

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中国美容整形外科杂志 2013年第8期24卷 502-504页

作者：葛成邹敬才于开涛孙海燕李齐宏张志光中国人民解放军第三0七医院口腔科北京100017 中山大学光华口腔医学院附属口腔医院

目的观察耻骨联合软骨细胞与藻酸盐凝胶支架复合物体内异位培养的情况.方法从SD大鼠耻骨联合组织分离细胞体外培养后,按5×10^7/ml细胞密度与1.2%（w/v）低黏度海藻酸钠溶液混合,制备细胞凝胶复合物;再将细胞凝胶复合物植入裸鼠皮下,... 详细信息

目的观察耻骨联合软骨细胞与藻酸盐凝胶支架复合物体内异位培养的情况.方法从SD大鼠耻骨联合组织分离细胞体外培养后,按5×10^7/ml细胞密度与1.2%（w/v）低黏度海藻酸钠溶液混合,制备细胞凝胶复合物;再将细胞凝胶复合物植入裸鼠皮下,6周和12周后取材;通过HE、阿尔新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色,观察体内异位形成软骨的情况.结果耻骨联合软骨细胞分散悬浮在凝胶支架中.6周和12周的裸鼠皮下标本见复合物中有新生的岛样组织出现,12周标本岛样组织明显增多,阿尔新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色显示岛样组织基质阳性显色.结论耻骨联合软骨细胞与藻酸盐凝胶支架复合后,在体外仍然保持细胞活性,并且在裸鼠体内具有一定的异位软骨形成的能力.

关键词：耻骨联合软骨细胞藻酸盐凝胶体内软骨形成

含锶交联藻酸钠凝胶对前成骨细胞黏附和增殖的影响

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上海口腔医学 2019年第2期28卷 123-127页

作者：张漫李昊徐婷刘杰谈飞青岛大学附属医院口腔修复科山东青岛266003 青岛大学附属医院医保审核科山东青岛266003

目的 :利用SrCl2作为交联剂,合成含锶交联新型藻酸凝胶,检测含锶藻酸凝胶的理化性质,并观察细胞于凝胶中的黏附、增殖情况。方法:按钙离子和锶离子比例,分别制备5组终浓度为4 g/L的电解液,分别与藻酸钠溶液交联。检测各组凝胶的压缩模... 详细信息

目的 :利用SrCl2作为交联剂,合成含锶交联新型藻酸凝胶,检测含锶藻酸凝胶的理化性质,并观察细胞于凝胶中的黏附、增殖情况。方法:按钙离子和锶离子比例,分别制备5组终浓度为4 g/L的电解液,分别与藻酸钠溶液交联。检测各组凝胶的压缩模量、溶胀率及锶离子析出浓度。将种子细胞MC3T3-E1接种于凝胶表面后,观察并行FDA/PI细胞染色。采用GraphPad Prism 6.0软件包对数据进行统计学分析。结果:藻酸盐凝胶在双蒸水及PBS中,溶胀率随Sr2+浓度增高而增大;压缩模量检测发现,C组凝胶强度显著高于其他各组。ICP显示,各组溶液的锶离子浓度逐渐降低。扫描电镜观察发现,凝胶孔隙随Sr2+浓度增加而增大。显微镜及FDA/PI染色均发现,种子细胞在C组凝胶表面的增殖明显改善。结论:当钙离子和锶离子等比例混合时,藻酸盐凝胶的细胞黏附和增殖性能明显改善,可作为一种新型可注射骨组织工程支架。

关键词：藻酸盐凝胶锶细胞黏附细胞增殖组织工程

二维及三维培养对人舌鳞状细胞癌TCA8113细胞株生物学特性的影响

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口腔医学研究 2018年第10期34卷 1122-1126页

作者：周艳萌朗春媚申航胡芳媛胡铭邓文博遵义医学院微生物学与免疫学实验室贵州遵义563000 遵义医学院医学与科技学院 2008级贵州遵义563000 遵义医学院 2014级贵州遵义563000

目的:比较二维及三维方式培养的人舌鳞状细胞癌(简称鳞癌)TCA8113细胞株对细胞的增殖、组织形态及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性的影响,为体外舌鳞癌的研究提供培养方法。方法:倒置显微镜和苏木精-伊红(hematoxylin and eo... 详细信息

目的:比较二维及三维方式培养的人舌鳞状细胞癌(简称鳞癌)TCA8113细胞株对细胞的增殖、组织形态及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性的影响,为体外舌鳞癌的研究提供培养方法。方法:倒置显微镜和苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察二维及三维培养的人舌鳞癌TCA8113细胞的形态;噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察两种培养体系中细胞的增殖;酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测两种培养体系中LDH活性的改变。结果:倒置显微镜和HE染色观察到三维培养体系中TCA8113细胞成团生长;与二维培养体系比较,三维培养体系中细胞较长时间保持良好的增殖状态,LDH的活性较二维培养的细胞活性显著增高。结论:TCA8113细胞藻酸盐凝胶三维培养体系较二维培养体系能更好地体现细胞的生物学特性。

关键词：舌鳞状细胞癌培养技术藻酸盐凝胶乳酸脱氢酶

小鼠骨髓基质细胞复合藻酸盐异位成骨与成软骨能力研究

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小鼠骨髓基质细胞复合藻酸盐异位成骨与成软骨能力研究

作者：蔡潇潇四川大学

学位级别：硕士

在临床医学中，因创伤、感染、肿瘤术后及先天缺陷导致组织缺损的修复重建，一直是困扰各专业医生的棘手问题。在口腔种植学领域，由于长期缺牙导致多数患者术区缺乏足够的骨量，需要术前植骨。当前临床上使用的自体骨、异体骨移植，以... 详细信息

在临床医学中，因创伤、感染、肿瘤术后及先天缺陷导致组织缺损的修复重建，一直是困扰各专业医生的棘手问题。在口腔种植学领域，由于长期缺牙导致多数患者术区缺乏足够的骨量，需要术前植骨。当前临床上使用的自体骨、异体骨移植，以及其它各种组织修复与重建方法虽然各有优缺点。组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，对病损组织结构、功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴科学。种子细胞是组织工程的首要因素，骨髓基质干细胞是近年来研究最热门的种子细胞，被认为是最有可能用于临床的种子细胞之一。本实验通过分离BALB／C小鼠骨髓基质细胞，经过原代培养和定向诱导后将其复合藻酸盐支架材料后植入体内观察异位成骨、成软骨能力。实验采取贴壁法获得骨髓基质细胞，并诱导培养其成骨、成软骨表型，观察细胞形态变化并进行免疫细胞化学、组织学染色以及分子生物学鉴定;再复合藻酸盐凝胶，扫描电镜观察细胞与支架材料粘附情况;最后将细胞—支架复合体植入裸鼠皮下，于植入后4、8周取材，HE染色、免疫组织化学染色、RT-PCR检测异位形成的骨、软骨组织。研究结果显示：骨髓基质细胞经过成骨和成软骨诱导后可以表达明显的成骨和成软骨表型，扫描电镜结果显示细胞在藻酸盐支架内良好的贴附和增殖。体内动物试验证实，经过成软骨诱导的BMSCs复合藻酸盐后可以形成Col-Ⅱ免疫组织化学染色阳性的软骨样组织;经过成骨诱导的BMSCs复合藻酸盐支架后可以形成OCN免疫组化染色阳性，类似骨小梁的结构的骨样组织。而RT-PCR结果也证实异位软骨、骨组织可以表达出软骨、骨的特异性基因。综上所述，经过成骨或成软骨诱导BMSCs复合藻酸盐凝胶可以形成异位骨、软骨组织，将成为骨软骨组织缺损修复的有效途经。

关键词：骨髓基质细胞藻酸盐凝胶骨组织工程软骨组织工程

含镁微球-凝胶复合体对MC3T3-E1细胞黏附和增殖的影响

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含镁微球-凝胶复合体对MC3T3-E1细胞黏附和增殖的影响

作者：王丽喆青岛大学

学位级别：硕士

研究目的:将载有镁的乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)微球添加到藻酸盐凝胶中,制成新型微球-凝胶复合体,检测其部分理化性质,并观察MC3T3-E1细胞在其表面的黏附、增殖情况。研究方法:使用乳化法制备PLGA微球,... 详细信息

研究目的:将载有镁的乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)微球添加到藻酸盐凝胶中,制成新型微球-凝胶复合体,检测其部分理化性质,并观察MC3T3-E1细胞在其表面的黏附、增殖情况。研究方法:使用乳化法制备PLGA微球,将MgCO和MgO按1:1的比例载入到PLGA微球中,制备平均密度分别为1×10kg/m、3×10kg/m、5×10kg/m、7×10kg/m的B、C、D、E组Ca-微球悬浊液作为实验组(其中Ca作为凝胶交联剂),另外制备单纯的Ca溶液作为对照组A组,每组Ca浓度均为5g/L,将A、B、C、D、E组液体分别与等量的藻酸盐溶液混合,制出特定大小的水凝胶。使用扫描电镜(SEM)观察各组凝胶的内部结构形貌;将各组水凝胶浸泡在溶菌酶溶液中,分别于浸泡后的第1、3、5、7、14、21天时将凝胶样本取出,经冻干后称重,计算降解率;将各组水凝胶样本浸泡于双蒸水及磷酸盐缓冲液(PBS)中,1d后将其取出,经冻干后称重,分别计算各组样本的溶胀率;将载镁微球浸泡于不含血清的细胞培养基中,通过电感耦合等离子体光感仪器(ICP)检测浸泡后1、3、5、7、14、21天时的Mg析出浓度,使用同样的方法检测各组水凝胶的Mg析出浓度。MC3T3-E1细胞接种于凝胶表面,在接种后2h、6h、18h时,分别计算各组的细胞黏附率,并使用SEM观察各组细胞的黏附形态;在细胞培养后的1、3、5天分别使用AM/PI染色法观察每组接种在凝胶表面的活/死细胞数量,并用CCK-8法测定细胞的增殖活性。采用Graph Pad Prism 8.0.2软件包对数据进行统计学分析。研究结果:SEM观察发现随着微球量的增加,新型微球-凝胶复合体内部结构展现出更加致密的结构;随着时间的推移,该微球-凝胶复合体的降解率与对照组相比明显减缓;各实验组凝胶的溶胀率与对照组相比明显增大(P凝胶中Mg的析出浓度较为均匀稳定,改善了单纯载镁微球浸泡液Mg突释的现象;细胞实验结果表明,与对照组相比,实验组凝胶表面细胞的黏附、增殖行为被明显促进,其中C组细胞黏附效果最佳,而D组细胞增殖效果最佳。结论:新型微球-凝胶复合体能够促进细胞黏附、增殖行为,同时可通过改变载镁微球的含量来调整凝胶致密性、降解速率、离子析出速率等理化性能,为可注射骨组织支架的制备和应用提供了新的思路。

关键词：藻酸盐凝胶镁 PLGA微球细胞黏附骨组织工程

含锶交联藻酸钠凝胶对前成骨细胞黏附和增殖的影响

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含锶交联藻酸钠凝胶对前成骨细胞黏附和增殖的影响

作者：张漫青岛大学

学位级别：硕士

目的:利用氯化锶作为交联剂合成含锶交联新型藻酸凝胶,检测含锶藻酸凝胶的理化性质,并检测小鼠MC3T3-E1细胞于含锶交联藻酸凝胶中的黏附、增殖情况;提出利用氯化锶作为交联剂改善凝胶生物性能,为藻酸盐可注射组织工程支架提供理论依据... 详细信息

目的:利用氯化锶作为交联剂合成含锶交联新型藻酸凝胶,检测含锶藻酸凝胶的理化性质,并检测小鼠MC3T3-E1细胞于含锶交联藻酸凝胶中的黏附、增殖情况;提出利用氯化锶作为交联剂改善凝胶生物性能,为藻酸盐可注射组织工程支架提供理论依据。方法:用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒分析海藻酸盐溶液的细胞毒性,按钙离子和锶离子质量比例分别为A(4:0)B(3:1)C(2:2)D(1:3)E(0:4)制备5组终浓度均为4 g/L的电解液(其中A组为对照组),配置终浓度为2%wt的藻酸钠溶液,pH调至7.4,将5组复合前体溶液,高温高压灭菌,并与等量海藻酸钠混合,通过特定方法分别制备出5组直径为1 cm的凝胶圆盘。检测各组凝胶在双蒸水和磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的溶胀率,检测凝胶的压缩模量,用扫描电镜(SEM)观察各组凝胶的微观结构,并在第1、2、3天收集浸出液,通过电感耦合等离子体光谱仪(ICP)检测溶液中锶离子的析出浓度。取小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞株为种子细胞,接种于各组凝胶表面,接种1天后行超高分辨扫描电镜观察细胞黏附形态,于接种第1、2、3天的同一时段,分别采用二乙酸荧光素/典化丙啶(FDA及PI)染色,观察细胞在凝胶表面的增殖活性,行活死细胞计数,计算细胞存活率。实验采用GraphPad Prism 6.0软件包对数据进行统计学分析。结果:细胞毒性检测结果表明,本实验所使用的海藻酸钠粉末生物相容性良好,可用作后续的实验研究。藻酸盐凝胶在双蒸水及磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的溶胀率随锶离子浓度增高而增大,与对照组相比均有统计学意义(P凝胶的孔隙逐渐增大,C组凝胶孔隙均匀且均一,D和E组显示凝胶纤维网络松散,孔隙较不均匀;压缩模量结果显示随着锶离子浓度提高,C组凝胶强度最大,随着锶离子浓度的继续增加,凝胶强度呈现下降趋势,但均高于对照组凝胶的强度;ICP结果显示,各组溶液的锶离子浓度逐渐降低,释放到溶液中的锶离子的量下降并且与最初引入凝胶中的总锶离子成正比;可以看出A、B、C组伸展数量较多,其中,C组黏附情况较为良好,数量最多;显微镜及FDA/PI染色均发现种子细胞在C组凝胶表面的增殖具有明显的改善;细胞接种第3天,各组细胞活、死、及存活率结果显示,C组存活率最高,E组存活率最低,差异均有统计学意义(P凝胶机械强度提高,溶胀率增大,其中C组对细胞的粘附和增殖具有更显著的促进作用。因此,掺入等比例锶离子形成的复合凝胶为新型可注射骨组织工程支架提供理论基础。

关键词：藻酸盐凝胶锶细胞黏附细胞增殖组织工程