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藜芦22(R)-羟基胆固醇合成基因功能验证与酵母异源合成

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生物技术通报 2024年

作者：徐艳姣洪开云卢宜旺汪长清梁艳丽和四梅云南农业大学农学与生物技术学院云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室丘北长水实验中学

【目的】22(R)-羟基胆固醇是藜芦甾体生物碱合成的重要前体，通过异源表达验证藜芦（Veratrum nigrum）中胆固醇C-22位羟化酶的功能，并构建酵母底盘生产22(R)-羟基胆固醇，为藜芦甾体生物碱的生物合成途径解析奠定基础。【方法】基于... 详细信息

【目的】22(R)-羟基胆固醇是藜芦甾体生物碱合成的重要前体，通过异源表达验证藜芦（Veratrum nigrum）中胆固醇C-22位羟化酶的功能，并构建酵母底盘生产22(R)-羟基胆固醇，为藜芦甾体生物碱的生物合成途径解析奠定基础。【方法】基于藜芦转录组数据，从藜芦根中克隆3条全长的CYP90B亚家族基因序列，构建到酵母Y33表达载体，并转入胆固醇酵母底盘进行功能验证。通过高效液相色谱、液相色谱-质谱联用仪检测酵母摇瓶发酵产物，筛选到具有胆固醇C-22位羟化酶催化功能的酶VnCYP90B27-1，利用多片段组装、同源重组和醋酸锂转化等方法将VnCYP90B27-1整合到酵母染色体，构建22(R)-羟基胆固醇的酵母底盘。【结果】实时荧光定量PCR(RT-qPCR)显示，3条候选基因在根和叶中的表达与转录组表达趋势一致，VnCYP90B27-1在藜芦根中的表达量极显著高于叶。系统发育树结果表明，VnCYP90B27-1与加州藜芦的VcCYP90B27和藜芦的VnCYP90B27有较高的同源性，同属于CYP90B亚家族。此外，酵母异源表达结果表明，VnCYP90B27-1具有胆固醇C-22位羟化酶功能，并成功实现酿酒酵母异源合成22(R)-羟基胆固醇，摇瓶产量达5.37±0.37 mg/L。【结论】成功克隆并验证了藜芦22(R)-羟基胆固醇合成基因VnCYP90B27-1的功能，构建了22(R)-羟基胆固醇酵母底盘，证明在酿酒酵母中VnCYP90B27-1的催化活性比加州藜芦的VcCYP90B27高，为甾体生物碱异源合成提供基因资源。

关键词：藜芦 CYP90B27 功能验证 22(R)-羟基胆固醇酵母底盘

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藜芦的本草考证

中国野生植物资源 2024年第2期43卷 96-104页

作者：成子己徐丽莉上海中医药大学中西医结合学院上海201203 上海中医药大学科技人文研究院上海201203

结合历代医籍和近现代文献,对藜芦药材名称、基原、产地、品质评价等方面进行系统梳理与考证。历代本草记载的主流基原为百合科藜芦属植物藜芦(Veratrum nigrum L.)。藜芦别名众多,广泛分布于全国大部分地区,以根及根茎入药,以直径大、... 详细信息

结合历代医籍和近现代文献,对藜芦药材名称、基原、产地、品质评价等方面进行系统梳理与考证。历代本草记载的主流基原为百合科藜芦属植物藜芦(Veratrum nigrum L.)。藜芦别名众多,广泛分布于全国大部分地区,以根及根茎入药,以直径大、外皮土黄色、质清脆、断面粉为上乘。采收时间多为每年5~8月,净制后晒干。对于藜芦性味功效认识古今记载基本一致。本研究为藜芦药材的质量控制、临床应用及进一步开发利用提供本草文献依据。

关键词：藜芦本草考证基原产地品质评价毒性

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蒙药藜芦的化学成分及其细胞毒活性研究

内蒙古医科大学学报 2024年第2期46卷 140-144页

作者：薛晓聪康敏张屏程杰包保全内蒙古医科大学药学院内蒙古呼和浩特010059 包头医学院第一附属医院临床药学室内蒙古包头014000

目的研究蒙药藜芦(Veratrum nigrum L.)的化学成分及其细胞毒活性,为阐明蒙药藜芦的药效物质基础提供依据。方法采用硅胶柱色谱、反相制备高效液相等方法,对蒙药藜芦的醇提取物进行分离纯化,根据其理化性质及波谱技术(1D、2D-NMR、HR... 详细信息

目的研究蒙药藜芦(Veratrum nigrum L.)的化学成分及其细胞毒活性,为阐明蒙药藜芦的药效物质基础提供依据。方法采用硅胶柱色谱、反相制备高效液相等方法,对蒙药藜芦的醇提取物进行分离纯化,根据其理化性质及波谱技术(1D、2D-NMR、HRMS)对分离的化合物进行结构鉴定;采用CCK-8法测定单体化合物对3种癌细胞系,包括人乳腺癌细胞系(MCF-7)、人肺癌细胞系(A549)、人结直肠腺癌细胞系(HCT-15)的细胞毒活性。结果从藜芦的三氯甲烷及乙酸乙酯萃取层分离得到7种化合物,分别为:藜芦定(1)、1α,3β-dihydroxy-5α-jervanin-12-en-11-one(2)、贝母素甲(3)、贝母素乙(4)、西贝碱(5)、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(6)、异东莨菪素(7)。细胞毒活性检测结果表明化合物2对HCT-15细胞系有显著的细胞毒活性,化合物4对MCF-7细胞系有中等的细胞毒活性。结论化合物1首次从内蒙古产藜芦中分离得到,化合物3~6为藜芦属内首次分离得到,化合物2和化合物7首次从该种植物中分离得到;化合物2、4对MCF-7、HCT-15两种细胞系分别具有不同程度的细胞毒活性。

关键词：蒙药材藜芦化学成分细胞毒活性

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‘红森’藜芦扦插繁殖

中国花卉园艺 2024年第7期 52-55页

作者：田颂明翁贞洁邵凡涛许绍远不详

‘红森’藜芦(Leucothoe scarletta‘Hongsen’)是杜鹃花科木藜芦属常绿灌木,株高50厘米左右;萌小枝直立、红色、丛生状;单叶,互生,革质,叶表面有光泽,叶缘有锯齿,嫩叶红色,秋冬季所有叶片红色;总状花序,花白色,似铃兰;果,种子细小。

关键词：杜鹃花科丛生状藜芦扦插繁殖叶表面

UPLC-Q-TOF/MS分析不同比例丹参配伍藜芦毒性生物碱变化规律

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化学学报 2012年第21期70卷 2257-2264页

作者：李飞王宇光杨亮朱冠秀梁乾德马增春肖成荣谭洪玲汤响林高月中南大学湘雅医学院长沙570228 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

利用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术研究不同配伍比例的丹参藜芦的化学指纹图谱,并分析毒性生物碱在不同比例配伍混煎前后溶出量的变化.同时利用小鼠的急性毒性实验来考察配伍后的毒性变化规律.结果显示在正离子模式下,各配伍组(A... 详细信息

利用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术研究不同配伍比例的丹参藜芦的化学指纹图谱,并分析毒性生物碱在不同比例配伍混煎前后溶出量的变化.同时利用小鼠的急性毒性实验来考察配伍后的毒性变化规律.结果显示在正离子模式下,各配伍组(A～H)样本之间的差异能得到明显区分,并结合Loadings图谱和数据库确定了配伍化学指纹图谱中的17种藜芦生物碱毒性成分,当固定藜芦用量为LD50且藜芦比例大于丹参时,藜芦定、伪介芬胺等生物碱溶出高于或与藜芦单煎液相当,但随着丹参比例增加,上述生物碱溶出呈逐渐下降趋势,当丹参比例大于藜芦时,生物碱溶出低于藜芦单煎液.不同比例丹参藜芦配伍急性毒性实验毒性变化规律与上述生物碱含量的变化趋势吻合,表明上述毒性生物碱可能是藜芦与丹参特定比例配伍后毒性增强主要化学标志物.

关键词：十八反丹参藜芦急性毒性实验液质联用

藜芦人参配伍对大鼠肝功能及肝组织蛋白质表达的影响

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中国药理学与毒理学杂志 2013年第6期27卷 982-987页

作者：孙爱华王宇光孟浩吕永壮高月姜颖军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室北京102206 军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室北京100850

目的利用差异蛋白质组技术,探讨藜芦人参配伍对肝功能及蛋白质表达的影响。方法大鼠雌雄各半,ig给予藜芦0.27 g·kg-1、藜芦0.09 g·kg-1+人参0.24 g·kg-1、藜芦0.27 g·kg-1+人参0.71 g·kg-1、藜芦0.81 g·kg-1+人参2.13 g·kg-1,每... 详细信息

目的利用差异蛋白质组技术,探讨藜芦人参配伍对肝功能及蛋白质表达的影响。方法大鼠雌雄各半,ig给予藜芦0.27 g·kg-1、藜芦0.09 g·kg-1+人参0.24 g·kg-1、藜芦0.27 g·kg-1+人参0.71 g·kg-1、藜芦0.81 g·kg-1+人参2.13 g·kg-1,每天1次,连续8周。收集血清及肝组织。采用全自动生化仪测定谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)的水平,并对肝组织进行常规HE染色观察组织病理变化。通过差异凝胶电泳技术(DIGE)分离大鼠肝组织总蛋白,基质辅助激光解吸电离时间飞行串联质谱及数据库查询鉴定差异表达蛋白质。结果血生化指标检测结果表明,只有藜芦0.81 g·kg-1+人参2.13 g·kg-1检测到GOT没有升高的趋势;而GPT明显升高(P藜芦0.27 g·kg-1、藜芦0.09 g·kg-1+人参0.24 g·kg-1及藜芦0.27 g·kg-1+人参0.71 g·kg-1组大鼠肝组织无明显病理变化;藜芦0.81 g·kg-1+人参2.13 g·kg-1有2例(8.7%)样本分别出现肝窦扩张淤血及淋巴细胞浸润的病理改变。藜芦人参合用前后大鼠肝组织差异蛋白质经DIGE进行分离后,成功获得了分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱;经DeCyder6.5软件分析获得差异>1.5倍的蛋白质点共30个;质谱鉴定去冗余后得到4种差异蛋白质,其中二硫键异构酶A3前体和碳酸酐酶Ⅲ明显降低;谷氨酸脱氢酶1及氨甲酰磷酸合成酶1明显升高。结论藜芦0.81 g·kg-1和人参2.13 g·kg-1合用可能影响大鼠肝内与pH自稳、蛋白折叠及氨基酸代谢相关酶的表达。

关键词：藜芦人参肝串联质谱法蛋白质组

非靶向代谢组学用于藜芦妨害人参治疗脾气虚的机制研究

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分析化学 2016年第11期44卷 1755-1762页

作者：林贺皮子凤门丽慧陈维佳刘志强刘忠英长春中医药大学药学院吉林大学药学院中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心

采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)联用技术,通过非靶向代谢组学方法分析大鼠尿液内源性代谢物的变化,研究藜芦妨害人参发挥药效作用的机制。建立脾气虚大鼠模型,连续给药15天,测定力竭游泳时间及血液中白细胞... 详细信息

采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)联用技术,通过非靶向代谢组学方法分析大鼠尿液内源性代谢物的变化,研究藜芦妨害人参发挥药效作用的机制。建立脾气虚大鼠模型,连续给药15天,测定力竭游泳时间及血液中白细胞、红细胞、血红蛋白的含量。结果表明,人参可显著提高脾气虚模型大鼠的力竭游泳时间(p藜芦对脾气虚模型大鼠各项指标无明显影响(p>0.05),人参与藜芦配伍后对脾气虚模型大鼠各项指标均无显著影响(p>0.05),表明藜芦妨害了人参发挥药效作用。采用UPLC/Q-TOF-MS技术及非靶向代谢组学的方法分析了空白组、模型组、人参组、藜芦组、参藜组对脾气虚模型大鼠的尿液代谢组差异,其中主成分分析(PCA)得分图显示各组代谢轮廓有显著差别,并通过正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)及数据库检索,鉴定出15种人参干预调节脾气虚模型大鼠的潜在生物标志物,从中找出了7种人参藜芦配伍后减弱人参上述干预作用的潜在生物标志物,并对其涉及的代谢通路进行了系统分析。上述研究结果表明,人参藜芦配伍后妨害了人参对脾气虚模型大鼠的治疗作用,其机理可能是影响人参对体内能量代谢、免疫平衡及氧化还原反应等相关代谢的调节。

关键词：人参藜芦配伍禁忌脾气虚非靶向代谢组学

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藜芦bHLH转录因子分析鉴定

中草药 2022年第14期53卷 4476-4485页

作者：寇呈熹佟金泉马瑞孙伟薛哲勇麻鹏达东北林业大学东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室黑龙江哈尔滨150040 东北林业大学黑龙江省植物天然活性物质的合成与利用重点实验室黑龙江哈尔滨150040 西北农林科技大学生命科学学院甘肃杨凌712100 吉林省农业科学院生物技术研究所吉林省农业生物技术重点实验室吉林长春130033 中国中医科学院中药研究所中药鉴定与安全性评估北京市重点实验室北京100700

目的基于转录组数据,利用生物信息学方法鉴定藜芦Veratrum nigrum bHLH转录因子基因家族,并作初步分析。方法通过隐马可夫模型从藜芦转录组序列中筛选bHLH基因,并使用ExPASy、MEME等在线网站及MEGA、TBtools等软件对藜芦bHLH进行理化性... 详细信息

目的基于转录组数据,利用生物信息学方法鉴定藜芦Veratrum nigrum bHLH转录因子基因家族,并作初步分析。方法通过隐马可夫模型从藜芦转录组序列中筛选bHLH基因,并使用ExPASy、MEME等在线网站及MEGA、TBtools等软件对藜芦bHLH进行理化性质、保守基序等可视化分析。结果在藜芦转录组中共鉴定到72条bHLH转录因子,VnbHLH转录因子氨基酸数目为105~692,等电点介于4.69~11.47,相对分子质量为11071.2~77795.3,亚细胞定位分析显示VnbHLH均定位于细胞核中;系统发育分析将VnbHLH转录因子分为6个亚族,VnbHLH在不同组织中表达差异显著,Vn_54312、Vn_14037在根中表达较高,推测其可能参与了藜芦植物根部某些生物碱的合成。结论根据转录组数据分析了药用植物藜芦中的bHLH转录因子基因家族,有助于下一步对藜芦bHLH转录因子家族功能预测及验证。

关键词：藜芦转录组 bHLH转录因子系统进化基因表达

人参与藜芦配伍化学成分变化的HPLC-ESI-MS与ESI-MS研究

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化学学报 2007年第9期65卷 829-833页

作者：张旭宋凤瑞王隶书刘志强刘淑莹中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心长春中医药大学长春130117

采用电喷雾质谱(ESI-MS)和高效液相色谱与电喷雾质谱联用技术(HPLC-ESI-MS),对人参与藜芦配伍过程中人参皂苷和藜芦生物碱的变化规律进行了系统研究.在人参与藜芦配伍的共煎液中鉴定出八种人参皂苷,其中有六种人参皂苷含量有所降低,Rf和... 详细信息

采用电喷雾质谱(ESI-MS)和高效液相色谱与电喷雾质谱联用技术(HPLC-ESI-MS),对人参与藜芦配伍过程中人参皂苷和藜芦生物碱的变化规律进行了系统研究.在人参与藜芦配伍的共煎液中鉴定出八种人参皂苷,其中有六种人参皂苷含量有所降低,Rf和Rb2的含量基本不变;此外还鉴定出八种藜芦生物碱,其中有六种生物碱的含量随人参加入而明显增高.人参与藜芦配伍,煎煮液中人参皂苷的含量下降,藜芦总碱的含量上升.人参的加入有利于藜芦生物碱的溶出.因藜芦总碱的毒性较强,所以人参“反”藜芦具有一定道理.

关键词：人参人参皂苷藜芦生物碱配伍质谱液质联用